TIỂU LUẬN đề tài xác định rhodamine b trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG *********** TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI Xác định Rhodamine B thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC sử dụng detector UV Sinh viên thực : Trương Ngọc Linh Lâm Thanh Tấn Mai Quỳnh Như Lớp : D19HHPT01 Khố : 2019-2023 Ngành : Hóa Học Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Huỳnh Như Bình Dương, tháng 08/2021 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển vấn đề sức khỏe người lại trọng quan tâm nhiều hơn, vấn đề an tồn thực phẩm môi trường đặt lên hàng đầu chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe người, vấn đề đáng quan tâm, khu chế biến, sản xuất thực phẩm Sự tồn dư chất độc hại có thực phẩm vấn đề lo ngại người tiêu dùng Trong trình chế biến thực phẩm, người ta thường cho thêm chất tạo mùi, tạo màu cơng nghiệp để ăn trở nên bắt mắt hấp dẫn người tiêu dùng Phẩm màu công nghiệp nói chung Rhodamine B nói chung, chất độc hại, bị cấm sử dụng công nghiệp thực phẩm chúng có ảnh hưởng đến sức khỏe người khó phân hủy Tùy vào địa người mà chúng ảnh hưởng đến gan, thận, tụy , mật hay nguy hiểm dẫn đến bệnh ung thư Phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên có độ bền, độ màu chi phí đắt nên để tiết kiệm chi phí sản xuất ngườikinh doanh thường lựa chọn phẩm màu công nghiệp giá thành rẻ có màu sắc bắt mắt cho dù chúng bị cấm sử dụng từ lâu Vì vậy, việc nghiên cứu xác định hàm lượng Rhodamine B- thành phần có phẩm màu công nghiệp, sử dụng thực phẩm cần thiết sức khỏe người Tuy nhiên ngồi Rhodamine B cịn thành phần hóa học khác phẩm màu công nghiệp như: Sudan I Sudan IV, Nhưng phương pháp tối ưu dùng để xác định hàm lượng Rhodamine B có màu thực phẩm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ( HPLC) Đây phương pháp ứng dụng nhiều nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng loạt hợp chất mà số phương pháp trước gặp nhiều khó khăn hợp chất khơng bền với nhiệt, hợp chất có tính chất hố học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm mà phương pháp khác khơng có như: xác định đồng thời nhiều chất, tốn mẫu, thao tác đơn giản,… Để khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình tách xác định hàm lượng Rhodamine B số mẫu thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detetor UV- VIS Phương pháp có độ chọn lọc cao, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi tính ứng dụng thực tế cao Phân tích số mẫu thực phẩm hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm Dựa kết nghiên cứu phân tích hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm mà đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm sở sản xuất Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét Rhodamine B 1.1.1 Công thức cấu tạo Rhodamine B hợp chất hóa học, thành phần phẩm màu công nghiệp Công thức phân tử C28H31ClN2O3 Công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất vật lý Rhodamin B tinh thể màu tối có ánh xanh hay dạng bột màu nâu đỏ Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C Rhodamine B thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l) Độ hoà tan 100 gam dung môi: nước 0,78 gam (260C),rượu etylic 1,74 gam Dung dịch nước rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ dung dịch loãng Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có λ = 526 517 nm 1.1.3 Tính chất sinh học Rhodamine B gây độc cấp mãn tính Qua tiếp xúc, gây dị ứng làm mẩn ngứa da, mắt, Qua đường hơ hấp, gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực Qua đường tiêu hóa, gây nơn mửa, có hại cho gan thận Nếu tích tụ dần thể gây nhiều tác hại gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh gây ung thư [19,23 ] Thực nghiệm chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống tiêm vào tĩnh mạch [23], Rhodamine B vào thể chuyển hóa thành amin thơm tương ứng có phần độc hại loại Rhodamine B thường, gây ung thư phát triển khối u dầy, Rhodamine B dẫn xuất tác động mạnh mẽ đến q trình sinh hóa tế bào gây ung thư gan, gan quan tạng lọc chất Rhodamine B [31] Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN nhiễm sắc thể đưa vào nuôi cấy tế bào [26,21] 1.1.4 Ứng dụng Rhodamine B thường sử dụng thuốc nhuộm tracer nước để xác định tốc độ hướng dòng chảy vận chuyển [24] Được sử dụng rộng rãi ứng dụng cơng nghệ sinh học kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [24] Rhodamine B thử nghiệm để sử dụng bio maker vacxin bệnh dại cho động vật hoang dã, gấu trúc, để xác định động vật hoang dã có thuốc phịng ngừa cách cho Rhodamine B vào râu động vật.[24] Nó trộn vào thuốc diệt cỏ Ngồi Rhodamine B cịn sử dụng để tạo mầu nhuộm mầu công nghiệp sợi, nhuộm màu phịng thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào tính bền mầu [25] Rhodamine B sử dụng sinh học thuốc nhuộm huỳnh quang Tận dụng đặc tính phát quang Rhodamine B, người ta dùng chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên ớt, lấy dầu, Rhodamine B thấm vào ớt dính dầu máy ép ớt, phơi ớt sàn sơn gây lây nhiễm chất nhuộm Ủy ban Gia vị cịn khuyến cáo khơng đựng túi cói nhuộm màu nghi ngại chất nhuộm thẩm lậu vào sản phẩm[25] Mặt khác đường thâm nhập hóa chất vào sản phẩm trồng không để ý đến từ trước đến chúng lại diễn nhiều nước phát triển Ngồi ra, khơng với ớt bột hay chất gia vị nói chung, chất tạo mầu Rhodamine B có nguy xuất hầu hết sản phẩm lương thực, thực phẩm từ trồng có dùng phân bón hóa học[25] 1.2 Các phương pháp xác định Rhodamine B 1.2.1 Các phương pháp sắc ký 1.2.1.1 Phương pháp sắc ký cổ điển (phương pháp sắc ký giấy hay sắc ký mỏng- TLC) Phương pháp đơn giản không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để kiểm tra đánh giá sơ chất phân tích Phương pháp có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu song song lúc tiện lợi Khi TLC trang bị phần phát máy đo quang phân tích định tính định lượng [27,28] Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn ethanol tuyệt đối để thu dung dịch có nồng độ khoảng 10μg/ml Rồi tiến hành xác định định tính điều kiện sắc ký sử dụng mỏng silicagel, hoạt hóa 1100C 30 phút Pha động sử dụng gồm hai hệ: Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10), lấy lớp dưới; Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13) Phát vết cách quan sát vết ánh sáng thường soi đèn tử ngoại, bước sóng 366nm So sánh vị trí màu sắc vết sắc ký đồ dung dịch thử với vết mẫu Rhodamine B sắc ký đồ dung dịch chuẩn để đánh giá kết [28] Nhưng phương pháp sắc ký mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại tốn [21, 15, 10] Vì phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang phương pháp sử dụng [19]… Tuy phương pháp có độ nhạy độ chọn lọc cao với giới hạn phát 10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] đòi hỏi trang thiết bị đại, thường phải chiết dung môi độc hại, làm qua cột chiết pha rắn (SPE) [12] trước bơm vào cột sắc ký 1.2.