TIỂU LUẬN đề tài xác ĐỊNH RHODAMINE b TRONG THỰC PHẨM BẰNG kỹ THUẬT sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC sử DỤNG DETECTOR UV

Windows User TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV Nhóm.Windows User TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV Nhóm.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG *********** TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV Nhóm: 16 Sinh viên thực : Trƣơng Ngọc Linh MSSV : 1924401120006 : Lâm Thanh Tấn : 1924401120053 : Mai Quỳnh Nhƣ : 1924401120013 Lớp : D19HHPT01 Khoá : 2019-2023 Ngành : Hóa Học Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Lê Thị Huỳnh Nhƣ Bình Dƣơng, tháng 11/2021 Contents DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Tính chất sinh học 1.1.4 Ứng dụng 1.2 Các phƣơng pháp xác định Rhodamine B 1.2.1 Các phƣơng pháp sắc ký Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 10 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 10 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Phân tích định lƣợng HPLC 11 2.2.2 Detector UV-Vis 12 2.3 Hoá chất dụng cụ nghiên cứu 13 2.3.1 Hoá chất 13 2.3.2 Máy móc thiết bị 13 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 15 3.1.1 Chọn thể tích vịng mẫu (sample loop) 15 3.1.2 Chọn bƣớc sóng detectơ 15 3.2 Chọn pha tĩnh 16 3.3 Tối ƣu hóa pha động 17 3.3.1 Ảnh hƣởng thành phần pha động tới khả tách sắc ký 17 3.3.2 Ảnh hƣởng chất phụ 21 3.3.4 Khảo sát tốc độ pha động 21 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 22 3.4.1 Tổng kết điều kiện chọn 22 3.4.2 Khảo sát lập đƣờng chuẩn 22 3.4.3 Giới hạn phát (limit of detection- LOD) 22 3.4.4 Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ) 22 3.4.5 Độ phép đo 23 3.4.6 Độ lặp lại phép đo 23 3.5 Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý kết phân tích 24 3.5.1 Khảo sát dung mơi chiết lấy Rhodamine B 24 3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 25 KẾT LUẬN 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 18 Bảng 32 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 20 Bảng 3.3 Hệ số lưu ki ’ phụ thuộc vào nồng độ trietylami 21 Kết thu được trình bày bảng 25 Bảng Kết phân tích mẫu hạt dưa 26 Bảng Kết phân tích mẫu siro dâu 27 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ Rhodamine B cột tách khác (a) RP- C18 (b) RPC8 16 Hình 3.2 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH pha động 18 Hình 3.3 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN pha động 20 Hình 3.5 Đường thêm chuẩn (a) sắc đồ (b) thêm chuẩn mẫu hạt dưa 26 Hình 3.6 Đường chuẩn (a) sắc đồ (b)khi thêm chuẩn mẫu siro dâu 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển vấn đề sức khỏe người lại trọng quan tâm nhiều hơn, vấn đề an tồn thực phẩm môi trường đặt lên hàng đầu chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe người, vấn đề đáng quan tâm, khu chế biến, sản xuất thực phẩm Sự tồn dư chất độc hại có thực phẩm vấn đề lo ngại người tiêu dùng Trong trình chế biến thực phẩm, người ta thường cho thêm chất tạo mùi, tạo màu công nghiệp để ăn trở nên bắt mắt hấp dẫn người tiêu dùng Phẩm màu cơng nghiệp nói chung Rhodamine B nói chung, chất độc hại, bị cấm sử dụng cơng nghiệp thực phẩm chúng có ảnh hưởng đến sức khỏe người khó phân hủy Tùy vào địa người mà chúng ảnh hưởng đến gan, thận, tụy , mật hay nguy hiểm dẫn đến bệnh ung thư Phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên có độ bền, độ màu chi phí đắt nên để tiết kiệm chi phí sản xuất ngườikinh doanh thường lựa chọn phẩm màu công nghiệp giá thành rẻ có màu sắc bắt mắt cho dù chúng bị cấm sử dụng từ lâu Vì vậy, việc nghiên cứu xác định hàm lượng Rhodamine B- thành phần có phẩm màu cơng nghiệp, sử dụng thực phẩm cần thiết sức khỏe người Tuy nhiên Rhodamine B cịn thành phần hóa học khác phẩm màu công nghiệp như: Sudan I Sudan IV, Nhưng phương pháp tối ưu dùng để xác định hàm lượng Rhodamine B có màu thực