Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung Việt Nam.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HAI LOÀI SÊN BIỂN APLYSIA DACTYLOMELA VÀ DENDRODORIS FUMATA Ở VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG VIỆT NAM Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.42.01.16 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành tại: - Học Viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh biển Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Văn Thanh Cơ quan công tác: Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Đỗ Thị Thảo Cơ quan công tác: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày tháng năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Xã hội ngày phát triển người quan tâm tới sức khỏe, phòng chống bệnh tật trở thành nhu cầu thiết yếu Loài người đối mặt với nhiều bệnh nguy hiểm đặc biệt ung thư Bởi việc tìm kiếm thuốc đặc trị thuốc hỗ trợ điều trị tác nhân dự phịng hóa học cần thiết cấp bách Sàng lọc tìm kiếm hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư từ tự nhiên bước bắt buộc trình phát triển thuốc Đến cuối năm 2020, có chín loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ biển đưa thị trường nhiều hợp chất tiến hành nghiên cứu thử nghiệm [2] Có thể thấy nguồn dược liệu biển thực chứa đựng tiềm triển vọng cho việc nghiên cứu tạo sản phẩm phục cộng đồng [3, 4] Việt Nam có vùng biển rộng lớn 1.000.000.000 km bờ biển dài 3.200 km có tiềm lớn tài nguyên sinh vật biển Tuy nhiên, nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam chưa nhiều hạn chế bước thử nghiệm hoạt tính in vivo nghiên cứu chế tương tác thuốc tế bào ung thư Do đó, yêu cầu cấp thiết nước ta cần phát triển nghiên cứu nhằm bước tạo lập hệ thống thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi sinh vật biển Sên biển nhóm động vật biển nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu Cho đến có nhiều cơng trình nghiên cứu giới thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ sên biển Tuy nhiên Việt Nam với tiềm lớn số lượng sên biển đa dạng lồi có nghiên cứu ban đầu hợp chất phân lập từ sên biển Chính đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela Dendrodoris fumata vùng biển miền trung Việt Nam” thực nhằm góp phần bổ sung liệu khoa học nâng cao khả sử dụng nguồn dược liệu sên biển Việt Nam nghiên cứu hóa dược Mục tiêu đề tài luận án - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất thứ cấp ba mẫu thuộc hai loài sên biển thu vùng biển Việt Nam - Phát hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào từ hợp chất phân lập nghiên cứu tác động hoạt chất đến tế bào ung thư điều kiện in vitro Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu đề tài hai loài sên biển Aplysia dactylomela Rang, 1828 (thu thập vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế thu thập vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa), Dendrodoris fumata Ruppell & Leuckart, 1831 (thu thập vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa) Nội dung luận án 1, Phân lập hợp chất từ ba mẫu sên biển thuộc hai loài sên biển A dactylomela D fumata phương pháp sắc ký 2, Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học 3, Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất phân lập 4, Đánh giá tác động cảm ứng apoptosis tế bào số hợp chất tiêu biểu số dòng tế bào ung thư thử nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN Bao gồm phần tổng quan nghiên cứu nước quốc tế việc khai thác hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển điều trị ung thư, nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư, đặc điểm chung sên biển, chi Aplysia chi Dendrodoris, thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Aplysia chi Dendrodoris 1.1 Ung thư mối liên quan tế bào ung thư với trình apoptosis Trình bày nội dung khái niệm ung thư, khái niệm apoptosis, tầm quan trọng apoptosis, mối liên quan aoptososis tế bào ung thư 1.2 Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Trình bày khái quát số thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 1.2.1 Thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào kỹ thuật MTT 1.2.2 Thử nghiệm xác định khả gây apoptosis thông qua sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33342 1.2.3 Thử nghiệm xác định khả cảm ứng enzyme caspase-3 1.2.4 Thử nghiệm đánh giá mức độ apoptosis tế bào kỹ thuật phân tích dịng chảy tế bào (flow cytometry) 1.3 Giới thiệu chung sên biển Bên cạnh việc nghiên cứu tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên dược liệu truyền thống (động thực vật cạn) lồi động vật thân mềm biển, đặc biệt sên biển nhiều phịng thí nghiệm giới quan tâm Hiện nay, có thuốc chữa ung thư đưa thị trường có chứa dẫn xuất từ hợp chất phân lập từ sên biển nhiều hợp chất phân lập từ loài sên biển có hoạt tính gây độc tê bào mạnh 1.3.1 Đặc điểm sinh học sên biển Sên biển thuộc giới Động vật (Animalia), ngành Thân mềm (Mollusca Linnaeus, 1758), lớp Chân bụng (Gastropoda Cuvier, 1795), phân lớp Heterobranchia Burmeister, 1837 [31] 1.3.2 Một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh từ loài sên biển 1.3.3 Tổng quan chi sên biển Aplysia 1.3.4 Tổng quan chi sên biển Dendrodoris 1.3.5 Tình hình nghiên cứu sên biển Việt Nam Thống kê nghiên cứu công bố cho thấy hợp chất phân lập từ sên biển chi Aplysia Dendrodoris chủ yếu bao gồm hợp chất sesquiterpene steroid Nhiều hợp chất số thể hoạt tính sinh học thú vị hoạt tính gây độc tế bào v.v CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu Mẫu Sên biển A dactylomela Rang, 1828 thu thập vào tháng năm 2016 vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế Mẫu Sên biển A dactylomela Rang, 1828 thu thập vào tháng năm 2017 vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa Mẫu Sên biển D fumata Ruppell & Leuckart, 1831 thu thập vào tháng năm 2016 vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa Vật liệu nghiên cứu Các dòng tế bào ung thư người: KB, LNCaP, SK-LU-1, SKMel-2, HepG2, MCF-7, HL-60, SW480 Môi trường ni cấy tế bào: DMEM MEME, có bổ sung thêm L-glutamine, sodium pyruvat, NaHCO3, penicillin/ streptomycin, 10% FBS, Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen Đĩa 96 giếng nhựa đĩa nuôi cấy tế bào giếng nhựa, pippette, máy đọc ELISA 96 giếng Chất tham khảo: Camptothecin 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xử lý, tạo dịch chiết metanol mẫu sên biển nghiên cứu 2.2.2 Phương pháp phân lập chất 2.2.2.1 Quy trình chiết phân lập hợp chất từ mẫu sên biển Hình 2.4 Sơ đồ mơ tả q trình chiết thu phân đoạn chiết từ sên biển A dactylomela a Mẫu sên biển A dactylomela thu vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài sên biển A dactylomela (ASP) b Mẫu sên biển A dactylomela thu vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa Hình 2.7 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài sên biển A dactylomela (AD) c Mẫu sên biển D fumata Hình 2.8 Sơ đồ mơ tả q trình chiết thu phân đoạn chiết từ sên biển D fumata Hình 2.9 Sơ đồ phân lập chất từ sên biển D fumata (DN) 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chế gây độc tế bào ung thư CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ loài A dactylomela thu vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế Chất Chất Chất Chất Chất Chất Chất Chất Chất Hình 3.