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trong năm gần đây, phương pháp HPLC đóng vai trị vơ quan trọng việc tách phân tích chất lĩnh vực khác nhau, lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nơng hố, hố dầu, hố học hợp chất thiên nhiên, loại chất có tác dụng độc hại, phân tích mơi trường,…đặc biệt tách phân tích lượng vết chất Trên giới, phương pháp HPLC sử dụng rộng rãi để xác định Rhodamine B thực phẩm loại mẫu khác nhau, ưu so với phương pháp khác có độ xác, độ nhạy độ lặp lại cao… Detector ghép nối máy HPLC cho phép phát xuất chất sau rửa giải Ngày có nhiều loại detector sử dụng cho mục đích mở rộng khả phát nhiều loại chất phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) tách phân tích chất đối tượng phức tạp Cịn thơng dụng người ta dùng detector UV-Vis hay detector huỳnh quang Dùng detector UV-Vis xác định nhiều loại chất, detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc tương tác hợp chất có mẫu Ngồi cịn dùng số detector khác detector diode array (DAD), detector điện hoá,[18] … detector thường ứng dụng để phân tích chất có phẩm nhuộm 1.2.3 Phương pháp UV- Vis xác định Rhodamine B Năm 2006, Brian Stuart M Walker [11] đưa phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản, phải sử dụng đến dung mơi độc Rhodamine B có khả hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng với detectơ UV- Vis phù hợp cho việc phân tích rhodamine B Vì chọn phương pháp Brian Stuat M.Walker để áp dụng cho nghiên cứu Hiện phương pháp phân tích rhodamine B gia vị tiếp tục hoàn thiện nhằm cung cấp sở liệu phục vụ cho nghiên cứu lĩnh vực khoa học thực phẩm y học Để xác định Rhodamine B, người ta sử dụng phương pháp UV- Vis Lấy mẫu chất đem hồ tan dung mơi thích hợp, lắc, rung siêu âm chiết lấy dung dịch Đem dung dịch chiết đo máy UV- Vis, dựa vào cực đại hấp thụ ta xác định mẫu chất có chứa Rhodamine B hay không [13, 17] Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu Hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích rhodamine B có thực phẩm, cụ thể mẫu thực phẩm: siro dâu, bánh xu xê, hạt dưa, nước hương dâu Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector hấp thụ phân tử UV-Vis lựa chọn Từ xây dựng quy trình phân tích để áp dụng xác định rhodamine B thực phẩm 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu trên, luận văn nghiên cứu tách xác định rhodamine B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với độ nhạy độ xác cao.Vì vậy, cần nghiên cứu cách có hệ thống vấn đề sau: Tối ưu hóa điều kiện tách định lượng Rhodamine B HPLC, cụ thể là:  Chọn bước sóng detector  Chọn pha tĩnh  Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động  Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng  Đánh giá độ lặp lại độ phép đo Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu phân tích:  Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu xác định độ thu hồi  Chọn dung môi chiết Rhodamine B khỏi mẫu Xây dựng quy trình phân tích ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác định hàm lượng rhodamine B số loại thực phẩm để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm 2.2 Phương pháp nghiên cứu Đối tượng phân tích mẫu thực phẩm chất phân tích phẩm mầu Thơng thường, mẫu thực phẩm có nhiều thành phần, phức tạp Vì vậy, chúng tơi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu cao) để khảo sát điều kiện tách định lượng Rhodamine B Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Bình chứa dung mơi pha động Bộ phận khử khí Bơm cao áp Bộ phận tiêm mẫu ( tay hay Autosample) Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngịai mơi trường hay điều nhiệt ) Detector ( nhận tín hiệu ) Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu sử lý liệu điều khiển hệ thống HPLC In liệu 2.2.1 Phân