NGUYỄN DIỆU lý KHẢO sát ẢNH HƯỞNG của CHẤT tạo GEL lên QUÁ TRÌNH tạo hỗn DỊCH PROBIOTIC CHỨA lactobacillus acidophilus CHO TRẺ EM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN DIỆU LÝ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Mã sinh viên: 1701356 - KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VŨ TRÌNH CHẤT TẠONGUYỄN GEL QUANG LÊNTHẾ QUÁ MÃ SINH VIÊN: 1701679 TẠO HỖN DỊCH PROBIOTIC CHỨA TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNGEM THƯ Lactobacillus acidophilus CHO TRẺ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Lê Ngọc Khánh HVCH Trần Hoàng Việt Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày phần nội dung đề tài khóa luận mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên giúp đỡ tơi hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người thầy, người đáng kính tơi: PGS.TS Đàm Thanh Xn, TS Nguyễn Khắc Tiệp, ThS Lê Ngọc Khánh - Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận có dẫn hữu ích, kịp thời giúp tơi vượt qua lúc khó khăn Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến HVCH Trần Hoàng Việt anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, muốn cảm ơn tới gia đình bạn bè, người bạn, người em thuộc nhóm nghiên cứu khóa 72 73 tổ Công nghệ sinh học hỗ trợ, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Diệu Lý MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Định nghĩa probiotic 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.3 Đặc tính quan trọng probiotic 1.1.4 Vai trò probiotic lâm sàng 1.1.5 Cơ chế hoạt động probiotic 1.2 Đại cương Lactobacillus acidophilus (L acidophilus) 1.2.1 Giới thiệu L acidophilus 1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, nuôi cấy 1.2.3 Một số dạng bào chế khác chứa L acidophilus thị trường 1.3 Một số thông tin hỗn dịch chứa vi sinh vật 1.3.1 Một số sản phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu thị trường 1.3.2 Hướng dẫn sử dụng thường dùng cho chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 1.3.3 Ưu nhược điểm sản phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 1.4 Thành phần công thức probiotic dạng hỗn dịch dầu 1.4.1 Thành phần thường có hỗn dịch dầu chứa probiotic 1.4.2 Thành phần sử dụng chế phẩm nghiên cứu 1.5 Yêu cầu chất lượng sản phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 12 1.6 Nghiên cứu chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu trước 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 13 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.4 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát tỉ lệ hàm lượng hai chất tạo gel (Nhôm tristearat Aerosil) ảnh hưởng đến trình kết tụ chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 15 2.2.2 Đánh giá số đặc tính cơng thức hiệu chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu khảo sát 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn dụng cụ, thiết bị, môi trường nuôi cấy 15 2.3.2 Phương pháp tạo hỗn dịch 15 2.3.3 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật 16 2.3.4 Phương pháp đo kích thước tiểu phân hỗn dịch tính kết trung bình 17 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả phân tán hỗn dịch 17 2.3.6 Phương pháp đánh giá độ lắng hỗn dịch 17 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Khảo sát tỉ lệ hàm lượng hai chất tạo gel (Nhôm tristearat Aerosil) ảnh hưởng đến trình kết tụ chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu 19 3.1.1 Kết hợp hai tá dược tạo gel công thức chế phẩm 20 3.1.2 Bào chế chế phẩm có tỉ lệ tá dược tạo gel khác 21 3.1.3 Khảo sát trình kết tụ công thức thông qua độ lắng 22 3.2 Đánh giá số đặc tính cơng thức hiệu chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu khảo sát 26 3.2.1 Khả phân tán nguyên liệu hỗn dịch 