LƯU THÀNH CÔNG NGHIÊN cứu điều CHẾ CAO đặc dược LIỆU hòe GIÁC GIÀU SOPHORICOSID KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯU THÀNH CÔNG Mã sinh viên : 1701061 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU HỊE GIÁC GIÀU SOPHORICOSID KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ vô đỡ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu bạn bè gia đình Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện dạy dỗ em suốt năm học vừa qua Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người tận tình hướng dẫn, ln quan tâm, bảo cách sát tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm thực nghiệm Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân người bạn bên cạnh, đồng hành ủng hộ em suốt trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 27 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Lưu Thành Công MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN Vị thuốc Hòe giác 1.1.1 Vị trí, phân loại đặc điểm thực vật Hòe 1.1.2 Bộ phận dùng 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng công dụng theo y học cổ truyền 1.1.5 Tác dụng sinh học sophoricosid có dược liệu Hịe giác 1.1.6 Định tính, định lượng Phương pháp điều chế cao đặc 1.2.1 Định nghĩa cao thuốc 1.2.2 Đặc điểm cao thuốc 1.2.3 Yêu cầu chất lượng cao thuốc 1.2.4 Phương pháp điều chế cao 1.2.5 Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa thí nghiệm dựa mạng neuron nhân tạo CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Thiết bị, máy móc 12 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 12 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Xác định độ ẩm, tính đặc hiệu xây dựng đường chuẩn định lượng cao đặc vị thuốc Hòe giác 13 2.2.2 Nghiên cứu điều chế cao đặc Hòe giác 15 Xử lý số liệu 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 Xác định tính đặc hiệu xây dựng đường chuẩn định lượng cao đặc Hòe giác 18 3.1.1 Tính đặc hiệu phương pháp 18 3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 19 Nghiên cứu bào chế cao đặc 21 3.2.1 Xác định độ ẩm hàm lượng SPH mẫu dược liệu Hòe giác 21 3.2.2 Kết khảo sát thông số điều chế cao 21 3.2.3 Thiết kế thí nghiệm 23 3.2.4 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất 25 3.2.5 Xác định giá trị tối ưu biến độc lập kiểm chứng mơ hình 27 CHƯƠNG BÀN LUẬN 30 Tối ưu hóa hàm lượng hiệu suất chiết sophoricosid (SPH) thiết kế thí nghiệm nhằm đảm bảo an toàn hiệu vị thuốc Hịe giác 30 Lựa chọn kích thước dược liệu để chiết xuất bào chế cao đặc Hịe giác 30 Lựa chọn dung mơi chiết với hỗn hợp ethanol- nước khoảng nồng độ 5090% để thiết kế thí nghiệm 31 Lựa chọn điều kiện chiết xuất khác (tỷ lệ DM/DL, thời gian chiết số lần chiết) để chiết xuất bào chế cao đặc 31 Chọn mơ hình xử lý liệu 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT ANN Artificial Neural Network DĐVN Dược điển Việt Nam DĐTQ Dược điển Trung Quốc DM/DL Dung môi/Dược liệu EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Chromatography MeOH Methanol SKLM Sắc ký lớp mỏng SPH Sophoricosid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Cách pha, nồng độ kết mẫu chuẩn A-E 19 Bảng 3.2 Kết định lượng SPH mẫu dược liệu Hòe giác 21 Bảng 3.3 Khảo sát kích thước dược liệu Hòe giác 21 Bảng 3.4 Khảo sát dung môi 22 Bảng 3.5 Khoảng biến thiên biến độc lập 23 Bảng 3.6 Yêu cầu biến phụ thuộc 23 Bảng 3.7 Thiết kế thí nghiệm kết biến phụ thuộc 24 Bảng 3.8 Kết đánh giá mạng neuron nhân tạo 25 Bảng 3.9 Giá trị hàm hy vọng tuyến tính theo biến phụ thuộc 27 Bảng 3.10 Giá trị dự đoán kết thực nghiệm kiểm chứng (n = 3) 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học sophoricosid (SPH) Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc điển hình ANN Hình 1.3 Sơ đồ bước tối ưu hóa quy trình chiết xuất mạng neuron nhân tạo 11 Hình 2.1 Sơ đồ bào chế cao đặc 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu 18 Hình 3.2 Phổ mẫu thử mẫu chuẩn SPH 18 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic 19 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (A, B, C, D, E) 20 Hình 3.5 Sơ đồ mạng neuron nhân tạo 25 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn biến thiên biến phụ thuộc theo biến độc lập giá trị hàm hy vọng 26 Hình 3.7 Khơng gian thiết kế theo Nồng độ ethanol Thời gian chiết (vùng màu trắng) (Tỷ lệ DM/DL = 9; Số lần chiết = 2) 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Hịe giác chín phơi sấy khơ Hịe (Sophora japonica L.), thường thu hoạch vào mùa đơng Vị thuốc Hịe giác sử dụng Y dược học cổ truyền, có cơng nhiệt giáng hỏa, lương huyết huyết, chủ trị nhiệt đường ruột gây đại tiện huyết, trĩ xuất huyết, can nhiệt gây đau đầu, chóng mặt, mắt đỏ [18] Sophoricosid (SPH) isoflavon glycosid, thành phần hoạt chất Hịe giác, có tác dụng chống viêm, chống dị ứng [25], [28], [29], [33]; chống oxy hóa bảo vệ gan [22], [30]; cầm máu, chống béo phì, chống khối u, chống bệnh trĩ [25]; ngồi cịn có tác dụng làm tăng tạo xương, giảm hủy xương, giảm tình trạng lỗng xương phụ nữ mãn kinh [13], [21]… Do vậy, việc nghiên cứu chiết xuất nhằm thu cao đặc có hàm lượng hiệu suất chiết SPH cao cần thiết, đóng vai trị quan trọng định chất lượng cao đặc vị thuốc Hòe giác Từ trước đến nay, phương pháp sắc phương pháp phổ biến thông dụng dân gian áp dụng để sử dụng vị dược liệu, có Hịe giác Tuy nhiên, phương pháp sắc lại gây nhiều bất tiện sử dụng, đặc biệt tốn nhiều thời gian khó bảo quản Với mong muốn phát huy tính ưu việt thuốc cổ truyền, tiện lợi cho người bệnh, việc nghiên cứu điều chế phương thuốc thành dạng bào chế đại, cao đặc Hòe giác sử dụng nhiều làm bán thành phẩm để tiếp tục bào chế thành dạng thành phẩm bột cốm, viên nang, viên nén để người dùng dễ dàng sử dụng Phương pháp thiết kế thí nghiệm (experimental design) lựa chọn điều kiện tối ưu dựa nguyên tắc mạng neuron nhân tạo (artificial neural network- ANN), với hỗ trợ phần mềm máy tính [31] cơng cụ hiệu việc tối ưu hóa q trình chiết xuất Từ lý trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc dược liệu Hòe giác giàu sophoricosid” nghiên cứu với mục tiêu: “Tối ưu hóa quy trình chiết xuất để điều chế cao đặc Hịe giác có hàm lượng hiệu suất chiết sophoricosid cao” CHƯƠNG TỔNG QUAN Vị thuốc Hịe giác 1.1.1 Vị trí, phân loại đặc điểm thực vật Hòe Vị trí phân loại: Cây Hịe có tên khoa học Sophora japonica (L.), syn Styphnolobium japonicum (L.) Schott, phân loại thực vật học sau [3],[35]: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae = Leguminosae) Phân họ Đậu (Faboideae = Papilionoideae) Chi Sophora (= Styphnolobium) Loài Sophora japonica L Đặc điểm thực vật: gỗ, to, cao đến 15 m, thân thẳng có chỏm tròn, vỏ nứt nẻ, màu nâu sẫm Cành nằm ngang, hình trụ, nhẵn, cong queo, màu lục nhạt có chấm trắng Lá kép lơng chim lẻ, mọc so le, có – 13 chét mọc đối, hình trứng, đỉnh nhọn, gốc trịn, ngun, dài cm, rộng 1,5 – 2,5 cm, màu lục nhạt, mặt dưới, có lơng, có kèm Cụm hoa hình chùy đầu cành, dài 20 cm, phân nhánh nhiều Hoa lưỡng tính, khơng đều, nhỏ, màu trắng vàng nhạt Đài hình chng, gần nhẵn.Tràng hoa hình bướm, có màu trắng ngà Quả loại đậu, khơng mở, hình tràng hạt, nhẵn, dày thắt nhỏ lại không hạt Hạt – 5, hình bầu dục, dẹt, màu đen bóng [1], [4], [3], [11] Tại Việt Nam, Hòe trồng phổ biến số tỉnh miền Bắc, nhiều tỉnh Thái Bình Ở nước khác Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Triều