Báo cáo thực hành tách chiết DNA và đặt phản ứng PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA ĐÀO TẠO ĐẶC BIỆT - NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH BUỔI - TÁCH CHIẾT DNA VÀ ĐẶT PHẢN ỨNG PCR Môn: Trị liệu bệnh người GVHD: TS Lê Thị Trúc Linh Nhóm 1: • Võ Lê Thanh Thúy - 1953010099 • Trần Trương Lam Ngọc - 1953012056 • Lê Trần Hà Thư - 1953012104 NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài Tách chiết DNA đặt phản ứng PCR 2.1 VẶT LIỆU 2.2 TÁCH CHIẾT DNA a Nguyên tắc b Thiết bị hóa chất c Thực 2.3 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DNA THU NHẬN a Nguyên tắc b Thiết bị hóa chất c Thực d Kết đo OD bước sóng 260nm 2.4 PHẢN ỨNG PCR • Chuẩn bị • Thực • Chu kỳ PCR • Kết điện di sản phẩm PCR NỘI DUNG 2.1 Vật liệu Tế bào SW1353 2.2 Tách chiết DNA a Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA Trong đó, màng tế bào màng nhân biến tính chất tẩy mạnh Sau protein biến tính phenol/chloroform bị loại bỏ DNA gen tủa với ethanol lạnh b Thiết bị hóa chất Phenol Merck Chloroform Merck SDS 10% NaCl 5M Tris HCl 1M (pH=8) EDTA 0.5M (pH=8) NH4OAc 5M Ethanol 100% Việt Á Ethanol 70% Việt Á 10 Proteinase K Fermentas 11 Máy ly tâm lạnh Hettich c Thực • Lắc mạnh, hút 200ul protein (SW1353) vào eppendorf (epp 1.5ml) • Hút 2ul proteinase K cho vào epp • Vortex mạnh, ủ 56°C 1h • Thêm 200ul phenol:chloroform isopropanol (tỉ lệ 1:1), lắc • Ly tâm 13000 rpm 10 phút 4°C • Hút 100ul dịch sau ly tâm chuyển sang epp • Thêm 100ul chloroform vào epp • Ly tâm 13000 rpm 10 phút 4°C • Hút 75ul dịch chuyển sang epp Và tủa 150ul ethanol 100% • Hút bỏ dịch sau ly tâm (chú ý thao tác để không hút trúng tủa DNA) • Rửa tủa: Thêm 500ul dung dịch ethanol 75% vào epp chứa DNA • Tiếp tục ly tâm 10 phút 4°C • Hút bỏ dịch ly tâm ly tâm nhẹ 1000rpm khoảng 10 giây • Để khơ phút nhiệt độ phịng • Hút 10ul H20 vào epp Đến đây, hồn thành quy trình tách chiết • Đến bước pha lỗng để đo OD: Hút 92uL H2O + 8uL DNA tổng 100uL vào epp đem đo • Trong tube DNA gốc dư lại 2uL để làm phản ứng PCR thí nghiệm 2.3 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận * Phương pháp đo quang phổ a Nguyên tắc: Hàm lượng DNA xác định nhờ hấp thụ mạnh ánh sáng bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD260nm (Optical Density 260nm) mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA dung dịch (với A260nm= 1.0 OD = 50 µg/ml DNA sợi đôi) Độ tinh DNA đánh giá qua tỷ lệ A260/A280 Có thể xem DNA thu nhận tinh giá trị dao động từ 1,4-2 b Thiết bị hóa chất • Máy đo quang phổ: Bio Rad • Nước cất hai lần c Thực hiện: DNA sau tách chiết pha lỗng lần nước cất vơ trùng Sau chuyển tất dung dịch vào cuvette đo nồng độ DNA bước sóng 260nm Độ tinh dung dịch xác định OD260/OD280 d Kết đo OD bước sóng 260nm Hình Kết đo OD bước sóng 260nm Concentration = 2,7650 ug/ml A260/A280 = 4,6361 A260 = 0.005 A280 = 0.001 Kết quả: OD260/OD280 > → Mẫu không tinh Nồng độ DNA 2,765 ug/ml → Sau tách chiết thu DNA Thảo luận: Những nguyên nhân ảnh hưởng đến q trình tách chiết DNA: • Hóa chất: trường hợp bị loại bỏ nhóm khác làm loại hóa chất thu mẫu DNA bình thường • Kỹ thuật: - Quan sát sau ly tâm bước tủa ethanol 100% có mẫu tủa đáy epp, mẫu bị bước hút bỏ dịch sau tủa rửa tủa DNA - Hoặc đo OD, thao tác hút không đủ 100ul, cịn sót lại dịch ống epp dẫn đến kết bị sai số Cách khắc phục – kỹ thuật: - Dùng pipette 20 200ul hút dịch ethanol gần với tủa DNA để tránh tình trạng hút mạnh làm tủa DNA - Trộn mẫu hút lượng mẫu cần để tránh kết bị sai số 2.4 PHẢN ỨNG PCR • Chuẩn bị • Thực • Pha loãng primer vào eppendorf 1.5mL: Epp 18-F: 2ul primer 18-Forward + 18ul H2O Epp 18-R: 2ul primer 18-Reverse + 18ul H2O • Mix Primer: thêm 2ul primer pha loãng loại vào epp suspend • Pha master mix: Master mix Buffer 5X Thể tích 1ul DNTP 0.5 ul Phire Tag 0.25 ul H2O 2.25 ul Epp PCR gồm: Master mix 4ul • Primer (F R) 0.5ul Template DNA 0.5ul • Chu kỳ PCR: Gen Trình tự mồi (5’-3’) Tm (1) (2) (3) P (bp) 20 60.9 0.61 7.74 5.38 6,37 227 L EGFR F: AGGGCTGAGGTGACCCTTGT E-18 R: TCCCCACCAGACCATGAGAG 20 58.5 0.77 Trong đó, Tm nhiệt độ nóng chảy mồi, (1) mức lượng liên kết tự cho khả hình thành cấu trúc hairpin loop, (2) mức lượng liên kết tự cho khả hình thành cấu trúc homodimer, (3) mức lượng liên kết tự cho khả hình thành cấu trúc heterodimer F-mồi xuôi, R-mồi ngược Tm: 59,7° = (60,9 + 58.5)/2 Time: 13 giây = (60 giây x 0,227) Chu kỳ PCR: Bước Nhiệt độ(0C) 95 95 60 72 72 Thời gian phút 35 giây 17 giây 30 giây phút Chu kỳ 35 Hình Cài đặt chu kỳ PCR 2.5 Kết điện di sản phẩm PCR a Nguyên tắc Các acid nucleic đại phân tử tích điện âm, điện trường phân tử DNA di chuyển phía cực dương điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng cấu trúc phân tử DNA Các acid nucleic gel agarose hình tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất có khả gắn xen vào bazơ acid nucleic phát quang tác dụng tia tử ngoại (λ=300nm) Kích thước acid nucleic xác định so sánh với kích thước biết trước thang chuẩn b Thiết bị hóa chất: • Buồng điện di • Máy đọc gel Bio Rad • Gel agarose Bio Basic • 20X TAE Buffer Bio Basic • Ethidium bromide Bio Rad c Các bước tiến hành: Hút μl sản phẩm PCR chạy điện di với gel agarose 1.5% hiệu điện 135V 30 phút Nếu phổ điện di dung dịch DNA tách chiết sau hình cho dải băng rộng cho nhiều vạch chứng tỏ DNA bị gãy đoạn nhiều, lẫn DNA với RNA Phổ điện di băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy không lẫn tạp a Kết điện di gel agarose 1.5% Band mục tiêu: 227bp PCR ~75-100bp Hình Điện di gel agarose 1,5% sản phẩm DNA PCR (Thang 50bp) Kích thước sản phẩm PCR vùng Exon 18 mục tiêu 227bp Kích thước sản phẩm PCR vùng Exon 18 ~75-100bp Khơng có sản phẩm PCR