26 3.2.2 Thời gian phân liều 28 3.2.3 Khả sống sót vi sinh vật 30 3.2.4 Khảo sát kích thước phân bố tiểu phân công thức CT-0, CT8, CT-26.5, CT-27.3 35 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Al tristearat : Nhôm tristearat aw : Hoạt độ nước CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units) CT : Công thức FAO : Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (The Food and Agriculture Organization of the United Nations) L acidophilus : Lactobacillus acidophilus LD50 : Lượng độc tố gây chết 50% nhóm động vật ngày MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Shape) PBS : Dung dịch đệm photphat (Phosphate Buffered Saline) s : giây SD : độ lệch chuẩn WHO : Tổ chức y tế giới (World Health Orgnization) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Môi trường MRS thạch 14 Bảng 3.1 Công thức ban đầu (CT-0) bào chế probiotic dạng hỗn dịch dầu 19 Bảng 3.2 Các công thức với khoảng hàm lượng tá dược thay đổi 25% 21 Bảng 3.3 Kết lắng mẫu có khoảng hàm lượng tá dược thay đổi 25% 23 Bảng 3.4 Các công thức với khoảng hàm lượng tá dược thay đổi 5-10% 24 Bảng 3.5 Kết thời gian nhỏ giọt chế phẩm từ CT-0 đến CT-27.5 CT-28 29 Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật số công thức sau bào chế 32 Bảng 3.7 Số lượng vi sinh vật công thức sau tháng 33 Bảng 3.8 Số lượng vi sinh vật công thức 26.5 27.3 sau tháng 33 Bảng 3.9 So sánh cảm quan kích thước trung bình tiểu phân cơng thức 37 Bảng 3.10 Công thức đề xuất theo tiêu chí khóa luận 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn L acidophilus kính hiển vi Hình 1.2 Sản phẩm probiotic Imiale Hình 1.3 Sản phẩm probiotic BioGaia ProTectis Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo Al tristearat 10 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo Aerosil 11 Hình 2.1 Hình ảnh minh họa hỗn dịch lắng xuống 18 Hình 3.1 Cơng thức chứa vi sinh vật dầu hướng dương 19 Hình 3.2 Chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu chứa loại chất tạo gel 20 Hình 3.3 Các cơng thức với khoảng hàm lượng tá dược thay đổi 25% 22 Hình 3.4 Chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu từ CT-0 đến CT-8 sau tháng 23 Hình 3.5 Các công thức với khoảng hàm lượng tá dược thay đổi 5-10% sau tháng 25 Hình 3.6 Độ lắng công thức khoảng khảo sát 5-10% sau tháng 26 Hình 3.7 Kết mẫu đánh giá khả phân tán 27 Hình 3.8 Thời gian phân liều chế phẩm từ CT-0 đến CT-27.5 29 Hình 3.9 Khuẩn lạc L acidophilus môi trường thạch sau 48h 31 Hình 3.10 Hình ảnh tiểu phân kính hiển vi 40x công thức CT-0, CT-8, CT-26.5, CT-27.3 36 Hình 3.11 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-8 37 Hình 3.12 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-26.5 38 Hình 3.13 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-27.3 38 Hình 3.14 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-0 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic vi khuẩn sống đưa vào thể với số lượng đủ lớn sinh hiệu có lợi cho sức khỏe [22] Hiện nay, lợi khuẩn (probiotic) ứng dụng nhiều lĩnh vực sức khỏe Nhiều nghiên cứu sử dụng probiotic thường xuyên giúp thúc đẩy hệ thống tiêu hóa khỏe mạnh hơn, điều dẫn đến gia tăng loại thực phẩm chức giàu lợi khuẩn [3] Việc lựa chọn chủng vi sinh vật để sử dụng chế phẩm sinh học hiệu trình phức tạp Lactobacillus acidophilus vi khuẩn lactic thuộc chi Lactobacillus, ưu mang đặc tính probiotic [47] có lịch sử sử dụng lâu dài chế phẩm sinh học mà khơng có nguy gây hại cho người [40] Tuy nhiên, lợi ích probiotic bị khả tồn chúng giảm đáng kể đối mặt với yếu tố mơi trường (khơng khí, nhiệt độ, độ ẩm…) yếu tố từ đường tiêu hóa (pH dày, muối mật, enzym miệng ) [49] Hơn nữa, vấn đề bào chế thuốc cho trẻ em từ lâu nghiên cứu, thảo luận bàn cãi nhiều Đặc biệt nước ta, trẻ em