Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thử nghiệm phương pháp khử tế bào hiệu quả đối với động mạch cảnh lợn và thử nghiệm đánh giá tăng sinh tế bào hADSC trên ống ghép mạch máu vô bào. Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Phan Thị Nhàn*; Bùi Quốc Thắng**; Phạm Thọ Tuấn Anh** Trần Lê Bảo Hà*; Trần Công Toại***; Lê Quang Trí**** TĨM TẮT Đặt vấn đề: khử tế bào mạch máu phương pháp loại bỏ hoàn toàn thành phần tế bào mạch máu để tạo ống ghép mạch máu có chất protein tự nhiên mạch máu Sau khử tế bào, ống ghép mạch máu có cấu trúc, thành phần tương tự mơ tự nhiên, số lượng mẫu lớn, gây đáp ứng miễn dịch Hướng nghiên cứu phát triển giới chưa phát triển Việt Nam Phương pháp: sử dụng động mạch cảnh lợn để khử tế bào Động mạch cảnh sau thu nhận xử lý SDS 0,5%, triton X100 0,1%, nước cất đánh giá phương pháp nhuộm HE Trichrome Đánh giá độc tính mạch máu vơ bào in vitro theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 Đánh giá tăng sinh tế bào gốc từ mơ mỡ lòng mạch máu vơ bào phương pháp MTT Kết quả: phương pháp kết hợp SDS 0,5% 24 nước cất 24 đ khử hoàn toàn tế bào bảo tồn tốt khung ngoại bào Đồng thời, mạch máu vô bào không gây độc tế bào nguyên bào sợi in vitro giúp cho tế bào gốc từ mô mỡ người phát triển từ ngày tới ngày Kết luận: tạo thành công ống ghép mạch máu từ động mạch cảnh lợn * Từ khóa: Khử tế bào mạch máu; Ống ghép động mạch cảnh Fabricating Vascular Grafts by Combination of Decellularization Porcine Cartoid Arteries and Human Adipose Derived Cells Summary Introduction: Decellularization of blood vessels is a method removing all cells in blood vessels to obtain vascular grafts containing native proteins of vessels After decellularizing, acellular vascular grafts have structure, components similar to native vessels, could be produced largely and evoke less immune response Methods: Porcine carotid arteries were treated with SDS 0.5% in 24 hours or Triton X100 0.1% in 24 hours or distilled water in 24 hours Decellularization efficiency was tested by HE and Trichrome staining Cytotoxicity test was conducted according to ISO 10993-5 Proliferation of hADSC was measured by MTT assay Results: Combination of SDS 0.5% for 24 hours and distilled water for 24 hours is the best effective decellularization removing total cells and reserving a large amount of extracellular matrix Moreover, acellular carotid grafts aren’t poisonous for fibroblast in vitro and could support cell growth Conclusion: Acellular carotid arterial grafts were generated successfully * Keywords: Decellularization of blood vessel; Acellular carotid arterial graft * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM ** Bệnh viện Chợ Rẫy *** Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch **** Bệnh viện Quân y 7A Người phản hồi (Corresponding): Tô Minh Quân (tomquan@hcmus.edu.vn) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 26/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Mỗi năm có > 600.000 ca bắc cầu động mạch thực Mỹ, gần tương đương 196 với can thiệp mạch máu [1, 3] Hiện nay, mạch máu tự thân tiêu chuẩn vàng bắc cầu động mạch Tuy nhiên, 1/3 số bệnh nhân (BN) mạch máu TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 với chất lượng phù hợp Các loại vật liệu ghép thị trường Dacron, PTFE không phù hợp mạch máu đường kính nhỏ (đường kính < mm) động mạch vành [6] Khử tế bào phương pháp Mô, quan cấu tạo thành phần: tế bào khung ngoại bào (extracellular matrix - ECM) Tế bào đơn vị cấu trúc chức mơ Trong q trình sống, tế bào tiết bên tế bào phân tử ngoại bào protein, polysaccharide, proteoglycan… Những phân tử tạo thành khung ngoại bào (ECM) [4] Phương pháp khử tế bào nhằm loại thành phần tế bào bên mô, quan giữ lại ECM ECM mô, quan mảnh ghép tốt mơ, quan [11] Ống ghép mạch máu tạo phương pháp khử tế bào có cấu trúc, hình dạng tương tự mạch máu tự thân, số lượng lớn có khả gây đáp ứng miễn dịch [7] Tế bào gốc từ mô mỡ (hADSC) nguồn tế bào tự thân quan tâm nhiều Một số nghiên cứu cho hADSC có khả biệt hóa thành dòng tế bào quan trọng mạch máu tế bào nội mô tế bào trơn [5] Đặc biệt, thiếu tế bào nội mô làm cho ống ghép mạch máu bị đơng máu lòng mạch, điều ảnh hưởng tới tính mạng BN Tế bào hADSC khắc phục nhược điểm lớn dòng tế bào trên, hADSC có khả thu nhận tự thân dễ dàng với số lượng lớn Hiện nay, Việt Nam, nghiên cứu khử tế bào mạch máu để thu nhận ống ghép mạch máu chưa phát triển Mục tiêu nghiên cứu: Thử nghiệm phương pháp khử tế bào hiệu động mạch cảnh lợn thử nghiệm đánh giá tăng sinh tế bào hADSC ống ghép mạch máu vô bào ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Động mạch cảnh lợn tế bào gốc từ mô mỡ người (hADSC) (Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch cung cấp) Phương pháp nghiên cứu Theo phương pháp thực nghiệm miêu tả * Phương pháp khử tế bào: Vận chuyển mạch máu phòng thí nghiệm dung dịch PBS 40C, sau tách bỏ lớp cơ, mỡ xung quanh điều kiện vô trùng Xử lý mạch máu với hóa chất để khử tế bào: nước cất 24 SDS 0,5% 24 triton X100 0,1% 24 Đánh giá hiệu khử tế bào phương pháp nhuộm heamatoxylin/eosin (HE) Trichrome * Phương pháp đánh giá độc mạch máu vơ bào: Đánh giá độc tính tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 Ống ghép mạch máu cắt thành mảnh 0,3 x 0,3 cm Cấy nguyên bào sợi lên đĩa giếng với nồng độ x 104 tế bào/giếng Sau ngày, đặt mảnh ống ghép lên lớp tế bào đĩa (1 mảnh/giếng tế bào) Sau ngày, loại bỏ mảnh ống ghép, tiến hành quan sát hình dạng tế bào đĩa thực phương pháp MTT đĩa thí nghiệm đĩa đối chứng (đĩa tế bào không đặt mảnh ống ghép) 198 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Phương pháp đánh giá tăng trưởng tế bào hADSC lòng mạch máu vô bào: cấy tế bào) mảnh ống ghép đối chứng (mảnh không cấy tế bào) Cắt mạch máu khử tế bào thành đoạn 0,4 x 0,4 cm2 Thu nhận tế bào hADSC hệ P4, chỉnh mật độ x 105 tế bào/ml cấy lên bề mặt lòng mảnh ghép với thể tích 10 µl/mảnh Đánh giá tăng sinh tế bào phương pháp MTT qua mốc thời gian 1, 3, 5, 7, 9, 11 ngày Mỗi ngày tiến hành đánh giá MTT với mảnh ống ghép thí nghiệm (mảnh Quy trình MTT: thay mơi trường giếng, bổ sung MTT mg/ml vào môi trường nuôi, ủ 37oC giờ, sau hút bỏ mơi trường cũ, thêm vào DMSO (thể thích tương đương với mơi trường ni) để hòa tan tinh thể tiến hành đo OD bước sóng 595 nm Đánh giá bám dính tế bào kính hiển vi điện tử quét (SEM) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết khử tế bào động mạch Hình 1: Động mạch lợn sau xử lý A B Hình 2: Kết nhuộm mơ học mạch máu tự nhiên (x100) (A: Nhuộm HE; B: Nhuộm trichrome) 199 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 A B C D Hình 3: Kết nhuộm mơ học HE mạch máu xử lý với chất tẩy tế bào (x100) (A: Nước cất 24 giờ; B: Tritonx100 0,1% 24 giờ; C: SDS 0,5% 24 giờ; D: SDS 0,5% 24 nước cất 24 giờ) A C B Ph ân lập nu ôi cấ y D tă ng a sin h Hình 4: Kết nhuộm mơ học Trichrome mạch máu xử lý với chất tẩy tế bào (x100) (A: Nước cất 24 giờ; B: Tritonx100 0,1% 24 giờ; C: SDS 0,5% 24 giờ; D: SDS 0,5% 24 nước cất 24 giờ) 199 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bảng 1: Tóm tắt hiệu khử tế bào bảo tồn collagen phương pháp khác Tác nhân khử tế bào Hiệu khử tế bào Hiệu bảo tồn collagen Nước cất lần + ++++ Triton x100 + ++++ SDS ++++ +++ SDS kết hợp với nước cất lần +++++ +++ (+: - 20%; ++: 20 - 40%; +++: 40 - 60%; ++++: 60 - 80%; +++++: 80 - 100%) Động mạch thu có kích thước trung bình cm Sau khử tế bào, động mạch có màu trắng, trì hình dạng kích thước ban đầu (hình 1) Kết nhuộm HE cho thấy mạch máu sau xử lý trì cấu trúc ba lớp mạch đối chứng (hình 2, 3) Kết nhuộm Trichrome cho thấy mạch máu sau xử lý trì protein collagen lớp tế bào (hình 2, 4) Tuy nhiên, kết nhuộm HE Tricrhome cho thấy hiệu khử tế bào trì collagen tác nhân khác không giống (bảng 1) SDS 0,5% 24 phương pháp khử tế bào hiệu phương pháp biến tính collagen mạnh Nước cất 24 phương pháp giữ collagen tốt phương pháp khử tế bào Khi kết hợp phương pháp lại với (SDS 24 nước cất 24 giờ) có phương pháp khử tế bào hiệu nhất: tế bào loại bỏ hoàn toàn collagen bảo tồn tốt Kết đánh giá độc tính tế bào Hình 5: Kết thử nghiệm độc tính tế bào mạch máu vơ bào (x40) 200 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Độc tính tế bào đánh giá phương pháp ISO 10993-5 theo cách trực tiếp Mảnh mạch máu vô bào đặt trực tiếp lên tế bào nguyên bào sợi Sau ngày, kết quan sát mắt thường cho thấy tế bào bên giá thể co tròn bong ra, chứng tỏ giá thể không độc với nguyên bào sợi Kết MTT cho thấy hiệu gây độc tế bào mạch máu vô bào thấp Giá trị OD nhóm thí nghiệm (TN) 0,23 ± 0,015, nhóm đối chứng 0,26 ± 0,002 Tỷ lệ TNĐC khoảng 88%, cấp độ độc tính: khơng độc Kết nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc từ mô mỡ ngƣời mạch máu vơ bào Hình 6: Kết chụp SEM mạch máu vô bào cấy với tế bào từ mô mỡ người Tế bào gốc từ mô mỡ người cấy vào lòng mạch máu vơ bào với mật độ x 103 tế bào/mảnh ống ghép Kết đánh giá tăng sinh tế bào MTT cho thấy giá trị OD dung dịch tăng sinh từ ngày tới ngày 7, sau trì cân Kết cho thấy tế bào tăng sinh từ ngày tới ngày 7, sau trì ổn định Kết chụp SEM cho thấy tế bào bám dính vào bề mặt lòng mảnh ống ghép Biểu đồ 1: Đồ thị biểu diễn tăng sinh tế bào từ mô mỡ người mạch máu vô bào đánh giá phương pháp MTT 201 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BÀN LUẬN Theo thống kê Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ (2017), bệnh tim mạch dẫn tới 1/3 số ca tử vong người Mỹ Bệnh động mạch vành chiếm khoảng 45% số ca tử vong nói Ngun nhân bệnh tim mạch tượng xơ vữa mạch máu Hai phương pháp thường sử dụng can