tích định lượng HPLC Trong điều kiện phân tích chọn, đại lượng đặc trưng cho chất thời gian lưu tRi chất cột tách Chúng ta dựa vào thời gian lưu để định tính (thơng qua mẫu chuẩn) Sau dựa vào tín hiệu phân tích thu (chiều cao pic diện tích pic) để định lượng chất Để biết tỷ số khối lượng chất tan phân bố vào pha bao nhiêu, ta dựa vào hệ số lưu Trong đó: k’I hệ số lưu m(SP) khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh m(MP) khối lượng chất tan phân bố vào pha động tRi thời gian lưu chất thứ i tR0 thời gian chết cột tách Sử dụng quan hệ xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn Dùng phương pháp đường chuẩn nhanh, đơn giản Còn thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ người ta dùng phương pháp thêm chuẩn Đối với píc tách rời hồn tồn biểu diễn mối tương quan diện tích píc vào nồng độ chất phân tích cho kết vùng tuyến tính lớn Tuy nhiên, thực nghiệm, việc đo chiều cao pic dễ dàng đo diện tích Nên phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic Tuy nhiên pic sắc ký có tượng kéo (peak tailling) việc đo diện tích pic lại xác Trong luận văn chúng tơi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào nơng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau tiến hành xác định nồng độ chất theo hai phương pháp đường chuẩn thêm chuẩn 2.2.2 Detector UV-Vis Loại detector thực chất máy đo hấp thụ phân tử vùng tử ngoại (UV) vùng khả kiến (Vis) Nhưng buồng đặt cuvet đo thay cuvet đo dòng chảy (flowcell) Việc đo để phát chất phân tích hay hợp chất dựa sở tính chất hấp thụ quang phân tử chất dung dịch độ dài sóng đó, dung dịch pha động  Pipet: 1, 2, 5, 10 ml  Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, cột chiết pha rắn  Pipet man, CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 3.1.1 Chọn thể tích vịng mẫu (sample loop) Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý mẫu ban đầu nạp vào vịng chứa mẫu tích định xilanh áp suất bình thường, sau nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu dịng pha động nạp vào cột tách Độ xác, độ lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách phụ thuộc vào thiết kế van bơm mẫu mà phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào cột Dựa vào khả thay đổi vịng mẫu khác mà thay đổi thể tích mẫu bơm vào cột Tuy nhiên yếu tố góp phần vào mở rộng chân pic sắc ký (dỗng pic) Nếu vịng chứa mẫu dài, lượng mẫu bơm vào cột lớn tượng dỗng píc xảy lớn gây chen lấn píc q trình tách Lượng mẫu xác định thể tích vịng chứa mẫu mà ta chọn Với thể tích mẫu nhỏ thể tích mẫu tới hạn V0 bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích píc tăng cách tuyến tính Đến giới hạn Vmẫu > V0, ta tiếp tục tăng thể tích mẫu chiều cao píc sắc ký khơng tăng mà lúc píc sắc ký tù dỗng, khơng sắc nét Vì việc chọn thể tích vịng mẫu quan trọng Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường nên dùng vịng mẫu nhỏ tốt để tạo nên píc có độ sắc nét cao, tránh dỗng píc Trong phân tích HPLC người ta thường dùng vịng mẫu 10, 20, 50, 100l, vòng mẫu 20l phổ biến Trong trường hợp phân tích Rhodamine B chúng tơi lựa chọn van bơm mẫu chiều thể tích vịng mẫu 20l 3.1.2 Chọn bước sóng detectơ Việc chọn bước sóng đo phát chất quan trọng định trực tiếp tới độ nhạy phép phân tích Vì phương pháp nghiên cứu lựa chọn HPLC ghép nối detectơ UV- Vis, detectơ cố định bước sóng phải tiến hành khảo sát điều kiện để chọn bước sóng phù hợp cho phân tích chất Việc đo phát chất phân tích hay hợp chất dựa sở tính chất hấp thụ quang phân tử chất dung dịch bước sóng Chính để thu pic cao, rõ ràng đủ để định lượng cần phải đo cực đại hấp thụ Chúng tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến máy UV-Vis 8453 với dung dịch chuẩn rhodamine B pha thành phần dung môi khác nhau:  Rhodamine B 1ppm 80% methanol- 20% nước  Rhodamine B 1ppm 80% methanol- 20% nước có 3% trietylamin  Rhodamine B 1ppm 80% axetonitril- 20% nước 0,005M natri 1- heptansunfonat  Rhodamine B 1ppm 100% methanol  Rhodamine B 1ppm 100% nước 3.2 Chọn pha tĩnh Pha tĩnh yếu tố quan trọng định tới hiệu tách Bản chất pha tĩnh định chế tách khả lưu giữ chất tan Tùy theo chất chất phân tích mà chọn loại pha tĩnh, kích thước hạt nhồi, chiều dài cột cho phù hợp trình sắc ký Hệ pha ngược ứng dụng phổ biến độ ổn định, độ lặp lại khả tách nhiều loại chất Ngồi dung mơi sử dụng cho pha ngược có tính kinh tế Để nghiên cứu tách xác định hàm lượng rhodamine B, chất có tính phân cực chủ yếu cơng trình nghiên cứu cơng bố sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo RP- C18, RP- C8,… Tiến hành nghiên cứu khả tách rhodamine B cột RPC18 RP-C8 với điều kiện sắc ký: 90% MeOH, 10% đệm axetat có pH=3,01; tốc độ dịng 0,8 ml/phút, bước sóng 576nm, sắc ký đồ thể hình 3.4 Hình 3.4 Sắc ký đồ Rhodamine B cột tách khác (a) RP- C18 (b) RP- C8 Dựa vào việc khảo sát sắc ký đồ Rhodamine B cột RP- C18 RP- C8 điều kiện cho ta thấy khả tách Rhodamine B cột RP- C8 Vì cột RP- C8 lựa chọn để tách xác định hàm lượng Rhodamine B Cột RP- C8 sử dụng có kích thước 4,6mm x150mm, 5m 3.3 Tối ưu hóa pha động Đây yếu tố quan trọng sau pha tĩnh, định hiệu suất tách sắc ký mẫu phân tích Pha động pha tĩnh hai yếu tố q trình sắc ký Hai yếu tố định thời gian lưu giữ chất hiệu tách Khác với pha tĩnh, pha động yếu tố linh động, thay đổi dễ dàng để điều kiện phân tích tối ưu Do sau chọn cột pha tĩnh thành phần pha động yếu tố khảo sát Trên sở tổng quan tài liệu có hai pha động chọn là: Pha động thứ nhất: MeOH – nước (được điều chỉnh tới pH= axit HCOOH) Pha động thứ hai: ACN- nước (được điều chỉnh tới pH = axit HCOOH, có thêm 5mM natri 1- heptansunfonat) 3.3.1 Ảnh hưởng thành phần pha động tới khả tách sắc ký Tỷ lệ thành phần dung môi tạo pha động có ảnh hưởng đến q trình rửa giải chất mẫu khỏi cột tách Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi lực rửa giải pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu chất phân tích, làm thay đổi hệ số dung lượng chất phân tích Do đó, để có thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát tỷ lệ khác với thành phần pha động lựa chọn gồm: Pha động thứ nhất: Dung dịch đệm có pH=3 dung môi hữu methanol (MeOH), thay đổi tỷ lệ pha động: 60%MeOH- 40% H2O; 65%MeOH- 35% H2O; 70%MeOH- 30% H2O; 75%MeOH- 25% H2O; 80%MeOH- 20% H2O; 85%MeOH15% H2O; 90%MeOH- 10% H2O; 95%MeOH- 5% H2O; 100%MeOH- 0% H2O Pha động thứ hai: ACN- nước điều chỉnh tới pH=3 axit HCOOH, có thêm 0,005M natri 1- heptansunfonat, thay đổi tỷ lệ pha động: 60%ACN- 40% H2O; 65%ACN- 35% H2O; 70%ACN- 30% H2O; 75%ACN- 25% H2O; 80%ACN20% H2O; 85%ACN- 15% H2O; 90%ACN- 10% H2O; 95%ACN- 5% H2O; 100%ACN- 0% H2O Tiến hành pha động sau: 3.3.1.1 Pha động thứ Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm Nhiệt độ cột tách: 250C Nồng độ rhodamine B: 2,0ppm Bước sóng detector: 550nm pH dung dịch đệm: Nồng độ dung địch đệm: 20mM Tốc độ pha động: 0,8ml/phút Sau chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu rhodamine B, thiết lập mối quan hệ hệ số lưu rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động pha động thứ Kết thu trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động STT %MeOH %H2O tR0(s) tRi(s) ki ’ =(tRi- tR0)/tR0 60 40 2,11 11,812 4,598 65 35 2,11 6,476 2,069 70 30 2,11 4,190 0,986 75 25 2,11 4,640 0,890 80 20 2,11 3,522 0,669 85 15 2,11 2,808 0,331 90 10 2,11 2,701 0,280 95 2,11 2,722 0,290 100 2,11 2,514 0,191 Hình 3.5 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH pha động 3.3.1.2 Pha động thứ hai (Pha động: ACN- nước điều chỉnh tới pH=3 axit HCOOH, có thêm 5mM natri 1- heptansunfonat) Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm Nhiệt độ cột tách: 300C Nồng độ Rhodamine B: 0,5ppm Bước sóng detector: 550nm pH dung dịch đệm: 3,0 Nồng độ dung địch đệm: 20mM Tốc độ pha động: 0,8ml/phút Sau chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu Rhodamine B thiết lập mối quan hệ hệ số lưu rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động pha động thứ hai Kết thu trình bày bảng 3.4 hình 3.8 Bảng 3.4 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động STT %ACN %H2O tR0(s) tRi(s) ki ’ =(tRi- tR0)/tR0 60 40 2,056 8,282 3,040 65 35 2,056 6,238 2,043 70 30 2,056 4,920 1,4 75 25 2,056 4,112 1,009 80 20 2,056 3,636 0,774 85 15 2,056 4,029 0,965 90 10 2,056 4,569 1,229 95 2,056 4,848 1,365 100 Hình 3.8 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN pha động 3.3.2 Ảnh hưởng chất phụ 3.3.3.1 Ảnh hưởng trietylamin hệ pha động gồm MeOH đệm Trong số loại tài liệu cho thấy tách chất hữu mang tính chất bazơ cột tách pha đảo thường xảy tượng kéo (peak tailling) Ngun nhân tượng tương tác axit- bazơ chất phân tích tâm axit cịn lại bề mặt pha tĩnh Để giải tượng kéo đuôi pic thường theo hai hướng sử dụng cột endcapping sử dụng chất cải biến hữu (organic modifier) thường sử dụng bazơ hữu trietylamin, trimetylamin,… Trong luận văn sử dụng chất cải biến hóa học trietylamin (TEA) với nồng độ thay đổi từ 0ppm6000ppm Kết thu trình bày bảng 3.5 hình Bảng 3.5 Hệ số lưu ki ’ phụ thuộc vào nồng độ trietylami STT Nồng độ trietylamin (ppm) tR0 (s) tRi(s) ki ’ =(tRi- tR0)/tR0 2,11 3,817 0.809 2000 2,11 5,343 1.532 3000 2,11 5,466 1.591 4000 2,11 5,683 1.693 5000 2,11 5,338 1.530 6000 2,11 3,759 0.782 Hình 3.5 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH pha động 3.3.4 Khảo sát tốc độ pha động ( Tấn) Cùng với yếu tố thành phần pha động, tốc độ pha động chạy sắc ký ảnh hưởng khơng đến kết tách sắc ký Tốc độ pha động yếu tố định đến trình rửa giải chất cột sắc ký ảnh hưởng đến trình thiết lập cân chất tan hai pha tĩnh pha động Tốc độ pha động q nhỏ gây tượng dỗng píc, thời gian rửa giải chất lớn làm giảm tính kinh tế phương pháp Nhưng tốc độ pha động lớn làm cho chất mẫu không kịp tách khỏi nhau, dẫn đến tượng dỗng pic Vì cần lựa chọn tốc độ pha phù hợp Đối với hệ pha tĩnh thành phần pha động lựa chọn khả tách chất phụ thuộc vào tốc độ pha động Đối với cột tách xác định có tốc độ tối ưu 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 3.4.1 Tổng kết điều kiện chọn Từ điều kiện khảo sát theo hai hệ dung mơi phía điều kiện tối ưu lựa chọn cho q trình phân tích sau: Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1- heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm 3.4.2 Khảo sát lập đường chuẩn Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1- heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm Khoảng nồng độ: 0,01ppm- 2,00ppm Phương pháp định lượng: diện tích pic Mẫu gốc ban đầu pha vào ACN, dung dịch loãng pha từ dung dịch gốc với dung môi pha động nhằm tránh píc ảo sai khác thành phần dung mơi q trình chạy sắc ký gây ra, tiến hành siêu âm loại khí, sau chuyển vào phận mẫu HPLC 3.4.3 Giới hạn phát (limit of detection- LOD) Giới hạn phát