chiếm gần phần tư dân số số lượng chế phẩm thuốc xí nghiệp dược phẩm sản xuất dành cho trẻ em [2] Vì vậy, cần dạng bào chế để đáp ứng yêu cầu Probiotic dạng hỗn dịch dầu sản phẩm lý tưởng để cung cấp lợi khuẩn sống cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ ưu điểm vượt trội khả lưu trữ vi sinh vật không sinh bào tử Lactobacillus acidophilus thuận tiện sử dụng mà mang lại Chất tạo gel chất giúp cố định phân tán vi sinh vật Chúng đóng vai trị quan trọng việc hình thành lên cấu trúc hỗn dịch dầu chế phẩm Tiếp nối kế thừa nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu probiotic dạng hỗn dịch dầu, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng chất tạo gel lên trình tạo hỗn dịch probiotic chứa Lactobacillus acidophilus cho trẻ em” thực với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát tỉ lệ hàm lượng hai chất tạo gel (Nhôm tristearat Aerosil) ảnh hưởng đến trình kết tụ chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu Đánh giá số đặc tính cơng thức hiệu chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu khảo sát CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Định nghĩa probiotic “Probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp có nghĩa “dành cho sống” [33] Thuật ngữ định nghĩa lại sau nhiều năm kể từ lĩnh vực cơng nghệ sinh học nói chung kiến thức mối quan hệ probiotic với sức khỏe đường tiêu hóa nói riêng có tiến định Sau định nghĩa "probiotic" từ FAO/WHO: “Probiotic vi sinh vật sống bổ sung lượng vừa đủ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [22] 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến Hiện chủng probiotic sử dụng phổ biến vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium nấm men Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae [33] Thông tin thu cho thấy Lactobacillus có lịch sử sử dụng lâu dài chế phẩm sinh học mà khơng có nguy gây hại cho người chứng an toàn chúng [40], [45] Ngoài ra, khơng có đặc tính gây bệnh độc lực tìm thấy Lactobacillus, Bifidobacteria Lactococci [10] Ngày nhiều sản phẩm chứa probiotic sản xuất cho người tiêu dùng mà chủ yếu sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus Bifidobacterium làm nguyên liệu [22], [33] 1.1.3 Đặc tính quan trọng probiotic Các tính chất quan trọng chủng giống để sử dụng sản xuất probiotic bao gồm: • Đề kháng với điều kiện dày acid muối mật • Bám dính vào chất nhầy và/hoặc tế bào biểu mơ người • Có khả sinh chất có tác dụng kháng khuẩn chống lại mầm bệnh tiềm ẩn • Ức chế dịch chuyển bám dính mầm bệnh • Điều hịa hệ thống miễn dịch • Có hoạt tính hydrolase muối mật • Có hoạt động glycosidase [33] Mặc dù vi sinh vật mang đặc tính có lợi người để phát huy tác dụng lợi khuẩn, thông thường chế phẩm probiotic cần phải chứa tối thiểu 106 CFU/mL (số đơn vị khuẩn lạc/mL) tế bào vi sinh vật sống tổng cộng khoảng 108-109 lợi khuẩn tiêu thụ hàng ngày [31] 1.1.4 Vai trò probiotic lâm sàng 1.1.4.1 Đối với hệ tiêu hóa Nhiều nghiên cứu tác dụng probiotic liên quan đến phòng điều trị rối loạn tiêu hóa cho thấy khả ngăn chặn làm giảm triệu chứng bệnh tiêu chảy, táo bón, bệnh viêm ruột, chứng dị ứng lactose, bệnh nhiễm trùng đường ruột hội chứng kích ứng ruột [12], [48] Probiotic chứng minh có khả điều trị vấn đề tiêu hóa sau sử dụng kháng sinh [12], [22] Một vấn đề liên quan đến việc sử dụng kháng sinh xuất tiêu chảy, viêm dày ruột thường Clostridium difficile gây Có chứng chủng Lactobacillus cụ thể có hiệu việc ngăn ngừa tái phát viêm đại tràng giả mạc gây Clostridium difficile bệnh nhân điều trị với kháng sinh [23] Số lượng Helicobacter pylori giảm sử dụng probiotic Dữ liệu in vitro động vật vi khuẩn sinh acid lactic ức chế phát triển mầm bệnh làm giảm hoạt động enzym urease cần thiết để mầm bệnh tồn mơi trường acid dày [12], [22] Probiotic cân hệ vi sinh vật cho trẻ nhỏ việc bổ sung 108 CFU/liều [9], ức chế hại khuẩn, chiếm vị trí bám vào thành ruột từ hạn chế bệnh liên quan đến đường tiêu hóa nhi khoa Lợi khuẩn thúc đẩy hấp thu chuyển hóa thể Mặc dù vi sinh vật có kích thước nhỏ chúng lại có lực hấp thu chuyển hóa vượt xa vi sinh vật khác Chẳng hạn vi khuẩn lactic phân giải lượng đường lactose lớn 100-10.000 lần so với khối lượng chúng [5] Khi trẻ nhỏ uống lượng đủ probiotic hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, tăng cảm giác đói cảm giác thèm ăn 1.1.4.2 Đối với hệ miễn dịch Hỗ trợ giảm dị ứng tạo hợp chất kháng độc tố [50], thúc đẩy chức hàng rào đường ruột thông qua việc phục hồi vi sinh vật bình thường thúc đẩy sản xuất kháng thể IgE [8] Tăng cường miễn dịch, kích thích hoạt động đại thực bào chống lại số loài vi khuẩn khác [12], [23], [27] 1.1.4.3 Đối với hệ quan khác Có chứng sơ cho thấy việc sử dụng probiotic sản phẩm chuyển hóa probiotic có khả mang lại lợi ích cho số hệ quan tim mạch tiết niệu bao gồm phòng ngừa điều trị hội chứng thiếu máu tim khác [46], giảm cholesterol máu [20], nhiễm nấm Candida nhiễm trùng đường tiết niệu [44] Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật số công thức sau bào chế Công thức 27.3 26.4 27.2 26.5 Lần đếm Số lượng khuẩn lạc/nồng độ pha Kết Trung loãng (log bình (log CFU/liều) 10-3 10-4 10-5 10-6 CFU/liều) 170 36 7,08 118 20 6,94 180 41 7,37 >300 100 16 7,81 >300 96 18 7,80 >300 125 11 7,86 >300 108 19 7,82 >300 188 25 8,02 >300 138 23 7,89 >300 119 24 7,95 >300 108 28 8,17 >300 150 41 8,04 7,13 ± 0,22 7,82 ± 0,03 7,91 ± 0,10 8,05 ± 0,11 Chú thích: >300 quy ước số lượng khuẩn lạc nhiều nhỏ Nhận xét: Lượng vi sinh vật thu hỗn dịch bào chế mẫu có độ ổn định tốt đạt ~ log CFU/liều tương ứng với 108 CFU/liều, đáp ứng tốt yêu cầu chế phẩm probiotic cho trẻ em nêu mục 1.1.3 Trong đó, CT-26.5 có số lượng vi sinh vật thu cao với 8,05 ± 0,11 log CFU/liều Như nêu mục 1.4.2.2, nguyên liệu đông khô ban đầu chứa 3×10 10 CFU/g tương ứng với 8,18 log CFU/liều theo nhà sản xuất công bố Khi kiểm tra lại số lượng vi sinh vật ban đầu theo phương pháp pha loãng liên tục nêu mục 2.3.3.1 cho kết xấp xỉ số lượng bao bì Vì số lượng vi sinh vật mẫu kiểm tra đạt kết tốt 32 Bảng 3.7 Số lượng vi sinh vật công thức sau tháng Công thức 27.3 26.4 27.2 26.5 26.5 (giữ lạnh) Lần đếm Số lượng khuẩn lạc/nồng độ pha Kết Trung bình lỗng (log (log CFU/liều) 10-3 10-4 10-5 10-6 CFU/liều) 19 6,69 23 0 6,03 20 2 6,60 122 6,69 160 25 7,30 >300 65 7,59 140 227 >300 14 23 62 0 6,84 7,10 174 22 1 7,27 143 23 7,11 216 54 0 7,28 >300 126 14 7,78 >300 131 19 7,94 >300 128 16 7,99 6,44 ± 0,36 7,19 ± 0,46 7,16 ± 0,36 7,55 7,22 ± 0,10 7,90 ± 0,11 Chú thích: >300 quy ước số lượng khuẩn lạc nhiều nhỏ CT-26.5 (giữ lạnh) bảo quản tủ lạnh từ làm Bảng 3.8 Số lượng vi sinh vật công thức 26.5 27.3 sau tháng Công thức 26.5 27.3 Số lượng khuẩn lạc/nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 10-6 Kết (log CFU/liều) 60 0 6,44 43 0 6,32 47 6,75 52 6,48 56 0 6,42 32 0 6,11 Lần đếm 33 Trung bình (log CFU/liều) 6,50 ± 0,22 6,34 ± 0,20 Nhận xét: Số lượng vi sinh vật xác định sau khoảng tháng (30 ngày) cho kết số lượng thấp so với mẫu đếm Ngay bào chế xong có kết từ 7,13-8,05 log CFU/liều, sau tháng từ 6,44-7,22 log CFU/liều, số lượng giảm khoảng 5-10 lần so với ban đầu Các mẫu đếm sau tháng (60 ngày) số lượng vi sinh vật giảm rõ rệt, lại ~ log CFU/liều tương ứng với 106 CFU/liều Tuy nhiên, kết đáp ứng yêu cầu tối thiểu chế phẩm probiotic cho trẻ em nêu mục 1.1.3 Nổi bật công thức 26.5 bảo quản điều kiện lạnh cho số lượng vi sinh vật trì ổn định từ 8,05 ± 0,11 log CFU/liều xuống 7,90 ± 0,11 log CFU/liều; giảm 1,4 lần sau tháng bảo quản Bên cạnh đó, cơng thức 26.5 bảo quản lạnh (7,90 ± 0,11 log CFU/liều) cho số lượng vi sinh vật lớn so với công thức 26.5 bảo quản điều kiện thường (7,22 ± 0,10 log CFU/liều) với số lượng giảm 6,8 lần với ban đầu sau tháng Bàn luận: Số lượng vi sinh vật xác định giảm sau 1-2 tháng nguyên nhân nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng trình sử dụng chế phẩm đa liều Về nhiệt độ, thực tế sau sản xuất, chế phẩm bảo quản phịng thí nghiệm nhiệt độ thường, chịu dao động nhiệt độ lên xuống theo thời tiết Từ kết bảng 3.7, CT-26.5 bảo quản lạnh cho kết tốt cho thấy nhiệt độ tăng cao có ảnh hưởng bất lợi đến ổn định vi sinh vật Trong số nghiên cứu trước sản phẩm probiotic bảo quản mát khả tồn lợi khuẩn cao [39], [50] Số lượng vi sinh vật giảm xuống ảnh hưởng độ ẩm hoạt độ nước (aw) Độ ẩm tăng cao làm vi sinh vật trở lại trạng thái hoạt động, sinh trưởng, già hóa dần chết Trong nghiên cứu S.K.Mody năm 2019, ông hỗn dịch dầu chứa lợi khuẩn ổn định aw nằm khoảng 0,001 đến 0,35 aw [39] Trong số nghiên cứu khác đề cập tới vấn đề giảm độ ổn định chế phẩm đa liều trình sử dụng [17], [32] Chế phẩm giảm mạnh số lượng tế bào vi sinh vật sau tháng việc mở nắp làm oxy, khơng khí hay yếu tố mơi trường bên ngồi xâm nhập vào chế phẩm làm chết vi sinh vật Kết luận: Có giảm số lượng vi sinh vật theo thời gian mẫu Sau 60 ngày, công thức 26.5, 27.3 đạt yêu cầu tối thiểu số lượng vi sinh vật cịn sống sót cơng thức 34 3.2.4 Khảo sát kích thước phân bố tiểu phân công thức CT-0, CT-8, CT26.5, CT-27.3 Hỗn dịch hệ dị thể chứa chất rắn không tan Khi loại thuốc tổng hợp bào chế, kích thước hạt thuốc loại bột xác định ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý hay cấu trúc chế phẩm [13] Mục đích thử nghiệm nhằm so sánh công thức lựa chọn với cơng thức có hàm lượng tá dược (CT-8) hàm lượng tá dược cao (CT-0) Cách tiến hành: Lắc mẫu đem đo, dùng đầu lấy xác lượng dịch 30,00 µL cách bề mặt thống 5cm, đưa lên kính hiển vi gắn camera Eclipse CiL Các mẫu chụp hình ảnh vật kính 40x, lấy kết lần vị trí khác Phân tích hình ảnh phần mềm Imagej cho kết kích thước tiểu phân Phép đo thực ~ 100 tiểu phân xác định giá trị kích thước trung bình tiến hành vẽ đồ thị phân bố kích thước tiểu phân qua phần mềm Origin để biểu diễn tỷ lệ phân bố Kết quả: (CT-8) (CT-26.5) 35 (CT-27.3) (CT-0) Hình 3.10 Hình ảnh tiểu phân kính hiển vi vật kính 40x công thức CT-0, CT-8, CT-26.5, CT-27.3 Nhận xét: Tiểu phân công thức lựa chọn (CT-26.5, CT-27.3) có hình dáng cầu đều, lớp cắt hình ảnh kính hiển vi mỏng Cơng thức CT-8 có lượng tá dược (50% loại so với công thức ban đầu) tiểu phân mang nhiều hình dạng khác nhau, có mảng tụ lại Cịn với cơng thức ban đầu CT-0 với nhiều lượng tá dược công thức lại cho phân bố tiểu phân dày dính vào Tiến hành thực từ mẫu có hàm lượng tá dược thấp đến mẫu có hàm lượng tá dược cao, thấy lựa chọn mẫu lựa chọn (CT-26.5, CT-27.3) cho kết tốt 36 Bảng 3.9 So sánh cảm quan kích thước trung bình tiểu phân cơng thức Cơng thức CT-8 Cảm quan hình ảnh cơng thức Tiểu phân chỗ nhiều chỗ ít, kích thước to nhỏ khơng đồng Kích thước trung bình (µm) (x̅ ± SD) 3,87 ± 2,82 CT-26.5 Tiểu phân phân bố đều, kích thước đồng 3,17 ± 1,19 CT-27.3 Tiểu phân phân bố đều, kích thước tương đối đồng 3,88 ± 1,57 CT-0 Tiểu phân xếp chồng lên nhau, kích thước lớn 4,91 ± 2,13 Nhận xét: Kích thước trung bình CT-26.5 CT-27.3 tương ứng 3,17 µm 3,88 µm nhỏ kích thước mẫu CT-0 Mặc dù kích thước trung bình CT-8 3,87 µm lại có SD lớn (2,82 µm) tức có chênh lệch lớn kích thước tiểu phân với Trong đó, SD mẫu chọn CT-26.5 CT-27.3 tương ứng 1,19 µm 1,57 µm nhỏ công thức cịn lại Sau xác định giá trị kích thước tiểu phân ~ 100 tiểu phân ngẫu nhiên ta thu đồ thị phân bố kích thước sau: Hình 3.11 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-8 37 Hình 3.12 