thiệp mạch máu bắc cầu động mạch Trong đó, bắc cầu hay sử dụng trường hợp bệnh nặng, nhiều nhánh thất bại bắc cầu mạch máu [1, 3] Mạch máu tự thân tiêu chuẩn vàng ghép mạch máu Tuy nhiên, nhiều BN mạch máu tự thân có chất lượng phù hợp BN phải trải qua thêm phẫu thuật Mạch đồng loại, đặc biệt mạch máu dị loại có số lượng lớn, cấu trúc phù hợp với mạch máu cần thay Nhược điểm lớn loại mạch máu phản ứng thải loại miễn dịch Phương pháp khử tế bào xuất để giải nhược điểm Mô cấu tạo tế bào ECM Trong thành phần trên, tế bào thành phần miễn dịch mơ q trình loại bỏ tế bào dẫn tới suy giảm tính kích thích miễn dịch hiệu ghép tăng cao [8] Hiện nay, nhiều phương pháp khử tế bào sử dụng khắp giới Phương pháp khử tế bào chia thành nhóm sau: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp protein Mỗi phương pháp có hiệu định khử tế bào bảo tồn protein khung 202 Đồng thời, hiệu phương pháp phụ thuộc vào chất mô, quan [7] Phương pháp khử tế bào hiệu khử hoàn toàn tế bào bên mơ trì lớp protein Nước cất dung dịch nhược trương thường sử dụng khử tế bào Phân tử nước di chuyển vào bên tế bào làm tế bào vỡ Hiệu khử tế bào nước cất không cao Tuy nhiên, hay sử dụng để làm chất hỗ trợ trình khử tế bào Triton X100 chất tẩy khơng ion hóa Hiệu khử tế bào triton x100 tốt so với nước, nhiên, triton x100 gây ảnh hưởng tới ECM bên SDS chất tẩy có tính ion Hiệu khử tế bào SDS cao, có khả gây biến tính ECM cao [10] Kết thực nghiệm cho thấy SDS 0,5% 24 phương pháp tốt để khử tế bào Tuy nhiên, phương pháp chưa loại bỏ hoàn toàn tế bào bên mạch máu Để gia tăng hiệu khử tế bào, SDS 0,5% 24 sử dụng kết hợp với nước cất lần 24 Kết cho thấy hiệu khử tế bào gia tăng, khử hoàn toàn tế bào mạch máu bảo toàn tốt ECM Để ứng dụng rộng rãi, mạch máu vơ bào cần kiểm tra khả gây độc tế bào hỗ trợ tế bào tăng sinh Hai tiêu chuẩn yêu cầu bắt buộc ống ghép mạch máu nhằm tạo mạch máu có chức tái cấu trúc thể Dựa vào kết thử nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-5, kết định tính (quan sát hình dạng tế bào) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 định lượng (đánh giá phương pháp MTT) cho thấy mạch máu vô bào không gây độc tới tế bào (tất cấp không gây độc) Đồng thời, tế bào hADSC cấy lên lòng ống ghép mạch máu vơ bào Hai thành phần tế bào quan trọng mạch máu tế bào trơn tế bào nội mô [5] Tế bào trơn thành phần tế bào chủ yếu lớp mạch máu Tế bào trơn xếp thành vòng tròn đồng tâm chịu trách nhiệm co bóp nhằm dẫn truyền dòng máu Tế bào nội mô tạo thành lớp chống đông máu lòng mạch Do đó, tế bào nội mơ tế bào trơn đóng vai trò định hình thành ống ghép mạch máu chức Đặc biệt, thiếu tế bào nội mô làm cho ống ghép mạch máu bị đơng máu lòng mạch, ảnh hưởng tới tính mạng BN [9] Tuy nhiên, nguồn tế bào trơn tế bào nội mô tự thân Do đó, hướng nghiên cứu biệt hóa dòng tế bào tự thân thành tế bào trơn tế bào tiền thân nội mô Một dòng tế bào quan tâm nhiều tế bào gốc từ mô mỡ người (hADSC) Các tế bào thu nhận từ mỡ tự thân chứng minh có khả biệt hóa thành tế bào nội mơ tế bào trơn [12] Ngồi ra, nghiên cứu cho thấy tế bào hADSC có khả kêu gọi tế bào nội mô từ mô xung quanh ghép vào thể [2] Kết đánh giá phương pháp MTT SEM cho thấy cấy hADSC