nồng độ thấp chất phân tích mà phương pháp phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền, hay píc sắc ký chất phân tích phải có chiều cao H thoả mãn: H  x n Trong đó: H chiều cao pic n độ lệch chuẩn tín hiệu 3.4.4 Giới hạn định lượng (limit of quanlity- LOQ) Giới hạn định lượng nồng độ thấp (xQ) chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu (blank or background) LOQ = 10 x SB/b Trong đó: b hệ số góc phương trình hồi quy SB độ lệch chuẩn mẫu trắng, xác định theo phương trình hồi quy Như theo phương trình hồi quy ta có: LOQ= 0,0502 g/ml Hay LOQ= 50,2 ppb Theo phương pháp trực tiếp, giới hạn phát 3,33 ppb 3.4.5 Độ phép đo Độ xác phép đo đánh giá thông qua phần trăm sai số Chọn mẫu phân tích có nồng độ điểm đầu, cuối khoảng tuyến tính khảo sát Chúng tơi tiến hành chuẩn bị mẫu chuẩn có nồng độ 0,1ppm; 0,5ppm; 1,0ppm tiến hành chạy sắc ký, mẫu chạy lặp lần Phần trăm sai số tính theo cơng thức sau: Trong đó: Si diện tích tính từ đường chuẩn St diện tích theo sắc đồ Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn với điều kiện sắc ký với nồng độ khác Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 0,007M natri heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm 3.4.6 Độ lặp lại phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngồi việc có sai số nhỏ cịn u cầu có độ lặp lại cao Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV (RSD) Độ lặp lại đánh giá thơng qua việc tính tốn với ba nồng độ: 0,1ppm; 0,5ppm; 1ppm khảo sát độ xác ( ) i tb S S SD n     % 100  tb SD CV x S  Trong đó: Si diện tích pic sắc ký thứ i Stb diện tích trung bình n lần chạy n số lần lặp lại 3.5 Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý kết phân tích 3.5.1 Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B Xử lý sơ mẫu phân tích Áp dụng điều kiện tối ưu để phân tích bốn đối tượng mẫu hạt dưa, bánh xu xê, nước hương dâu siro dâu Tống số mẫu phân tích mẫu/đối tượng x đối tượng (hạt dưa, bánh xu xê, nước hương dâu siro dâu) Cứ ba đơn vị mẫu đối tượng thu thập trộn với thành mẫu phức hợp để phân tích Phương pháp chọn mẫu: Mẫu chọn theo phương pháp chủ định có định hướng chợ, chợ mua đơn vị mẫu đối tượng mẫu Mẫu thực phẩm mua số chợ Hà Nội: chợ Đồng Xuân, chợ Mơ, Chợ Ngã Tư Sở Mẫu thực phẩm mua bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 40C, mẫu đem phân tích sấy khô nhiệt độ 400C, nghiền nhỏ, cân với lượng cân xác chiết dung mơi chiết thích hợp Chọn dung mơi chiết Dung mơi chiết yếu tố vô quan trọng định hiệu suất q trình xử lý mẫu Các dung mơi chiết sử dụng ACNaxeton, etanol- nước, nướcKCl, ACN- axeton- nước, nước, etanol Chúng tiến hành xử lý sơ mẫu hạt dưa chiết với dung môi chiết khác để lựa chọn dung mơi chiết tốt Cân xác 1,0000gam hạt dưa vào bình 25ml, thêm 10ml hỗn hợp dung mơi (4 mẫu vào bình):  100% etanol  50% etanol- 50% nước  100% nước có thêm KCl  20% ACN- 20% axeton- 60% nước Siêu âm 60 phút, lọc qua giấy thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC Kết thu được trình bày bảng Dung môi chiết Khối lượng mẫu (gam) Nồng độ rhodamine B (ppm) Etanol 1,000 0,46 Etanol- nước 1,001 143 ACN- Axeton- nước 1,000 20 Nước- KCl 1,003 1,08 3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 3.5.2.1 Mẫu hạt dưa Sau tìm điều kiện tối ưu cho q trình xử lý mẫu, chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thực đối tượng mẫu: hạt dưa, bánh xu xê, nước ngọt, tương ớt Đối với mẫu hạt dưa,quy trình chiết sau: mẫu hạt dưa cân xác 0,5g cân phân tích chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Đối với chất mẫu phân tích thêm chuẩn lượng chất chuẩn thêm vào từ đầu trước chiết Các trình chiết tiến hành điều kiện tương tự mẫu phân tích không thêm Xác định hàm lượng rhodamine B mẫu hạt dưa theo phương pháp thêm tiêu chuẩn, thông qua cách lập phương trình hồi quy đường thêm chuẩn dạng y= a+ bx Bảng Kết phân tích mẫu hạt dưa TT Khối lượng mẫu thực (mg) Lượng rhodamine B chuẩn thêm vào (ppm) Diện tích píc (mAu.s) 500 0,0 546419,0 500 0,5 1295550 500 1,0 2364128 Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu hạt dưa, hàm lượng Rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (93%) Như với đối tượng phân tích mẫu hạt dưa dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấytrong mẫu hạt dưa phân tích có chứa rhodamine B 0,0465mg/g, chất bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm 3.5.2.2 Mẫu siro dâu Quá trình chiết mẫu phân tích tiến hành tương tự mẫu hạt dưa mẫu bánh xu xê, khơng pha lỗng Đối với mẫu siro dâu,quy trình chiết sau: mẫu siro dâu lấy xác 0,5ml pipet chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích mẫu rhodamine B mẫu siro dâu trình bày bảng Bảng Kết phân tích mẫu siro dâu STT Khối lượng mẫu thực (mg) Lượng rhodamine B chuẩn thêm vào (ppm) Diện tích píc (mAu.s) 500 0,00 28047 500 0,01 61781 500 0,02 96730 Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu siro dâu, hàm lượng rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt Như với đối tượng phân tích mẫu siro dâu dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy mẫu siro dâu phân tích khơng chứa rhodamine B KẾT LUẬN (Linh) Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng rhodamine B thực phẩm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có mẫu thực phẩm kỹ thuật HPLC sử dụng detetơ UV-Vis: Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm Đã đánh giá phương pháp phân tích: Khoảng tuyến tính Rhodamine B: 0,01- 2ppm Giới hạn phát hiện: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 1ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 15ppb Giới hạn định lượng: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 3,33ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 50,2ppb Khảo sát mẫu thực Đã chọn quy trình phân tích khảo sát dung môi chiết tách loại thực phẩm 60% nước- 40% etanol Trên sở quy trình tối ưu tìm tiến hành xác định hàm lượng rhodamine B mẫu thực phẩm gồm mẫu hạt dưa, mẫu siro dâu,với độ lặp lại tốt Kết xác định mẫu thực cho thấy: mẫu thực phẩm lưu hành thị trường lấy mẫu, hàm lượng rhodamine B xác định nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Chứng tỏ bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm, rhodamine B sử dụng phổ biến số loại thực phẩm kiểm tra Từ kết thu được, cho thấy phương pháp HPLC sử dụng detectơ UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có loại thực phẩm với cách xử lý mẫu thích hợp ... 40 2, 11 11,8 12 4,598 65 35 2, 11 6,476 2, 069 70 30 2, 11 4,190 0,986 75 25 2, 11 4,640 0,890 80 20 2, 11 3, 522 0,669 85 15 2, 11 2, 808 0,331 90 10 2, 11 2, 701 0 ,28 0 95 2, 11 2, 722 0 ,29 0 100 2, 11 2, 514... để áp dụng xác định rhodamine B thực phẩm 2. 1 .2 Nội dung nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu trên, luận văn nghiên cứu tách xác định rhodamine B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng. .. Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu cao) để khảo sát điều kiện tách định lượng Rhodamine B Hình 2. 1 Sơ đồ tổng quát hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao B? ?nh chứa dung mơi pha động B? ?? phận khử khí B? ?m cao áp B? ?? phận