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-26.5 Hình 3.13 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-27.3 Hình 3.14 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cơng thức CT-0 38 Nhận xét: Biểu đồ phân bố CT-26.5 CT-27.3 có phân bố gần phân bố chuẩn Khoảng phân bố kích thước CT-26.5 kéo dài từ đến µm CT-27.3 kéo dài từ đến µm hẹp so với cơng thức cịn lại CT-0 CT-8 (từ đến 12 µm) Bàn luận: Việc phân bố kích thước tiểu phân khơng đồng xuất tiểu phân kích thước lớn ảnh hưởng khơng tốt đến hỗn dịch đặc tính dịng chảy (flow rheology) hỗn dịch [50] Kết luận: Kiểm tra phân bố kích thước tiểu phân thấy cơng thức CT-26.5, CT-27.3 có phân bố tốt Từ kết trình bày khóa luận đề xuất công thức phù hợp với thông số đánh giá: Bảng 3.10 Công thức đề xuất theo tiêu chí khóa luận Hàm lượng tá dược Thành phần CT-26.5 CT-27.3 Dầu hướng dương 100 ml 100 ml Nhôm tristearat 1,58 g 1,58 g Aerosil 0,45 g 0,38 g Vi sinh vật đông khô 2,00 g 2,00 g 39 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đạt mục tiêu đề có số kết luận sau: 4.1.1 Đã khảo sát tỉ lệ hàm lượng hai chất tạo gel (Nhơm tristearat Aerosil) ảnh hưởng đến q trình kết tụ chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu - Cần phối hợp tá dược Al tristearat Aerosil - Công thức cho độ lắng tốt gồm bốn công thức với hàm lượng thành phần: CT-26.4 (1,75g Al tristearat; 0,45g Aerosil; 100 ml dầu hướng dương; 2,00g vi sinh vật) CT-26.5 (1,58g Al tristearat; 0,45g Aerosil; 100 ml dầu hướng dương; 2,00g vi sinh vật) CT-27.2 (1,75g Al tristearat; 0,38g Aerosil; 100 ml dầu hướng dương; 2,00g vi sinh vật) CT-27.3 (1,58g Al tristearat; 0,38g Aerosil; 100 ml dầu hướng dương; 2,00g vi sinh vật) 4.1.2 Đã đánh giá số đặc tính cơng thức hiệu chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu khảo sát - Khả phân tán: công thức 26.4, 26.5, 27.2, 27.3 cho khả phân tán nguyên liệu dung môi tốt - Thời gian phân liều: loại công thức 26.4 27.2 có thời gian phân liều cao, lựa chọn cơng thức phù hợp CT-26.5, CT-27.3 - Khả sống sót vi sinh vật: Có giảm số lượng vi sinh vật theo thời gian mẫu Sau 60 ngày bào chế, công thức 26.5, 27.3 đạt yêu cầu tối thiểu số lượng lợi khuẩn sống sót cơng thức - Kích thước phân bố tiểu phân: CT-26.5, 27.3 có phân bố tốt 4.2 Đề xuất Bên cạnh kết đạt được, thời gian có hạn, đề tài xin đưa số đề xuất nhằm hoàn thiện phát triển đề tài sau: Xác định số lượng vi sinh vật cịn sống sót thời gian dài điều kiện nhiệt độ bảo quản khác Đánh giá chế phẩm điều kiện in vitro tương tự đường tiêu hóa người đánh giá hiệu chế phẩm điều kiện in vivo Tiếp tục nghiên cứu sản xuất hỗn dịch dầu chứa L acidophilus kết hợp thêm vi sinh vật khác 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Bào chế (2020), Bào chế Sinh Dược học, Tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.106, 136, 169-183, 239 Bộ Môn Bào Chế (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 188-288 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, PL 414, 535 Bộ Y tế (2006), Kỹ thuật Bào chế sinh dược học dạng thuốc, Tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.273-276 Nguyễn Lân Dũng (2010), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr.10, 90-94 Nguyễn Thị Hoa (2021), Khảo sát khả sống sót Lactobacillus acidophilus dầu, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr.30-40 Võ Thị Thúy Huệ (2018), "Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn acid lactic vi khuẩn acid acetic tham gia vào trình lên men hạt ca cao", Bản B Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 60(8), tr 55-60 Tiếng Anh Kalliomaki, M., et al (2001), "Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial", Lancet, 357(9262), pp 1076-9 Mogna, L., Del Piano, M., Mogna, G (2014), "Capability of the two microorganisms Bifidobacterium breve B632 and Bifidobacterium breve BR03 to colonize the intestinal microbiota of children", J Clin Gastroenterol, 48 Suppl 1, pp S37-9 10 Aguirre, M., Collins, M.D (1993), "Lactic acid bacteria and human clinical infection", J Appl Bacteriol, 75(2), pp 95-107 11 Arquette, D., et al (1997), "A natural oil made to last: A high-oleic sunflower seed oil gives high oxidative stability in a natural oil", Cosmetics & Toiletries, 112(1), pp 67-72 12 Arvola, T., et al (1999), "Prophylactic Lactobacillus GG Reduces antibioticassociated Diarrhea in children with respiratory infections: a randomized study", Pediatrics, 104(5), pp e64-e64 13 Aulton, M.E (1989), Pharmaceutics: The science of dosage form design, Churchill Livingstone, Edinburgh, pp 141-174, 307-342 14 Barros, F.M.F., et al (2018), "Effect of the hydrophobicity of fumed silica particles and the nature of oil on the structure and rheological behavior of Pickering emulsions", Journal of Dispersion Science and Technology 15 Bull, M., et al (2013), "The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success", FEMS microbiology letters, 349(2), pp 77-87 16 Champagne, C., Kailasapathy, K (2008), Controlled Release Technologies for Targeted Nutrition, Woodhead Publishing, Cambridge, UK 17 Chavda, H (2021), "In-use stability studies: guidelines and challenges", Drug Dev Ind Pharm, 47(9), pp 1373-1391 18 ChemSrc (2022), Silica gel, ChemSrc.com, China, accessed June 22-2022, from https://www.chemsrc.com/en/cas/112926-00-8_732404.html 19 Daniels, R., et al (1986), "The stability of drug adsorbates on silica", Drug development industrial pharmacy, 12(11-13), pp 2127-2156 20 De Roos, N.M., Katan, M.B (2000), "Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 1998", The American journal of clinical nutrition, 71(2), pp 405-411 21 Ding, W., Shah, N.P (2009), "Effect of various encapsulating materials on the stability of probiotic bacteria", Journal of food science, 74(2), pp M100-M107 22 FAO/WHO (2001), Health and Nutrition Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation Cordoba 23 Fuller, R.J.G (1991), "Probiotics in human medicine", National Library of Medicine, 32, pp 439-442 24 Gehrman, S.H., Porubcan, R.S (1985), Stabilized liquid bacterial suspension for oral administration to animals, Google Patents, US4518696A 25 Haghshenas, B., et al (2015), "Bioactivity characterization of Lactobacillus strains isolated from dairy products", MicrobiologyOpen, 4(5), pp 803-813 26 Haug, A., Foy, C.E (1984), "Molecular aspects of aluminum toxicity", Critical Reviews in Plant Sciences, 1(4), pp 345-373 27 Hazebrouck, S., et al (2006), "Constitutive delivery of bovine beta-lactoglobulin to the digestive tracts of gnotobiotic mice by engineered Lactobacillus casei", Applied and Environmental Microbiology, 72(12), pp 7460-7467 28 Helf, S., White, C., Shelley, R (1960), "Radioassay of Finely Divided Solids by Suspension in Gel Scintillator", Analytical Chemistry, 32(2), pp 238-241 29 Jha, P.K., Mahto, V., Saxena, V (2016), "Study the effects of xanthan gum and aluminium stearate on the properties of oil-in-water emulsion drilling fluids", Arabian Journal for Science Engineering, 41(1), pp 143-153 30 Karaffa, L.S (2013), The Merck index: an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals, RSC Publishing, London, 64-75 31 Kechagia, M., et al (2013), "Health benefits of probiotics: a review", ISRN Nutrition, 2013 32 Lee, H., et al (2022), "Regulatory and safe-use considerations related to stability after opening of nonsterile dosage forms", Journal of Pharmaceutical Investigation, pp 319-329 33 Lee, Y.K., Salminen, S (2009), Handbook of probiotics and prebiotics, John Wiley & Sons, USA, 4, pp 3-98 34 Lewis, R.J., Sax, N (1996), "Sax’s dangerous properties of industrial materials", New York, 35 Lieu, D.M., Van Bui, H., Nguyen, H.T (2015), "Enhanced survival of spray-dried microencapsulated Lactobacillus casei in the presence of mix-prebiotic", Science Technology Development Journal, 18(2), pp 65-74 36 Mahato, R.I., Narang, A.S (2018), Pharmaceutical dosage forms and drug delivery, CRC Press, USA, 387-404 37 Medicago, A.B Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 and 7.2, accessed June 26-2021, from http://www.medicago.se/sites/default/files/pdf/productsheets/PBS_Buffer_v._01.pdf 38 Memarzadeh, F., Olmsted, R.N., Bartley, J.M (2010), "Applications of ultraviolet germicidal irradiation disinfection in health care facilities: effective adjunct, but not stand-alone technology", American journal of infection control, 38(5), pp S13-24 39 Mody, S.K., Naqvi, S.H (2019), Stable probiotic suspensions, Google Patents, US20190133941A1 40 Naidu, A.S., Bidlack, W.R., Clemens, R.A (1999), "Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB)", Crit Rev Food Sci Nutr, 39(1), pp 13-126 41 National Center for Biotechnology Information (2022), PubChem Compound Summary for CID 12496, Aluminium stearate, PubChem, USA, accessed June 22-2022, from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Aluminium-stearate 42 Pavan, S., Desreumaux, P., Mercenier, A (2003), "Use of mouse models to evaluate the persistence, safety, and immune modulation capacities of lactic acid bacteria", Clinical Vaccine Immunology, 10(4), pp 696-701 43 Raymond C Rowe, P.J.S.a.M.E.Q (2009), Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association London, Chicago, pp 35185-721-722 44 Reid, G (1999), "The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus", Applied Environmental Microbiology, 65(9), pp 3763-3766 45 Saxelin, M., et al (1996), "Safety of commercial products with viable Lactobacillus strains", Infectious Diseases in Clinical Practice, 5(5), pp 331-335 46 Sharma, S., Agarwal, N., Verma, P (2012), "Probiotics: the emissaries of health from microbial world", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2(1), pp 138-143 47 Strozzi, G.P., Mogna, L (2012), Oily suspension containing probiotic bacteria for paerosildiatric uses, Google Patents, US20120058095A1 48 Yan, F., Polk, D.B (2010), "Probiotics: progress toward novel therapies for intestinal diseases", Current Opinion in Gastroenterology, 26(2), pp 95-101 49 Yao, M., et al (2020), "Progress in microencapsulation of probiotics: A review", Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 19(2), pp 857-874 50 Ferreira, J.J.P.T., Olhero, S (2004), "Influence of particle size distribution on rheology and particle packing of silica-based suspensions", Powder Technology, 139(1), pp 69-75 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN DIỆU LÝ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT TẠO GEL LÊN QUÁ TRÌNH TẠO HỖN DỊCH PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus CHO TRẺ EM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 ... dạng hỗn dịch dầu, đề tài ? ?Khảo sát ảnh hưởng chất tạo gel lên trình tạo hỗn dịch probiotic chứa Lactobacillus acidophilus cho trẻ em? ?? thực với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát tỉ lệ hàm lượng hai chất. .. chất tạo gel yêu cầu chất lượng cho sản phẩm hỗn dịch kết hợp với nghiên cứu trước chế phẩm dạng giọt dầu tạo tảng cho khóa luận tiếp cận hướng nghiên cứu ? ?Khảo sát ảnh hưởng chất tạo gel lên trình. .. phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu chứa loại chất tạo gel Chú thích: Chế phẩm (A): hỗn dịch dầu chứa tá dược Aerosil; (B): hỗn dịch dầu chứa tá dược Al tristearat Nhận xét: Từ hình 3.2 quan sát