Tiên có trồng Ở số nước châu Âu, Hòe trồng làm cảnh [4], [26] Cây Hòe hoa vào khoảng tháng đến tháng 8, chín từ tháng đến tháng 11 [1] 1.1.2 Bộ phận dùng Trong y học cổ truyền, nhiều phận Hòe sử dụng để làm thuốc Dược liệu nụ hoa gọi ‘Hòe mễ’, hoa nở gọi ‘Hịe hoa’ Hịe chín gọi ‘Hịe giác’ [4] Ngồi ra, rễ, lá, cành non vỏ Hòe sử dụng làm thuốc với số công dụng định [26] Hịe giác (Fructus Sophorae) chín Sophora japonica L (Fam Leguminosae), thu hái vào mùa đơng, loại bỏ tạp chất phơi khơ Hịe giác có chiều dài – cm, đường kính – 10 mm, bên màu vàng lục đến nâu vàng, nhăn nheo thơ ráp Mặt bên có đường khớp màu vàng Kết cấu mềm, nhăn sau khô, dễ bẻ gãy chỗ thắt Hạt hình trứng, dài – 11 mm, bề mặt nhẵn, màu đen đến nâu đen, rốn hạt tròn mặt lõm, màu trắng xám Hạt có kết cấu cứng, hai mầm màu vàng đến lục Vỏ mỏng, có vị đắng Hạt có vị giống đậu nhai [17], [18] 1.1.3 Thành phần hóa học Flavonoid, alcaloid, terpenoid, acid amin, saccharid, phospholipid loại khác [15] Flavonoid gồm loại là: sophoricosid, genistin, genistein, rutin, quercetin kaempferol [15] Vỏ chứa 10,5% flavonoid tồn phần có 4,3% rutin Các isoflavonoid glycosid dẫn chất genistein genistin, sophoricosid sophorabiosid 7,4’-di-O-β-glucopyranosid số flavonoid khác dẫn chất kaempferol [4] Hạt chứa kaempferol 7-O-α-rhamnopyranosid, sophoricosid, sophorabiosid kaempferol 3-O-α–rhamnopyranosyl (1→6)-β-glucopyranosyl (1→2) βglucopyranosid-7-O- β-glucopyranosid [4] Hình 1.1 Cấu trúc hóa học sophoricosid (SPH) Tên IUPAC: 5,7 – dihydroxy – – [4 – [(2S, 3R, 4S, 5S, 6R) – 3,4,5 – trihydroxy – – (hydroxymethyl)oxan – – yl] oxyphenyl]chromen – – on Công thức phân tử: C21H20O10, trọng lượng phân tử: 432,4 g/mol [39] Sophoricosid (SPH) thành phần hoạt chất có Hịe giác, hàm lượng khoảng 10,2% [15] Với nhiều tác dụng dược lý bật, đồng thời chiếm hàm lượng lớn Hòe, sophoricosid ghi chép DĐTQ 2015 tiêu chuẩn để đánh giá kiểm tra chất lượng dược liệu Hịe giác chế phẩm Hàm lượng sophoricosid quy định chuyên luận Hòe giác, phân tích HPLC khơng thấp Phụ lục 5: Phiếu kiểm nghiệm dược liệu nguyên liệu Hòe giác Phụ lục 6: Hình ảnh chất chuẩn sophoricosid (SPH- C21H20O10): Hàm lượng: 99,34% (Xinyang Zhongjian Metrology Biological Technology Co., Ltd., Lot No 200419) Phụ lục 7: Phiếu kiểm nghiệm chất chuẩn sophoricosid Phụ lục 8: Sắc ký đồ mẫu kiểm chứng quy trình Phụ lục 8.1 Sắc ký đồ cao đặc dược liệu (mẫu kiểm chứng quy trình) bước sóng 260nm Phụ lục 8.2.Sắc ký đồ cao đặc dược liệu (mẫu kiểm chứng quy trình) bước sóng 260nm Phụ lục 8.3 Sắc ký đồ cao đặc dược liệu (mẫu kiểm chứng quy trình) bước sóng 260nm Phụ lục 9: Sắc ký đồ số mẫu cao phần thiết kế thí nghiệm Phụ lục 9.1 Sắc ký đồ mẫu cao Phụ lục 9.2 Sắc ký đồ mẫu cao Phụ lục 9.3 Sắc ký đồ mẫu cao 10 Phụ lục 9.4 Sắc ký đồ mẫu cao 11 Phụ lục 9.3 Sắc ký đồ mẫu cao 23 Phụ lục 9.4 Sắc ký đồ mẫu cao 24 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯU THÀNH CÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU HÒE GIÁC GIÀU SOPHORICOSID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 ... ? ?Nghiên cứu điều chế cao đặc dược liệu Hòe giác giàu sophoricosid? ?? nghiên cứu với mục tiêu: “Tối ưu hóa quy trình chiết xuất để điều chế cao đặc Hịe giác có hàm lượng hiệu suất chiết sophoricosid cao? ??... đích Điều chế cao đặc dược liệu Hòe giác đạt yêu cầu (về cảm quan, độ ẩm, hàm lượng SPH, hiệu suất chiết SPH) 2.2.2.2 Điều chế cao đặc a) Xác định độ ẩm Xác định độ ẩm dược liệu Hòe giác sau chế. .. tính đặc hiệu xây dựng đường chuẩn định lượng cao đặc vị thuốc Hòe giác 13 2.2.2 Nghiên cứu điều chế cao đặc Hòe giác 15 Xử lý số liệu 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU