Cryopreservation of immature porcine oocytes by cryotop

T P CHÍ SINH H C 2013, 35(4): 516-521 ĐƠNG L NH TR NG L N NON B NG CRYOTOP Nguy n Văn H nh*, Nguy n Vi t Linh, Bùi Xuân Nguyên Vi n Công ngh Sinh h c, Vi n Hàn lâm KH & CN Vi t Nam, *nvhanh@ibt.ac.vn TÓM T T: Trong nghiên c u này, chúng tơi ti n hành nghiên c u đơng l nh tr ng l n giai đo n bóng m m b ng phương pháp s d ng cryotop, sau nuôi thành th c in vitro (IVM) T h p tr ng-t bào c n nỗn (COC) đư c thu t nang tr ng kích thư c 4-6 mm M t s tr ng ñư c c ñ nh ñ ñánh giá tr ng thái phát tri n trư c đơng l nh ho c ni thành th c in vitro (nhóm 1) Các tr ng cịn l i đư c x lí u ki n khác nhau: ni thành th c bình thư ng (nhóm 2); đánh giá đ c tính mơi trư ng đơng l nh (nhóm 3); đơng l nh b ng cryotop (nhóm 4); ly tâm trư c đơng l nh (nhóm 5) K t qu nhu m tr ng cho th y, t t c tr ng trư c x lí đ u giai đo n bóng m m T l TBCN tơi, t l tr ng có hình thái bình thư ng t l đ t đ n giai đo n gian kì nhóm nhóm (l n lư t 100%, 100%, 84% 100%, 100%, 82%) Trong đó, t l nhóm th p nhóm nhóm (l n lư t 79%, 68% 56%), l i cao nhóm (l n lư t 13%, 23%, 7%) Đánh giá tr ng thái tr ng s ng b ng phương pháp nhu m v i fluorescein diacetate (FDA) propidium iodide (PI) cho k t qu tương t! T nh"ng k t qu thu ñư c, có th nh n đ nh r ng cryotop có th đư c s d ng đ đơng l nh tr ng b o t#n l n non trư c nuôi thành th c tr ng không c n li tâm trư c đơng l nh T khóa: cryotop, đơng l nh, IVM, thành th c, tr ng l n M Đ U Tính nh y c m q trình đơng l nh c$a tr ng ph thu c vào loài [3] Tr ng l n ñư c ñánh giá có ñ ch ng ch u v i nhi t ñ th p tr ng lồi đ ng v t có vú khác C m tr ng có t bào c n nỗn giai đo n bóng m m (germinal vesicle-GV) khơng th ph c h#i sau h nhi t ñ xu ng 15oC ho c th p [4], ñ i v i tr ng bò, ngư%ng nhi t ñ d&n ñ n hi n tư ng không th ph c h#i ñ i v i tr ng xu ng ñ n 4oC [2] Nagashima et al (1994) [16], l n đ u tiên thơng báo k t qu nghiên c u v tương quan gi"a lipid n i bào v i đ nh y c$a q trình gi m nhi t đ quy trình đơng l nh phơi l n Các nghiên c u ch' r ng, lipid n i bào y u t quan tr ng c n thi t cho trình phát tri n giai đo n phơi s m, ñ c bi t quan tr ng ñ i v i phơi đơng l nh Nh"ng t n thương thư ng x y q trình đơng l nh s! phá v% c u trúc màng t bào sinh ch t [22], c u trúc b khung t bào [21], ti p ñ n quan bên c$a tr ng (ty th , m ng lư i n i ch t), c u trúc giúp t ng h p protein nhi(m s)c th [1] Ngồi ra, q trình gi m nhi t đ có th làm gãy vi ng gi m kh s ng c$a tr ng [6] Nghiên c u đơng l nh tr ng l n thành th c 516 b ng kĩ thu t đơng l nh nhanh s d ng c ng r ñã ñư c th!c hi n [20] Các tr ng l n ñông l nh giai ño n MII sau ñư c th tinh có th phát tri n ñ n giai ño n phôi nang v i t l cao t i 43% [18] Kĩ thu t đơng l nh s d ng cryotop ñ i g n đư c ch ng minh có nhi u ưu th so v i phương pháp đơng l nh trư c [18; 5] Liu et al (2008) [14] so sánh hi u qu đơng l nh tr ng l n thành th c c$a phương pháp s d ng cryotop v i phương pháp s d ng c ng r thông thư ng Tác gi ñã ch ng minh, ñông l nh b ng cryotop ñ t t l chia sau th tinh cao so v i đơng l nh b ng c ng thông thư ng [14] Đ i v i tr ng ngư i, đơng l nh b ng cryotop giúp nâng cao t l tr ng có hình thái bình thư ng sau gi i đơng (91% so v i 78% dùng c ng r ) [13] Nh"ng nghiên c u so sánh ñ i tư ng tr ng bò [11] tr ng chu t [7] ñ u cho k t qu tương t! Hi u qu c$a phương pháp đơng l nh b ng cryotop ñã kh,ng ñ nh nhi u ñ i tư ng, nhiên, chưa có cơng b v ñông l nh b ng cryotop l n, m t ñ i tư ng ñư c ñánh giá nh y c m v i kĩ thu t đơng l nh Vì lí đó, chúng tơi ti n hành nghiên c u s d ng cryotop ñông l nh tr ng l n nh m b sung nh"ng thơng tin cịn thi u v đ i tư ng Nguyen Van Hanh, Nguyen Viet Linh, Bui Xuan Nguyen V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U Đông l nh tr ng (vitrification) rã ñông Thu m u bu ng tr ng tr ng l n M&u bu#ng tr ng thu sau gia súc b gi t t i lò m , r a s ch b ng nư c mu i sinh lí ngâm vào dung d ch b o qu n m&u chu-n b s.n Tồn b m&u thu đư c đ t bình n nhi t 37oC, v n chuy n m&u v phịng thí nghi m vịng 1-2 gi Chúng tơi ti n hành thu nang có kích thư c 4-6 mm b ng cách r ch bu#ng tr ng Sau đó, bóc s ch l p ngồi c$a nang tr ng, chuy n vào môi trư ng TCM-199 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) có b sung 2,5 mg/mL HEPES (H-7523, Sigma), 2,47 mg/mL NaHEPES (H-8651, Sigma), 0,35 mg/mL NaHCO3 0,05 mg/mL kanamycin sulfate, ñ b c l nang tr ng thu tr ng Môi trư ng đơng l nh tr ng Dung d ch n n cho lo i dung d ch x lí đơng l nh tr ng TCM-199 có ch a 2.5 mg/mL HEPES (H-7523, Sigma), 2,47 mg/mL Na-HEPES (H-8651, Sigma), 0,35 mg/mL NaHCO3 0,05 mg/mL kanamycin sulfate Dung d ch cân b ng g#m M-199 b sung 2% (v:v) ethylene glycol (EG, Sigma), 2% (v:v) dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) 20% huy t bê (FCS, Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Nh t B n) Dung d ch vitrification bao g#m 15% (v:v) EG, 15% (v:v) DMSO 20% FCS dung d ch M-199 Dung d ch rã ñông bao g#m 20% FCS M199 ch a 0; 0,5 ho c M sucrose Dung d ch kh đ c sau đơng l nh g#m 20% FCS M199 có ch a 0; 0,25 ho c 0,5 M sucrose Thi t k thí nghi m M t s tr ng sau thu ñư c ti n hành tách TBCN c ñ nh ñ ñánh giá tr ng thái phát tri n c$a tr ng trư c đơng l nh (nhóm 1) Sau đó, tr ng đư c chia thành b n nhóm: nhóm (nhóm đ i ch ng) g#m tr ng sau thu đư c ti n hành ni thành th c in vitro khơng qua đơng l nh (IVM); nhóm (th nghi m đ đ c mơi trư ng đơng l nh): tr ng đư c x lí tr ng qua dung d ch đơng l nh rã đơng khơng đ t vào nitơ l/ng; nhóm 4: nhóm đơng l nh b ng cryotop nhóm 5: tr ng đư c li tâm 5.000 vịng/phút phút trư c ti n hành bư c nhóm T ng nhóm tr ng giai đo n bóng m m đư c cho vào mơi trư ng cân b ng vòng 15 phút nhi t đ phịng, sau chuy n tr ng sang mơi trư ng vitrification vịng phút Tr ng ñư c ñ t lên t m nh!a m/ng c$a cryotop (Kitazato Biopharma, Shizuoka, Nh t B n) cho th tích dung d ch nh t nhúng tr!c ti p vào nitơ l/ng (-196°C) Đ rã đơng tr ng, cryotop ñư c nhúng tr!c ti p vào dung d ch ñã làm m lên 38,5oC, chuy n tr ng sang dung d ch kh ñ c sau 30 giây R a l n qua ñĩa dung d ch r a ñư c ñ t nhi t đ phịng, gi" tr ng phút m0i n#ng đ dung d ch r a Ni thành th c tr ng in vitro Vi c nuôi thành th c tr ng ñư c th!c hi n d!a theo Kikuchi et al (2002) [12] T ng nhóm 40-50 COC đư c ni thành th c 500 1l mơi trư ng ni thành th c NCSU-37 có ch a 10% d ch nang tr ng l n, 0.6 mM cysteine, 50 µM β-mercaptoethanol, mM dibutyryl cAMP (dbcAMP), 10 IU/ml eCG 10 IU/ml hCG ñĩa nuôi t bào gi ng 24 gi Sau đó, COC đư c chuy n vào m t đĩa m i ch a mơi trư ng ni hồn tồn tương t!, ch' khác khơng có ch a dbcAMP hormone vòng 22 gi Vi c ni thành th c đư c th!c hi n t$ nuôi v i thành ph n khí 5% O2, nhi t đ 39°C v i ñ -m bão hòa Nhu m tr ng Tr ng sau đư c ni thành th c đư c lo i b/ t bào c n nỗn đ c ñ nh nh m ñánh giá m c ñ thành th c nhân hay nhu m b ng FDA PI ñ ñánh giá t l s ng Đ i v i tr ng nhu m eosine: tr ng ñư c g)n tr ng lam kính đ t vào c ñ nh dung d ch c ñ nh acid acetic:ethanol (1:1), sau hai ngày c ñ nh, r a lam kính nhu m b ng eosine 5% 15 phút Quan sát ñánh giá tr ng thành th c dư i kính hi n vi Olympus (Nh t b n) Đ i v i tr ng nhu m b ng FDA PI: sau tách s ch t bào c n noãn, chuy n tr ng vào mơi trư ng nhu m có FDA (3'6' fluorescein diacetate; Sigma, St Louis, MO, USA) n#ng ñ mcg/mL PI (Propidium iodide, Calbiochem, San Diego, CA) n#ng ñ mcg/mL Các t bào 517 T P CHÍ SINH H C 2013, 35(4): 516-521 tr ng ñư c ñ t gi t ch a thu c nhu m vòng phút, r a s ch hai l n b ng dung d ch PBS sau ki m tra b ng kính hi n vi huỳnh quang (Nikon, eclipse 80i, Nh t B n) Phân tích th ng kê K t q$a v so sánh giá tr trung bình c$a phương pháp đư c x lí b ng ANOVA, m i tương quan ñư c x lí b ng excel K T QU VÀ TH O LU N K t qu hình thái tr ng sau ni in vitro đư c trình bày b ng T l tr ng s ng phát tri n nhóm tương t! nhóm cho th y, sau bư c x lí qua lo i mơi trư ng c$a quy trình ñông l nh gi i ñông không nh hư ng đ n tr ng q trình ni in vitro M c dù tr ng b bi n d ng c u trúc t bào ch t tác ñ ng c$a li tâm (hình 1a), hay ñ i hình d ng tác đ ng c$a hóa ch t (hình 1b), sau đơng l nh gi i đơng c u trúc tr ng l i tr v tr ng thái bình thư ng (hình 1c) có t bào bơng tơi lơ đ i ch ng (hình 1d) Trong đó, t l tr ng có t bào c n nỗn bơng tơi hình thái tr ng bình thư ng phát tri n th p nhóm qua nitơ l/ng (46% 38%) Đ i v i nhóm tr ng có li tâm, ch t lư ng tr ng sau nuôi c y in vitro ñ t t l th p nh t c v hình thái tr ng t bào cumulus tơi (23% 13%) K t qu đư c gi i thích r ng tác đ ng c$a li tâm ñã làm nh hư ng t i c u trúc nhân c$a tr ng trư c ch u tác ñ ng c$a ch t b o qu n l nh ñ i v i tr ng l n l n [9] Trong nghiên c u này, k t qu t bào c n nỗn bơng tơi sau x lí ni in vitro tương t! v i công b c$a Huang et al (2002) [10] K t qu t bào c n nỗn cịn g)n k t tr ng sau đơng l nh ch' s quan tr ng, b i t bào c n nỗn đóng vai trị quan tr ng vi c thúc ñ-y s! trư ng thành c$a t bào ch t trình thành th c c$a tr ng l n [15] Vai trò c$a t bào c n nỗn ni in vitro đư c kh,ng đ nh so sánh gi"a nhóm có khơng có lo i t bào [19] B ng K t qu nuôi tr ng in vitro sau đơng l nh Nhóm thí nghi m S tr ng thí nghi m 300 290 290 320 Tr ng có cumulus bơng tơi: n (%) 300 (100)a 290 (100)a 165 (79)b 41 (13)c Tr ng có hình thái bình thư ng: n (%) 300 (100)a 290 (100)a 197 (68)b 73 (23)c T l tr ng s ng (%) 100a 100a 62b 18c Thí nghi m ñư c l p l i l n Trong c t, s li u v i ch" thích khác sai khác v i có ý nghĩa th ng kê (P < 0,05) A B C D Hình K t qu x lí ni thành th c tr ng A Tr ng sau li tâm; B Tr ng m t nư c q trình x lí kh nư c; C Hình thái tr ng ph c h#i sau ñông l nh; D Tr ng sau nuôi in vitro v i t bào tơi K t qu ni thành th c tr ng in vitro đư c trình bày b ng cho th y, t l tr ng thành th c nhân (MII) khơng có s! sai khác nhóm nhóm K t qu cho th y, 518 vi c x lí v i mơi trư ng đơng l nh ñã không tác ñ ng ñ n ch t lư ng tr ng T l tr ng thành th c th p nhóm (nhóm có đơng l nh ñ y ñ$; 56%) th p nh t Nguyen Van Hanh, Nguyen Viet Linh, Bui Xuan Nguyen nhóm (nhóm có li tâm đơng l nh ñ y ñ$; 7%) (p < 0,05) T l thành th c (ñ t t i tr ng thái MII sau hai ngày ni thành th c) sau đơng l nh nghiên c u (nhóm 4; 56%) kh quan, tương t! v i k t qu c$a Gupta et al (2007) [8] Nakagawa et al (2008) [17] (51% 53%) cao so v i thơng báo trư c c$a Hara et al (2005) [9] Huang et al (2002) [10] (7,0% 20,6%) Tuy v y, t l v&n th p so v i t l thành th c c$a tr ng sau đơng l nh nhanh b m t c ng nghiên c u c$a Somfai et al (2010) [19] (77,6%) K t qu nhu m cho hình nh rõ nét v tr ng thái c$a tr ng sau nuôi in vitro, v i giai ño n thành th c ñư c th hi n rõ hình 2a, nh"ng tr ng s ng b)t màu xanh (hình 2b) tr ng ch t có b)t màu rõ nhân sáng màu đ/ (hình 2c) B ng K t qu tr ng sau sau c đ nh nhu Nhóm thí S tr ng nghi m GV (%) 180 180 156 162 162 156 22 (14) m nhân Tr ng thái thành tr ng MI (%) MII (%) 0 25 (16)a 131 (84)a 29 (18)a 133 (82)a b 18 (11) 91 (56)b 22 (14)c 11 (7)c Phân h$y (%) 0 53 (33) 101 (65) Thí nghi m đư c l p l i l n Trong c t, s li u v i ch" thích khác sai khác v i có ý nghĩa th ng kê (P < 0,05) A B C Hình K t qu nhu m tr ng sau ni thành th c A Tr ng c đ nh nhu m b ng eosine; B Tr ng nhu m b ng FDA (tr ng sáng xanh ch' th cho tr ng s ng); C tr ng nhu m v i FI (có nhân b)t màu đ/ ch' th cho tr ng ch t) K T LU N Tr ng l n sau đơng l nh nhanh b ng cryotop có t l s ng đ t 100% ñ t t l thành th c (56%) sau nuôi in vitro Các nghiên c u th tinh ng nghi m phát tri n phôi in vitro ñ i tư ng c n ph i ñư c th!c hi n ñ kh,ng ñ nh hi u qu c$a phương pháp đơng l nh nhanh b ng cryotop Nghiên c u s cho vi c phát tri n ng d ng kĩ thu t l"u tr" tr ng chưa thành th c b ng kĩ thu t đơng l nh nhanh lĩnh v!c b o t#n ña d ng sinh h c ex-situ y sinh h c lâm sàng tương lai L i c m ơn: Nghiên c u ñư c th!c hi n v i s! h0 kinh phí t đ tài c p s , mã s CSK 1203 Nhóm nghiên c u c m ơn Phịng thí nghi m tr ng m, Vi n Công ngh Sinh h c, Vi n Hàn lâm KH& CN Vi t Nam ñã cho phép s d ng kính hi n vi huỳnh quang ph c v cho ñ tài TÀI LI U THAM KH O Al-Fageeh M B., Marchant R J., Carden M J., Smales C M., 2006 The cold-shock response in cultured mammalian cells: harnessing the response for the improvement of recombinant protein production Biotechnol Bioeng., 93: 829-835 Arav A., Zeron Y., Leslie S B., Behboodi E., Anderson G B., Crowe J H., 1996 519 T P CHÍ SINH H C 2013, 35(4): 516-521 Phase transition temperature and chilling sensitivity of bovine oocytes Cryobiology, 33: 589-599 Bou G., Liu L Q., Zheng Z., Tian J T., Kong Q R., Song J., Wang X D., Liu Z H., 2009 Effect of chilling on porcine germinal vesicle stage oocytes at the subcellular level Cryobiology, 59(1): 54-58 Didion B A., Pomp D., Martin M J., Homanics G E., Markert C L., 1990 Observations on the cooling and cryopreservation of pig oocytes at the germinal vesicle stage J Anim Sci., 68(9): 2803-2810 Fernández-Reyez F., Ducolomb Y., Romo S., Casas E., Salazar Z., Betancourt M., 2012 Viability, maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices Cryobiology, 64(3): 261-266 Galeati G., Spinaci M., Vallorani C., Bucci D., Porcu E., Tamanini C., 2011 Pig oocyte vitrification by cryotop method: Effects on viability, spindle and chromosome configuration and in vitro fertilization Anim Reprod Sci., 127(1-2): 43-49 Graves-Herring J E., Boone W R., 2009 Blastocyst rate and live births from vitrification and slow-cooled two-cell mouse embryos Fert Ster., 91(3): 920-924 Gupta M K., Uhm S J., Lee H T., 2007 Cryopreservation of immature and in vitro matured porcine oocytes by solid surface vitrification Theriogenology, 67(2): 238248 Hara K., Abe Y., Kumada N., Aono N., Kobayashi J., Matsumoto H., 2005 Extrusion and removal of lipid from the cytoplasm of porcine oocytes at the germinal vesicle stage: centrifugation under hypertonic conditions influences vitrification Cryobiology, 50(2): 216-222 10 Huang W T., Holtz W., 2002 Effects of Meiotic Stages, Cryoprotectants, Cooling and Vitrification on the Cryopreservation of Porcine Oocytes Asian-Aust J Anim Sci., 15(4): 485-493 520 11 Inaba Y., Aikawa Y., Hirai T., Hashiyada Y., Yamanouchi T., Misumi K., Ohtake M., Somfai T., Kobayashi S., Saito N., Matoba S., Konishi K., Imai K., 2011 In-straw cryoprotectant dilution for bovine embryos vitrified using Cryotop J Reprod Dev., 57(4): 437-443 12 Kikuchi K., Onishi A., Kashiwazaki N., Iwamoto M., Noguchi J., Kaneko H., Akita T., Nagai T., 2002 Successful piglet production after transfer of blastocysts produced by a modified in vitro system Biol Reprod., 66(4): 1033-1041 13 Kuwayama M., 2005 Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes RBMOnline, 11(3): 300308 14 Liu Y., Du Y., Lin L., Li J., Kragh P M., Kuwayama M., Bolund L., Yang H., Vajta G., 2008 Comparison of efficiency of open pulled straw (OPS) and Cryo-top vitrification for cryopreservation of in vitro matured pig oocytes Cryo Letters, 29(4): 315-320 15 Maedomari N., Kikuchi K., Ozawa M., Noguchi J., Kaneko H., Ohnuma K., 2007 Cytoplasmic glutathione regulated by cumulus cells during porcine oocyte maturation affects fertilization and embryonic development in vitro Theriogenology, 67(5): 983-993 16 Nagashima H., Kashiwazaki N., Ashman R J., Grupen C G., Seamark R F., Nottle M B., 1994 Removal of cytoplasmic lipid enhances the tolerance of porcine embryos to chilling, Biol Reprod., 51(4): 618-622 17 Nakagawa S., Yoneda A., Hayakawa K., Watanabe T., 2008 Improve-ment in the in vitro maturation rate of porcine oocytes vitrified at the germinal vesicle stage by treatment with a mitochondrial permeability transition inhibitor Cryobiology, 57(3): 269-275 18 Ogawa B., Ueno S., Nakayama N., 2010 Developmental ability of porcine in vitro matured oocytes at the meiosis II stage after vitrification J Reprod Dev., 56(3): 356361 Nguyen Van Hanh, Nguyen Viet Linh, Bui Xuan Nguyen 19 Somfai T., Noguchi J., Kaneko H., Nakai M., Ozawa M., Kashiwazaki N., Egerszegi I., Ratky J., Nagai T., Kikuchi K., 2010, Production of good-quality porcine blastocysts by in vitro fertilization of follicular oocytes vitrified at the germinal vesicle stage Theriogenology, 73(2): 147156 20 Wu H., Rui R., Dai J., Zhang C., Ju S., Xie B., Lu B., and Zheng X., 2006 Effects of Cryopreservation on the Developmental Competence, Ultrastructure and Cytoskeletal Structure of Porcine Oocytes Mol Reprod Devlop., 73(11): 1454-1462 21 Zenzes M T., Bielecki R., Casper R F., Leibo S P., 2001 Effects of chilling to degrees C on the morphology of meiotic spindles in human metaphase II oocytes, Fertil Steril., 75(4): 769-777 22 Zeron Y., Ocheretny A., Kedar O., Borochov A., Sklan D., Arav A., 2001 Seasonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles Reproduction, 121(3): 447-445 CRYOPRESERVATION OF IMMATURE PORCINE OOCYTES BY CRYOTOP Nguyen Van Hanh, Nguyen Viet Linh, Bui Xuan Nguyen Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY In our paper, porcine oocytes at GV stage were vitrified in cryotops, thawed, and subsequently in vitro matured Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from follicles of 4-6 mm in diameter Some of them were fixed right after collection to evaluate development status before vitrication and/or IVM (group 1) The others were subjected to: normal IVM (group 2); treatment with vitrification media-(group 3); vitrified by cryotops (group 4); centrifugation before vitrified by cryotops (group 5) The results showed that all oocytes in group were at the GV stage The percentages of cumulus expansion, oocytes showing normal morphology, and MII oocytes in groups and showed no significant difference (100, 100 and 84% vs 100, 100 and 82%, respectively) Those of group were lower (79%, 68% and 57%, respectively) Group had lowest rates (13%, 23% and 7%, respectively) Similar results of were obtained when oocytes of groups were treated with fluorescein diacetate (FDA) propidium iodide (PI) for live/dead cell evalutation These results indicate that vitrification by cryotops can be an effective method for cryopreservation of immature oocytes in pigs before IVM and centrifugation is not needed for successful vitrification Keywords: cryotop, cryopresevation, IVM, maturation, porcine oocytes Ngày nh n bài: 11-12-2012 521 ... developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles Reproduction, 121(3): 447-445 CRYOPRESERVATION OF IMMATURE PORCINE OOCYTES BY CRYOTOP Nguyen Van Hanh,... vitrified by cryotops (group 4); centrifugation before vitrified by cryotops (group 5) The results showed that all oocytes in group were at the GV stage The percentages of cumulus expansion, oocytes. .. method for cryopreservation of immature oocytes in pigs before IVM and centrifugation is not needed for successful vitrification Keywords: cryotop, cryopresevation, IVM, maturation, porcine oocytes