lên ống ghép mạch máu vô bào, tế bào hADSC tăng trưởng gấp lần sau ngày nuôi cấy Như vậy, ống ghép mạch máu vơ bào hồn tồn phù hợp cho tế bào tăng sinh phát triển Việc nghiên cứu để tạo thành mạch máu kỹ nghệ hóa thách thức tồn giới Q trình cần nhiều yếu tố: khung mạch máu, tế bào, nhân tố trăng trưởng, nuôi cấy động [6] Để hướng tới ứng dụng xa hơn, cần đánh giá độc tính tương hợp in vivo thể động vật, người biệt hóa tế bào hADSC thành tế bào trơn nội mô…, cấy nuôi tế bào lòng mạch với thời gian dài để tái tạo cấu trúc tương tự mô tự nhiên… Nghiên cứu bước đầu trình tạo ống ghép mạch máu phù hợp cho BN Kết ban đầu cho thấy ống ghép mạch máu vơ bào có khả ứng dụng lĩnh vực kỹ nghệ mạch máu: cấu trúc, hình dạng, thành phần tương tự mạch máu tự nhiên, hỗ trợ tốt cho tế bào tăng sinh, quy trình xử lý đơn giản, rẻ tiền, số lượng mẫu nhiều KẾT LUẬN Tạo thành công ống ghép mạch máu phương pháp khử tế bào động mạch cảnh lợn LỜI CẢM ƠN Đề tài thực từ Chương trình Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ Trẻ quản lý Trung tâm Phát triển Khoa học Cơng nghệ Trẻ, Thành đồn Thành phố Hồ Chí Minh, theo hợp đồng số “09/2017/HĐ-KHCN-VƯ” Thạc sỹ Tô Minh Quân làm chủ nhiệm đề tài 203 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alexander J.H et al Coronary-Artery Bypass Grafting 2016, 374, pp.1954-1964 Bajpai V.K et al Stem cell sources for vascular tissue engineering and regeneration 2012, 18, pp 405-425 Benjamin E.J et al Heart disease and stroke statistics-2017 Update: A report from the American Heart Association 2017, 135, e146-e603 Bonnans Caroline et al Remodelling the extracellular matrix in development and disease 2014, 15, pp.786-801 Catto Valentina et al Vascular tissue engineering: Recent Advances in Small Diameter Blood Vessel Regeneration 2014, pp.1-27 Chang William G et al A short discourse on vascular tissue engineering 2017, 204 Crapo P.M et al An overview of tissue and whole organ decellularization processes 2011, 32, pp.3233-3243 Dahl Shannon L.M et al Decellularized Native and Engineered Arterial Scaffold for Transplantation 2003, 12, pp.659-666 Geenen I.L et al Endothelial cells (ECs) for vascular tissue engineering: venous ECs are less thrombogenic than arterial ECs 2015, 9, pp.564-576 10 Gilpin A et al Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications 2017, 9831534 11 Hoshiba T Cultured cell-derived decellularized matrices: a review towards the next decade 2017, 5, pp.4322-4331 12 Huang N.F et al Mesenchymal stem cells for vascular regeneration 2008, 3, pp.877-892 ... HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alexander J.H et al Coronary-Artery Bypass Grafting 2016, 374, pp.1954-1964 Bajpai V.K et al Stem cell sources for vascular tissue engineering and regeneration 2012, 18,... 2017, 204 Crapo P.M et al An overview of tissue and whole organ decellularization processes 2011, 32, pp.3233-3243 Dahl Shannon L.M et al Decellularized Native and Engineered Arterial Scaffold for... Geenen I.L et al Endothelial cells (ECs) for vascular tissue engineering: venous ECs are less thrombogenic than arterial ECs 2015, 9, pp.564-576 10 Gilpin A et al Decellularization Strategies