phẩm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ( HPLC) Đây phương pháp ứng dụng nhiều nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng loạt hợp chất mà số phương pháp trước gặp nhiều khó khăn hợp chất khơng bền với nhiệt, hợp chất có tính chất hố học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm mà phương pháp khác khơng có như: xác định đồng thời nhiều chất, tốn mẫu, thao tác đơn giản,… Để khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình tách xác định hàm lượng Rhodamine B số mẫu thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detetor UV- VIS Phương pháp có độ chọn lọc cao, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi tính ứng dụng thực tế cao Phân tích số mẫu thực phẩm hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm Dựa kết nghiên cứu phân tích hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm mà đánh giá vấn đề an tồn thực phẩm sở sản xuất Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét Rhodamine B 1.1.1 Công thức cấu tạo Rhodamine B hợp chất hóa học, thành phần phẩm màu cơng nghiệp Công thức phân tử C28H31ClN2O3 Công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất vật lý Rhodamin B tinh thể màu tối có ánh xanh hay dạng bột màu nâu đỏ Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C Rhodamine B thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l) Độ hoà tan 100 gam dung môi: nước 0,78 gam (260C),rượu etylic 1,74 gam Dung dịch nước rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ dung dịch loãng Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có λ = 526 517 nm 1.1.3 Tính chất sinh học Rhodamine B gây độc cấp mãn tính Qua tiếp xúc, gây dị ứng làm mẩn ngứa da, mắt, Qua đường hơ hấp, gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực Qua đường tiêu hóa, gây nơn mửa, có hại cho gan thận Nếu tích tụ dần thể gây nhiều tác hại gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh gây ung thư s[19] Thực nghiệm chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống tiêm vào tĩnh mạch, Rhodamine B vào thể chuyển hóa thành amin thơm tương ứng có phần độc hại loại Rhodamine B thường, gây ung thư phát triển khối u dầy, Rhodamine B dẫn xuất tác động mạnh mẽ đến trình sinh hóa tế bào gây ung thư gan, gan quan tạng lọc chất Rhodamine B Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN nhiễm sắc thể đưa vào nuôi cấy tế bào 1.1.4 Ứng dụng Rhodamine B thường sử dụng thuốc nhuộm tracer nước để xác định tốc độ hướng dòng chảy vận chuyển Được sử dụng rộng rãi ứng dụng công nghệ sinh học kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang Rhodamine B thử nghiệm để sử dụng bio maker vacxin bệnh dại cho động vật hoang dã, gấu trúc, để xác định động vật hoang dã có thuốc phịng ngừa cách cho Rhodamine B vào râu động vật Nó trộn vào thuốc diệt cỏ Ngồi Rhodamine B cịn sử dụng để tạo mầu nhuộm mầu công nghiệp sợi, nhuộm màu phịng thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào tính bền mầu Rhodamine B sử dụng sinh học thuốc nhuộm huỳnh quang Tận dụng đặc tính phát quang Rhodamine B, người ta dùng chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên ớt, lấy dầu, Rhodamine B thấm vào ớt dính dầu máy ép ớt, phơi ớt sàn sơn gây lây nhiễm chất nhuộm Ủy ban Gia vị cịn khuyến cáo khơng đựng túi cói nhuộm màu nghi ngại chất nhuộm thẩm lậu vào sản phẩm Mặt khác đường thâm nhập hóa chất vào sản phẩm trồng không để ý đến từ trước đến chúng lại diễn nhiều nước phát triển Ngồi ra, khơng với ớt bột hay chất gia vị nói chung, chất tạo mầu Rhodamine B có nguy xuất hầu hết sản phẩm lương thực, thực phẩm từ trồng có dùng phân bón hóa học 1.2 Các phƣơng pháp xác định Rhodamine B 1.2.1 Các phƣơng pháp sắc ký 1.2.1.1 Phƣơng pháp sắc ký cổ điển (phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký mỏng- TLC) Phương pháp đơn giản không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để kiểm tra đánh giá sơ chất phân tích Phương pháp có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu song song lúc tiện lợi Khi TLC trang bị phần phát máy đo quang phân tích định tính định lượng Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn ethanol tuyệt đối để thu dung dịch có nồng độ khoảng 10μg/ml Rồi tiến hành xác định định tính điều kiện sắc ký sử dụng mỏng silicagel, hoạt hóa 1100C 30 phút Pha động sử dụng gồm hai hệ: Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10), lấy lớp dưới; Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13) Phát vết cách quan sát vết ánh sáng thường soi đèn tử ngoại, bước sóng 366nm So sánh vị trí màu sắc vết sắc ký đồ dung dịch thử với vết mẫu Rhodamine B sắc ký đồ dung dịch chuẩn để đánh giá kết [18] Nhưng phương pháp sắc ký mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại tốn [15, 10] Vì phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang phương pháp sử dụng [19]… Tuy phương pháp có độ nhạy độ chọn lọc cao với giới hạn phát 10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb đòi hỏi trang thiết bị đại, thường phải chiết dung môi độc hại, làm qua cột chiết pha rắn (SPE) [12] trước bơm vào cột sắc ký 1.2.1.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trong năm gần đây, phương pháp HPLC đóng vai trị vơ quan trọng việc tách phân tích chất lĩnh vực khác nhau, lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nơng hố, hố dầu, hố học hợp chất thiên nhiên, loại chất có tác dụng độc hại, phân tích mơi trường,…đặc biệt tách phân tích lượng vết chất Trên giới, phương pháp HPLC sử dụng rộng rãi để xác định Rhodamine B thực phẩm loại mẫu khác nhau, ưu so với phương pháp khác có độ xác, độ nhạy độ lặp lại cao… Detector ghép nối máy HPLC cho phép phát xuất chất sau rửa giải Ngày có nhiều loại detector sử dụng cho mục đích mở rộng khả phát nhiều loại chất phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) tách phân tích chất đối tượng phức tạp Cịn thơng dụng người ta dùng detector UV-Vis hay detector huỳnh quang Dùng detector UV-Vis xác định nhiều loại chất, detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc tương tác hợp chất có mẫu Ngồi cịn dùng số detector khác detector diode array (DAD), detector điện hoá,[18]… detector thường ứng dụng để phân tích chất có phẩm nhuộm 1.2.3 Phƣơng pháp UV- Vis xác định Rhodamine B Năm 2006, Brian Stuart M Walker [11] đưa phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản, phải sử dụng đến dung mơi độc Rhodamine B có khả hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng với detectơ UV- Vis phù hợp cho việc phân tích rhodamine B Vì chúng tơi chọn phương pháp Brian Stuat M.Walker để áp dụng cho nghiên cứu Hiện phương pháp phân tích rhodamine B gia vị tiếp tục hoàn thiện nhằm cung cấp sở liệu phục vụ cho nghiên cứu lĩnh vực khoa học thực phẩm y học Để xác định Rhodamine B, người ta sử dụng phương pháp UV- Vis Lấy mẫu chất đem hồ tan dung mơi thích hợp, lắc, rung siêu âm chiết lấy dung dịch Đem dung dịch chiết đo máy UV- Vis, dựa vào cực đại hấp thụ ta xác định mẫu chất có chứa Rhodamine B hay không [13, 17] Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu Hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích rhodamine B có thực phẩm, cụ thể mẫu thực phẩm: siro dâu, bánh xu xê, hạt dưa, nước hương dâu Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector hấp thụ phân tử UV-Vis lựa chọn Từ xây dựng quy trình phân tích để áp dụng xác định rhodamine B thực phẩm 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu trên, luận văn nghiên cứu tách xác định rhodamine B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với độ nhạy độ xác cao.Vì vậy, cần nghiên cứu cách có hệ thống vấn đề sau: Tối ưu hóa điều kiện tách định lượng Rhodamine B HPLC, cụ thể là:  Chọn bước sóng detector  Chọn pha tĩnh  Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động  Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng  Đánh giá độ lặp lại độ phép đo Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu phân tích:  Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu xác định độ thu hồi  Chọn dung môi chiết Rhodamine B khỏi mẫu Xây dựng quy trình phân tích ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác định hàm lượng rhodamine B số loại thực phẩm để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm 10 3.3 Tối ƣu hóa pha động Đây yếu tố quan trọng sau pha tĩnh, định hiệu suất tách sắc ký mẫu phân tích Pha động pha tĩnh hai yếu tố q trình sắc ký Hai yếu tố định thời gian lưu giữ chất hiệu tách Khác với pha tĩnh, pha động yếu tố linh động, thay đổi dễ dàng để điều kiện phân tích tối ưu Do sau chọn cột pha tĩnh thành phần pha động yếu tố khảo sát Trên sở tổng quan tài liệu có hai pha động chọn là: Pha động thứ nhất: MeOH – nước (được điều chỉnh tới pH= axit HCOOH) Pha động thứ hai: ACN- nước (được điều chỉnh tới pH = axit HCOOH, có thêm 5mM natri 1- heptansunfonat) 3.3.1 Ảnh hƣởng thành phần pha động tới khả tách sắc ký Tỷ lệ thành phần dung môi tạo pha động có ảnh hưởng đến q trình rửa giải chất mẫu khỏi cột tách Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi lực rửa giải pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu chất phân tích, làm thay đổi hệ số dung lượng chất phân tích Do đó, để có thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát tỷ lệ khác với thành phần pha động lựa chọn gồm: Pha động thứ nhất: Dung dịch đệm có pH=3 dung mơi hữu methanol (MeOH), thay đổi tỷ lệ pha động: 60%MeOH- 40% H2O; 65%MeOH35% H2O; 70%MeOH- 30% H2O; 75%MeOH- 25% H2O; 80%MeOH- 20% H2O; 85%MeOH- 15% H2O; 90%MeOH- 10% H2O; 95%MeOH- 5% H2O; 100%MeOH0% H2O Pha động thứ hai: ACN- nước điều chỉnh tới pH=3 axit HCOOH, có thêm 0,005M natri 1- heptansunfonat, thay đổi tỷ lệ pha động: 60%ACN- 40% H2O; 65%ACN- 35% H2O; 70%ACN- 30% H2O; 75%ACN- 25% H2O; 80%ACN 20% H2O; 85%ACN- 15% H2O; 90%ACN- 10% H2O; 95%ACN- 5% H2O; 100%ACN- 0% H2O Tiến hành pha động sau: 3.3.1.1 Pha động thứ Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm Nhiệt độ cột tách: 250C Nồng độ rhodamine B: 2,0ppm Bước sóng detector: 550nm pH dung dịch đệm: Nồng độ dung địch đệm: 20mM 17 Tốc độ pha động: 0,8ml/phút Sau chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu rhodamine B, thiết lập mối quan hệ hệ số lưu rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động pha động thứ Kết thu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động STT %MeOH %H2O tR0(s) tRi(s) ki ’ =(tRi- tR0)/tR0 60 40 2,11 11,812 4,598 65 35 2,11 6,476 2,069 70 30 2,11 4,190 0,986 75 25 2,11 4,640 0,890 80 20 2,11 3,522 0,669 85 15 2,11 2,808 0,331 90 10 2,11 2,701 0,280 95 2,11 2,722 0,290 100 2,11 2,514 0,191 Hình 3.2 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH pha động 18 3.3.1.2 Pha động thứ hai (Pha động: ACN- nƣớc đƣợc điều chỉnh tới pH=3 axit HCOOH, có thêm 5mM natri 1- heptansunfonat) Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm Nhiệt độ cột tách: 300C Nồng độ Rhodamine B: 0,5ppm Bước sóng detector: 550nm pH dung dịch đệm: 3,0 Nồng độ dung địch đệm: 20mM Tốc độ pha động: 0,8ml/phút Sau chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu Rhodamine B thiết lập mối quan hệ hệ số lưu rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động pha động thứ hai Kết thu trình bày bảng 3.4 hình 3.8 19 Bảng 3.2 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động STT %ACN %H2O tR0(s) tRi(s) ki ’ =(tRi- tR0)/tR0 60 40 2,056 8,282 3,040 65 35 2,056 6,238 2,043 70 30 2,056 4,920 1,4 75 25 2,056 4,112 1,009 80 20 2,056 3,636 0,774 85 15 2,056 4,029 0,965 90 10 2,056 4,569 1,229 95 2,056 4,848 1,365 100 Hình 3.3 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN pha động 20 3.3.2 Ảnh hƣởng chất phụ 3.3.3.1 Ảnh hƣởng trietylamin hệ pha động gồm MeOH đệm Trong số loại tài liệu cho thấy tách chất hữu mang tính chất bazơ cột tách pha đảo thường xảy tượng kéo đuôi (peak tailling) Nguyên nhân tượng tương tác axit- bazơ chất phân tích tâm axit lại bề mặt pha tĩnh Để giải tượng kéo đuôi pic thường theo hai hướng sử dụng cột endcapping sử dụng chất cải biến hữu (organic modifier) thường sử dụng bazơ hữu trietylamin, trimetylamin,… Trong luận văn sử dụng chất cải biến hóa học trietylamin (TEA) với nồng độ thay đổi từ 0ppm 6000ppm Kết thu trình bày bảng 3.4 Bảng 3.3 Hệ số lưu ki ’ phụ thuộc vào nồng độ trietylami STT Nồng độ trietylamin (ppm) tR0 (s) tRi(s) ki ’ =(tRi- tR0)/tR0 2,11 3,817 0.809 2000 2,11 5,343 1.532 3000 2,11 5,466 1.591 4000 2,11 5,683 1.693 5000 2,11 5,338 1.530 6000 2,11 3,759 0.782 3.3.4 Khảo sát tốc độ pha động Cùng với yếu tố thành phần pha động, tốc độ pha động chạy sắc ký ảnh hưởng khơng đến kết tách sắc ký Tốc độ pha động yếu tố định đến trình rửa giải chất cột sắc ký ảnh hưởng đến trình thiết lập cân chất tan hai pha tĩnh pha động Tốc độ pha động q nhỏ gây tượng dỗng píc, thời gian rửa giải chất lớn làm giảm tính kinh tế phương pháp Nhưng tốc độ pha động lớn q làm cho chất mẫu khơng kịp tách khỏi nhau, dẫn đến tượng doãng pic Vì cần lựa chọn tốc độ pha phù hợp Đối với hệ pha tĩnh thành phần pha động lựa chọn khả tách chất phụ thuộc vào tốc độ pha động Đối với cột tách xác định có tốc độ tối ưu 21 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.4.1 Tổng kết điều kiện chọn Từ điều kiện khảo sát theo hai hệ dung mơi phía điều kiện tối ưu lựa chọn cho q trình phân tích sau: Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1- heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm 3.4.2 Khảo sát lập đƣờng chuẩn Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1- heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm Khoảng nồng độ: 0,01ppm- 2,00ppm Phương pháp định lượng: diện tích pic Mẫu gốc ban đầu pha vào ACN, dung dịch loãng pha từ dung dịch gốc với dung môi pha động nhằm tránh píc ảo sai khác thành phần dung mơi q trình chạy sắc ký gây ra, tiến hành siêu âm loại khí, sau chuyển vào phận mẫu HPLC 3.4.3 Giới hạn phát (limit of detection- LOD) Giới hạn phát nồng độ thấp chất phân tích mà phương pháp phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền, hay píc sắc ký chất phân tích phải có chiều cao H thoả mãn: H  x n Trong đó: H chiều cao pic n độ lệch chuẩn tín hiệu 3.4.4 Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ) Giới hạn định lượng nồng độ thấp (xQ) chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu (blank or background) LOQ = 10 x SB/b Trong 22 đó: b hệ số góc phương trình hồi quy SB độ lệch chuẩn mẫu trắng, xác định theo phương trình hồi quy Như theo phương trình hồi quy ta có: LOQ= 0,0502 g/ml Hay LOQ= 50,2 ppb Theo phương pháp trực tiếp, giới hạn phát 3,33 ppb 3.4.5 Độ phép đo Độ xác phép đo đánh giá thông qua phần trăm sai số Chọn mẫu phân tích có nồng độ điểm đầu, cuối khoảng tuyến tính khảo sát Chúng tơi tiến hành chuẩn bị mẫu chuẩn có nồng độ 0,1ppm; 0,5ppm; 1,0ppm tiến hành chạy sắc ký, mẫu chạy lặp lần Phần trăm sai số tính theo cơng thức sau: Trong đó: Si diện tích tính từ đường chuẩn St diện tích theo sắc đồ Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn với điều kiện sắc ký với nồng độ khác Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 0,007M natri heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm 3.4.6 Độ lặp lại phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngồi việc có sai số nhỏ cịn u cầu có độ lặp lại cao Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV (RSD) Độ lặp lại đánh giá thơng qua việc tính tốn với ba nồng độ: 0,1ppm; 0,5ppm; 1ppm khảo sát độ xác 23 Trong đó: Si diện tích pic sắc ký thứ i Stb diện tích trung bình n lần chạy n số lần lặp lại 3.5 Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý kết phân tích 3.5.1 Khảo sát dung mơi chiết lấy Rhodamine B Xử lý sơ mẫu phân tích Áp dụng điều kiện tối ưu để phân tích bốn đối tượng mẫu hạt dưa, bánh xu xê, nước hương dâu siro dâu Tống số mẫu phân tích mẫu/đối tượng x đối tượng (hạt dưa, bánh xu xê, nước hương dâu siro dâu) Cứ ba đơn vị mẫu đối tượng thu thập trộn với thành mẫu phức hợp để phân tích Phương pháp chọn mẫu: Mẫu chọn theo phương pháp chủ định có định hướng chợ, chợ mua đơn vị mẫu đối tượng mẫu Mẫu thực phẩm mua số chợ Hà Nội: chợ Đồng Xuân, chợ Mơ, Chợ Ngã Tư Sở Mẫu thực phẩm mua bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 40C, mẫu đem phân tích sấy khơ nhiệt độ 400C, nghiền nhỏ, cân với lượng cân xác chiết dung mơi chiết thích hợp Chọn dung môi chiết Dung môi chiết yếu tố vô quan trọng định hiệu suất q trình xử lý mẫu Các dung mơi chiết sử dụng ACNaxeton, etanol- nước, nước- KCl, ACN- axeton- nước, nước, etanol Chúng tiến hành xử lý sơ mẫu hạt dưa chiết với dung môi chiết khác để lựa chọn dung mơi chiết tốt Cân xác 1,0000gam hạt dưa vào bình 25ml, thêm 10ml hỗn hợp dung mơi (4 mẫu vào bình):  100% etanol  50% etanol- 50% nước 24  100% nước có thêm KCl  20% ACN- 20% axeton- 60% nước Siêu âm 60 phút, lọc qua giấy thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC Kết thu được trình bày bảng Dung môi chiết Khối lƣợng mẫu (gam) Nồng độ rhodamine B (ppm) Etanol 1,000 0,46 Etanol- nước 1,001 143 ACN- Axeton- nước 1,000 20 Nước- KCl 1,003 1,08 3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 3.5.2.1 Mẫu hạt dƣa Sau tìm điều kiện tối ưu cho q trình xử lý mẫu, chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thực đối tượng mẫu: hạt dưa, bánh xu xê, nước ngọt, tương ớt Đối với mẫu hạt dưa,quy trình chiết sau: mẫu hạt dưa cân xác 0,5g cân phân tích chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Đối với chất mẫu phân tích thêm chuẩn lượng chất chuẩn thêm vào từ đầu trước chiết Các trình chiết tiến hành điều kiện tương tự mẫu phân tích không thêm Xác định hàm lượng rhodamine B mẫu hạt dưa theo phương pháp thêm tiêu chuẩn, thông qua cách lập phương trình hồi quy đường thêm chuẩn dạng y= a+ bx 25 Bảng Kết phân tích mẫu hạt dưa TT Khối lƣợng mẫu thực (mg) Lƣợng rhodamine B chuẩn thêm vào (ppm) Diện tích píc (mAu.s) 500 0,0 546419,0 500 0,5 1295550 500 1,0 2364128 Hình 3.5 Đường thêm chuẩn (a) sắc đồ (b) thêm chuẩn mẫu hạt dưa Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu hạt dưa, hàm lượng Rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (93%) Như với đối tượng phân tích mẫu hạt dưa dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấytrong mẫu hạt dưa phân tích có chứa rhodamine B 0,0465mg/g, chất bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm 3.5.2.2 Mẫu siro dâu 26 Quá trình chiết mẫu phân tích tiến hành tương tự mẫu hạt dưa mẫu bánh xu xê, khơng pha lỗng Đối với mẫu siro dâu,quy trình chiết sau: mẫu siro dâu lấy xác 0,5ml pipet chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích mẫu rhodamine B mẫu siro dâu trình bày bảng Bảng Kết phân tích mẫu siro dâu STT Khối lƣợng mẫu thực (mg) Lƣợng rhodamine B chuẩn thêm vào (ppm) Diện tích píc (mAu.s) 500 0,00 28047 500 0,01 61781 500 0,02 96730 Hình 3.6 Đường chuẩn (a) sắc đồ (b)khi thêm chuẩn mẫu siro dâu Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu siro dâu, hàm lượng rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt Như với đối tượng phân tích mẫu siro dâu dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy mẫu siro dâu phân tích khơng chứa rhodamine B 27 KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng rhodamine B thực phẩm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có mẫu thực phẩm kỹ thuật HPLC sử dụng detetơ UV-Vis: Pha tĩnh: RP- C8 Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫ Detector: UV-Vis 550 nm Đã đánh giá phương pháp phân tích: Khoảng tuyến tính Rhodamine B: 0,01- 2ppm Giới hạn phát hiện: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 1ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 15ppb Giới hạn định lượng: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 3,33ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 50,2ppb Khảo sát mẫu thực Đã chọn quy trình phân tích khảo sát dung môi chiết tách loại thực phẩm 60% nước- 40% etanol Trên sở quy trình tối ưu tìm tiến hành xác định hàm lượng rhodamine B mẫu thực phẩm gồm mẫu hạt dưa, mẫu siro dâu,với độ lặp lại tốt Kết xác định mẫu thực cho thấy: mẫu thực phẩm lưu hành thị trường lấy mẫu, hàm lượng rhodamine B xác định nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Chứng tỏ bị cấm 28 sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm, rhodamine B sử dụng phổ biến số loại thực phẩm kiểm tra Từ kết thu được, cho thấy phương pháp HPLC sử dụng detectơ UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có loại thực phẩm với cách xử lý mẫu thích hợp 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Thái Bình (18/ 11/2009), “Rhodamine B có vị thuốc đông y chất gây ung thư”, báo Sức khoẻ đời sống [2] Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1980) “Cơ sở ký thuyết hố học phân tích”, nhà xuất Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội [3] Nguyễn Xuân Dũng, Từ Vọng Nghi, Phạm Luận (1986) “Các phương pháp tách- Sắc ký lỏng cao áp”, Đại học Tổng hợp Amsterdam, Hà Nội [4] Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xn Trung (2003), “Hố học phân tích- Phần II- Các phương pháp phân tích cơng cụ”, ĐHQG Hà Nội [5] Nguyễn Đắc Kiên (2009- 2010), “Nghiên cứu hình thành tích lũy độc tố afltoxin bảo quản thức ăn thủy sản”, luận văn thạc sỹ khoa họcĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, Hà Nội [6] Phạm Luận (1999), “Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao”, Đại học Tổng hợp Hà Nội [7] Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Uyên, Phạm Văn Hoan (2009), “Xác định Sudan I số loại gia vị kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)”, tạp chí y học thực hành, số (641+642), trang 58-60 [8] Đỗ Văn Quân (2007), “Xác định hợp chất Sudan phương pháp sắc ký lỏng có độ phân giải cao” Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội [9] TCVN 8670-2011 việc xác định Rhodamine B HPLC [10] Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích, Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 TIẾNG ANH [11] Brian Stuart and M.Walker (2006) “Analysis of illegal Dyes in Chili Powder by LC- UV”, Statutory analysis government chemist: Programme ad hoc project 1, pp 1-11 [12] C.Minier (1996) “Rhodamine B accumulation and MXR protein expression in musscle blood cells: effects of exposure to vicristine” Marine ecology progress series vol 142 pp 165-173 [13] Carcinogen, Pesticide Branch, (2/1989), Rhodamine B, OSHA analytical Laboratory- Salt Lake city- Utah [14] Geertruida Sihombing (2001), “An Exploratory Study on three Synthetic Colouring Matters Commonly Used as Food colours in Jakarta”, Master Theses from JKPKBPPK [15] Noureddine Barka and CS(2008) “Factors influencing the photocatalytic degradation of Rhodamine B by TiO2- coated non- woven paper” journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry 195, pp 346-351 [16] Giao Xuân, (1/2/2010), “Chili powder maker suspended for Rhodamine B contaminnation health news”, báo Sức khoẻ đời sống [17] Petr botek, Jan Poustka (2007) “Determination of banned dyes in spices by liquid chromatography- Mass spectrometry”, Czech J Food Sci, vol.25, No.1, pp 17- 24 [18] R.W Mason L.R.Edwards (1989), “High-performance liquid chromatographic determination of rhodamine B in rabbit and human 30 plasma”, Journal of Chromatography, 491 page 468- 472 31 ... để áp dụng xác định rhodamine B thực phẩm 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu trên, luận văn nghiên cứu tách xác định rhodamine B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng. .. detector UV- Vis để xác định hàm lượng rhodamine B thực phẩm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có mẫu thực phẩm kỹ thuật HPLC sử dụng detetơ UV- Vis:... pha ngược dùng detector UV- Vis Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với độ nhạy độ xác cao. Vì vậy, cần nghiên cứu cách có hệ thống vấn đề sau: Tối ưu