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi A dactylomela thu Lăng Cơ tỉnh Thừa Thiên Huế 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ loài A dactylomela thu vùng biển Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa Chất Chất Chất Hình 3.2 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A dactylomela thu Hịn Mê tỉnh Thanh Hóa Kết đánh giá 14 hợp chất ASP cho thấy: Hợp chất ASP08 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào thử nghiệm với với giá trị IC50 từ 9.67 đến 26.22 µg/mL Hợp chất ASP11 thể hoạt tính tốt dịng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 từ 14.39 đến 20.65µg/mL Các hợp chất ASP02, ASP07, ASP06, ASP07, ASP09, ASP03 có mức hoạt tính gây độc tế bào trung bình đến yếu với giá trị IC50 từ 19.04±1.04 µg/mL đến 63.55±6.17 µg/mL Các hợp chất cịn lại khơng thể hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư thử nghiệm 3.5.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A dactylomela thu tỉnh Thanh Hóa Bảng 3.16 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất AD IC50 (µg/mL) Mẫu thử AD01 AD02 AD03 Elliptici ne LU-1 HepG2 - >100 1.61± SK-Mel SW480 KB MCF7 HL-60 LNCaP - - - - - - 1.49± 1.59±0 1.54± 1.20± 1.20± 2.10± 1.48± 0.14 0.15 15 0.08 0.10 0.10 0.19 0.09 - >100 - - - - - - 0,43±0, 0,40±0, 0,38±0, 0,49±0, 0,39±0, 0.43±0 0.55±0 0.39±0 04 01 02 05 02 02 04 02 *: Đối chứng dương, “-“ không thử Kết đánh giá hợp chất AD02 có khả gây độc tế bào mạnh dòng tế bào với giá trị IC 50 từ 1.15 đến 2.10 µg/mL Hai hợp chất AD01 AD03 khơng thể hoạt tính gây độc dịng tế bào HepG2 3.5.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ mẫu sên biển D fumata Kết đánh giá hợp chất từ loài DN cho thấy hợp chất DN01 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào với giá trị IC50 từ 6.91 đến 13.18 µg/mL hợp chất DN04 DN09 khơng thể hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư thử nghiệm Bảng 3.17 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất DN Mẫu thử DN01 DN04 DN09 Ellipticine* HL60 6.9± 0.71 >100 >100 0.4± 0.09 KB LU-1 7.1± 0.58 >100 >100 0.3± 0.07 7.85± 0.79 >100 >100 0.44± 0.08 IC50 (µg/mL) MCF7 LNCaP 13.18±1.04 >100 >100 0.57± 0.06 8.11± 1.22 >100 >100 0.33± 0.03 HepG2 6.91± 0.44 >100 >100 0.37± 0.03 SKMEl-2 8.2± 0.61 >100 >100 0.40± 0.05 SW480 7.29± 0.77 >100 >100 0.34± 0,04 *: Đối chứng dương; 3.5.4 Đánh giá thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis tế bào ung thư hợp chất DN01 hợp chất AD02 3.5.4.1 Đánh giá thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis tế bào ung thư gan HepG2 hợp chất AD02 a Xác định khả cảm ứng apoptosis tế bào ung thư gan HepG2 hợp chất AD02 thông qua thay đổi hình thái tế bào Hình 3.4 Ảnh hưởng AD02 nồng độ khác (A: µg/mL (0 µM); B: 0.685 µg/mL (2.5 µM), C: 1.73 µg/mL (5 µM)) đến thay đổi hình thái tế bào HepG2 sau 48h tác động Kính hiển vi quan sát độ phóng đại 40X Mũi tên tế bào chết apoptosis với điểm đặc trưng thay đổi hình thái tế bào: tế bào cô đặc, nhân phân mảnh Kết cho thấy hợp chất AD02 làm thay đổi hình thái tế bào từ dạng tế bào bình thường xuất tế bào có trạng thái apoptosis b Đánh giá khả gây apoptosis kit annexin V Hình 3.5 Tác động hợp chất AD02 đến trình apoptosis tế bào HepG2 thơng qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen sau 48h điều trị nồng độ khác Trong đó, mẫu thử phân tích hệ thống flowcytometry Novocyte (ACE Biosciences Inc.) phần mềm NovoExpress Trục x thể mức độ nhuộm mầu Annexin V, trục y thể mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log Q2-1 hoại tử, Q2-2 apoptosis muộn, Q2-4 apoptosis sớm, Q2-3 tế bào sống Kết phân tích flow cytometry cho thấy tỉ lệ tế bào apoptosis sớm muộn tế bào ung thư HepG2 thay đổi tác động hợp chất AD02 Tỉ lệ tế bào ung thư HepG2 xảy trình apoptosis sớm mẫu đối chứng âm 0.76% chịu tác động hợp chất AD02 (1.73 µg/mL) tỉ lệ tăng lên 14.94% Tỉ lệ tế bào HepG2 xảy trình apoptosis muộn tăng từ 0.32% lên 1.16% có mặt hợp chất AD02 nồng độ 0.685 µg/mL c Đánh giá khả cảm ứng caspase-3 hợp chất AD02 Hình 3.7 Khả cảm ứng sinh caspase-3 mẫu AD02 nồng độ khác sau 24h điều trị Mỗi giá trị đại diện cho trung bình ± SD; ** P