Windows User TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV Nhóm.Windows User TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV Nhóm.
TỔNG QUAN
Công thức cấu tạo
Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu công nghiệp
Công thức phân tử là C 28 H 31 ClN 2 O 3
Tính chất vật lý
Rhodamin B là một loại thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, có dạng tinh thể màu tối với ánh xanh hoặc dưới dạng bột màu nâu đỏ Nhiệt độ nóng chảy của nó dao động từ 210 °C đến 211 °C Rhodamin B tan tốt trong methanol, ethanol và nước, với độ hòa tan khoảng 50 g/l Trong 100 gam dung môi, Rhodamin B hòa tan 0,78 gam trong nước (ở 26 °C) và 1,74 gam trong rượu etylic Dung dịch nước và rượu etylic của Rhodamin B có màu đỏ ánh xanh nhạt và phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung dịch loãng, với bước sóng hấp thụ cực đại lần lượt là 526 nm và 517 nm.
Tính chất sinh học
Rhodamine B là một chất độc hại có thể gây ra nhiều tác động xấu đến sức khỏe, bao gồm dị ứng da, khó thở, và triệu chứng tiêu hóa như nôn mửa Khi tích tụ trong cơ thể, nó có thể gây tổn hại cho gan, thận, hệ sinh sản, và hệ thần kinh, đồng thời làm tăng nguy cơ ung thư Nghiên cứu trên chuột cho thấy Rhodamine B có thể gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch, do nó chuyển hóa thành các amin thơm độc hại hơn Chất này tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào, đặc biệt là trong gan, nơi đầu tiên lọc Rhodamine B Ngoài ra, các thí nghiệm cũng cho thấy Rhodamine B có khả năng phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi nuôi cấy tế bào.
Ứng dụng
Rhodamine B là một thuốc nhuộm tracer phổ biến trong nước, giúp xác định tốc độ và hướng dòng chảy Nó được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học, bao gồm kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy và quang phổ huỳnh quang Hiện nay, Rhodamine B đang được thử nghiệm như một bio marker trong vắc-xin bệnh dại cho động vật hoang dã, như gấu trúc, nhằm xác định động vật đã được tiêm phòng Ngoài ra, Rhodamine B cũng được sử dụng trong thuốc diệt cỏ, công nghiệp sợi và nhuộm màu trong phòng thí nghiệm nhờ vào tính bền màu của nó.
Rhodamine B được sử dụng để kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt và cây lấy dầu, nhưng có nguy cơ thẩm thấu vào ớt qua dầu trong máy ép hoặc khi phơi ớt trên sàn sơn Ủy ban Gia vị khuyến cáo không nên sử dụng túi cói nhuộm màu do lo ngại chất nhuộm có thể xâm nhập vào sản phẩm Hơn nữa, con đường thâm nhập của hóa chất này vào sản phẩm cây trồng thường bị bỏ qua, đặc biệt ở các nước đang phát triển Rhodamine B không chỉ xuất hiện trong ớt bột mà còn có nguy cơ xuất hiện trong hầu hết các sản phẩm lương thực thực phẩm từ cây trồng có sử dụng phân bón hóa học.
Các phương pháp xác định Rhodamine B
1.2.1 Các phương pháp sắc ký
1.2.1.1 Phương pháp sắc ký cổ điển (phương pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản mỏng- TLC)
Phương pháp TLC là một kỹ thuật đơn giản, không cần thiết bị đặc biệt, được sử dụng để đánh giá sơ bộ các chất phân tích Ưu điểm của phương pháp này là khả năng tiến hành nhiều mẫu song song, mang lại sự tiện lợi Khi được trang bị máy đo quang, TLC có thể thực hiện phân tích định tính và định lượng Để xác định định tính, Rhodamine B chuẩn được hòa tan trong ethanol tuyệt đối với nồng độ khoảng 10μg/ml, sau đó sử dụng bản mỏng silicagel đã hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút Hai hệ pha động được sử dụng trong quá trình này.
Hệ 1: CHCl 3 - MeOH- H 2 O (65: 35: 10), lấy lớp dưới; Hệ 2: EA- MeOH- H 2 O (100: 17: 13)
Để phát hiện vết, cần quan sát dưới ánh sáng thường hoặc sử dụng đèn tử ngoại với bước sóng 366nm Việc so sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử với vết mẫu của Rhodamine B trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn sẽ giúp đánh giá kết quả một cách chính xác.
Phương pháp sắc ký bản mỏng có nhược điểm như độ nhạy và độ chọn lọc kém, thời gian xử lý mẫu lâu, cùng với việc sử dụng nhiều hóa chất độc hại và tốn kém Do đó, hiện nay, các phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) và sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang đang được ưa chuộng Mặc dù những phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện 10 ppb và giới hạn định lượng 35 ppb, nhưng chúng yêu cầu trang thiết bị hiện đại và thường cần chiết bằng các dung môi độc hại, cũng như làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE) trước khi tiến hành phân tích.
1.2.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã trở thành công cụ quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong nhiều lĩnh vực như hóa dược, sinh hóa, hóa thực phẩm, nông hóa và môi trường HPLC được ưa chuộng để xác định Rhodamine B trong thực phẩm nhờ vào độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao Các detector trong máy HPLC, như detector khối phổ (MSD), UV-Vis và huỳnh quang, giúp phát hiện các chất trong mẫu phức tạp với hiệu quả khác nhau Detector UV-Vis có khả năng xác định nhiều loại chất, trong khi detector huỳnh quang thường nhạy hơn và ít bị ảnh hưởng bởi các hợp chất trong nền mẫu Ngoài ra, các detector khác như diode array (DAD) và detector điện hóa cũng được sử dụng phổ biến trong phân tích phẩm nhuộm.
1.2.3 Phương pháp UV- Vis xác định Rhodamine B
Năm 2006, Brian Stuart và M Walker đã phát triển một phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản, và ít độc hại, phù hợp cho việc phân tích Rhodamine B Với khả năng hấp thụ ánh sáng nhạy trong vùng khả kiến, thiết bị sắc ký lỏng với detector UV-Vis là lựa chọn lý tưởng để xác định Rhodamine B Phương pháp này hiện đang được hoàn thiện để cung cấp cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học Để xác định Rhodamine B, mẫu chất được hòa tan trong dung môi thích hợp, sau đó lắc, rung siêu âm và chiết xuất dung dịch Cuối cùng, dung dịch chiết được đo bằng máy UV-Vis, từ đó xác định sự hiện diện của Rhodamine B trong mẫu chất.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích hàm lượng rhodamine B có trong thực phẩm, bao gồm các mẫu như siro dâu, bánh xu xê, hạt dưa và nước ngọt hương dâu Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector hấp thụ phân tử UV-Vis đã được lựa chọn để thực hiện phân tích Quy trình phân tích được xây dựng nhằm xác định chính xác rhodamine B trong các sản phẩm thực phẩm này.
Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu việc tách và xác định rhodamine B thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột tách pha ngược và sử dụng detector UV-Vis Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng phương pháp xác định rhodamine B một cách hiệu quả.
Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng trong thực phẩm với độ nhạy và độ chính xác cao Do đó, cần tiến hành nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề liên quan đến phương pháp này.
1 Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng Rhodamine B bằng HPLC, cụ thể là:
Chọn bước sóng của detector
Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động
Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo
2 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu và xác định độ thu hồi
Chọn dung môi chiết Rhodamine B ra khỏi nền mẫu
3 Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác định hàm lượng rhodamine B trong một số loại thực phẩm để đánh giá mức độ an toàn của thực phẩm
Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng phân tích trong nghiên cứu này là các mẫu thực phẩm, với chất phân tích chính là phẩm màu Rhodamine B Các mẫu thực phẩm thường chứa nhiều thành phần và có nền phức tạp, do đó, chúng tôi đã chọn phương pháp HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sát điều kiện tách và định lượng Rhodamine B một cách hiệu quả.
Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
1 Bình chứa dung môi pha động
4 Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5 Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt )
7 Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC
2.2.1 Phân tích định lƣợng bằng HPLC
Trong phân tích, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi trên cột tách Thời gian lưu này giúp định tính chất qua mẫu chuẩn, và từ các tín hiệu phân tích thu được, như chiều cao pic, ta có thể rút ra kết luận về thành phần của chất.
Để xác định tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào từng pha, ta cần dựa vào hệ số lưu Việc này giúp định lượng các chất một cách chính xác, từ đó hỗ trợ trong các nghiên cứu và ứng dụng liên quan đến phân tích hóa học.
Hệ số k’ được xác định bởi khối lượng chất tan m(SP) phân bố vào pha tĩnh và khối lượng chất tan m(MP) phân bố vào pha động Thời gian lưu t Ri của chất thứ i và thời gian chết t R0 của cột tách cũng là những yếu tố quan trọng trong quá trình phân tích.
Việc xác định nồng độ chất phân tích có thể thực hiện qua hai phương pháp chính là đường chuẩn và thêm chuẩn Phương pháp đường chuẩn được ưa chuộng nhờ tính nhanh chóng và đơn giản, trong khi phương pháp thêm chuẩn thường được áp dụng cho các mẫu phức tạp hoặc khi nồng độ chất cần xác định rất nhỏ Đối với các píc hoàn toàn tách rời, mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ chất phân tích cho kết quả tuyến tính lớn hơn Tuy nhiên, trong thực tế, đo chiều cao píc dễ dàng hơn so với đo diện tích Do đó, trong phân tích nồng độ nhỏ, thường sử dụng chiều cao píc Tuy nhiên, đối với các píc sắc ký có hiện tượng kéo đuôi, việc đo diện tích píc lại cho kết quả chính xác hơn Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết lập mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính, và xác định nồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn.
Detector này là máy đo hấp thụ phân tử trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (Vis), với buồng cuvet được thay thế bằng cuvet đo dòng chảy (flowcell) Việc phát hiện các chất phân tích dựa trên tính chất hấp thụ quang phân tử của chúng trong dung dịch ở một độ dài sóng nhất định, trong đó dung dịch là pha động của quá trình sắc ký, chứa chất phân tích chảy liên tục qua buồng đo Các chất phân tích tan trong pha động có thể tạo ra phổ hấp thụ trực tiếp, cho phép phát hiện và xác định tất cả các chất phân tích hoặc hợp chất của chúng nhờ khả năng hấp thụ quang nhạy ở một bước sóng trong vùng UV-Vis Nguyên tắc định lượng dựa trên định luật hấp thụ ánh sáng.
Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu
Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích và HPLC
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 50 ppm, cần cân chính xác lượng chất chuẩn Rhodamine B vào cốc 50 ml, sau đó hòa tan và chuyển vào bình định mức 50 ml Tiếp theo, định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ Cuối cùng, bảo quản dung dịch tránh ánh sáng ở nhiệt độ 40°C.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn 2 ppm, bạn cần lấy 2 ml dung dịch chuẩn gốc 50 ppm và cho vào bình định mức 50 ml Sau đó, thêm methanol cho đến vạch định mức và lắc kỹ Cuối cùng, bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 40°C và tránh ánh sáng.
Các dung dịch chuẩn nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc, sử dụng trong ngày Các loại hoá chất khác
Methanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Acetonitril loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axit fomic loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Trietyl amin loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Ethanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axeton loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
2.3.2 Máy móc và thiết bị
Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent- Mỹ với dải phổ từ 190- 1100 nm, điều khiển bằng phần mềm Chemstation
Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer- Đan Mạch với điện cực thủy tinh Red- Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm: Bộ loại khí cho dung môi, Degasser- DGU- 14AM
Bộ trộn dung môi FCV- 10ALVP
Bơm dung môi bốn kênh LC- 10ATVP
Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO- 10ASVP
Van bơm mẫu 6 chiều VS- 7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòng mẫu
Detector UV-Vis SPD- 10AVVP
Hệ điều khiển SCL- 10AVP
Phần mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1
Cân phân tích độ chính xác 0,1mg, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy Dụng cụ
Các bình định mức: 5, 10, 20, 50 ml
Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, cột chiết pha rắn
