VIỆN ĐẠI HỌC MÒ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀl NGHIÊN CỦtj, TÚYÊNCHỌNt ẤC DÒNG THỤC KHUẮN THẾ ức CHẾ VI KHUẤN GÂY BỆNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG SỮA GIÁO VIÊN HƯỚNG.
VIỆN ĐẠI HỌC MỊ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀl: NGHIÊN CỦtj, TÚYÊNCHỌNt:ẤC DÒNG THỤC KHUẮN THẾ ức CHẾ VI KHUẤN GÂY BỆNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG SỮA GIÁO VIÊN HƯỚNG DÃN : ThS Nguyễn Hồng Hải SINH VIÊN THỤ C HIỆN : Lê Thị Trang LỚP : 1302 HÀ NỘI-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đê tài: Nghiên cứu, tuyển chọn dòng thực khuẩn thể ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội GIÁO VIÊN HƯỚNG DÃN : ThS Nguyễn Hồng Hải SINH VIÊN THỤ C HIỆN : Lê Thị Trang LỚP : 1302 HÀ NỘI - 2017 Viện Dại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, làm việc Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mờ Hà Nội Phòng Vi Sinh - Viện Đi truyền Nông Nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ, chi bão tận tình từ Thầy Cô, anh chị bạn bè đồng nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc kính trọng tới Ths Nguyễn Hồng Hài - Viện Di truyền Nơng Nghiệp, người tận tình chi bào hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn cô chú, anh chị cán phịng Cơng nghệ vi sinh - viện Di truyền nông nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực tập để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mớ Hà Nội trang bị cho tơi kiến thức suốt q trình học tập tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập trường Cuối tơi xin bày lịitình cảm chân thành tới gia đình, bạn bè người thân thiết hết lòng giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập Bước đầu vào thực tế, tìm hiếu lĩnh vực sáng tạo nghiên cứu khoa học, kiến thức cùa tơi cịn hạn chế cịn nhiều bỡ ngờ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy bạn đế kiến thức cùa lĩnh vực hoàn thiện Sinh viên thực Lê Thị Trang SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Mục Lục LỜI CAM ƠN DANH MỤC BÁNG DANH MỤC HÌNH MỚ ĐÀU TÍNH CẤP THIẾT CỬA ĐÈ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN cứu NỘI DUNG NGHÊN cứu PHÀN I TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phâm Listeria monocytogenes giới Việt Nam 1.1.1 Tinh hình ngộ độc thực phấm Listeria monocytogenes giới 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phấm Listeria monocytogenes Việt Nam Tlnr.yien.Yien.Dai.lAQC 1.2 Mơ.Ị.Ịà Nôi 13 Vi khuân gây bệnh Listeria monocytogenes 15 1.2.1 Cấu trúc 15 1.2.2 Phân loại 18 1.2.3 Đặc tính sinh hóa 19 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên độc tố 20 1.2.5 Khà lây bệnh .20 1.2.6 Cơ chế gây bệnh 21 1.2.7 Miễn dịch 25 1.3 Tổng quan thực khuấn thể (Biobacteria Phage) 25 1.3.1 Sơ lược thực khuấn thể 25 1.3.2 Phương pháp kháo sát thực khuẩn 27 1.4 ửng dụng thực khuẩn thể 28 1.4.1 ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử 28 1.4.2 Úng dụng chuẩn đoán dịch tễ học 29 SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội 1.4.3 ứng dụng bảo quán thực phẩm .29 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 30 2.1 Vật liệu 30 2.1.1 Chủng nghiên cứu 30 2.1.2 Địa điêm nghiên cứu 30 2.1.3 Hóa chất thiết bị .30 2.1.4 Các môi trường sử dụng trình nghiên cứu 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn L monocytogenes (Theo TCVN 6401 : 1998) 33 2.2.2 Phân lập thực khuẩn thể 34 2.2.3 Đánh giá khả kí sinh dịng thực khuấn chủng vi khuấn gây bệnh khác .34 2.2.4 Đánh giá khà tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogen^s^afii^ (dỉựl^^i!gyii)^(thjịỊói.j.ỊẶ.^ộị 35 2.2.5 Nhận dạng thực khuẩn giãi trình tự gen Lys 35 2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng thực khuấn thể với vi khuẩn gây bệnh 36 Listeria monocytogenes có sữa 36 PHÂN 3: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Phân lập vi khuấn Listeria monocytogenes 37 3.2 Phân lập dịng thực khuẩn thể có khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 40 3.2.1 Phân lập thực khuấn thể 40 3.2.2 Khả ký sinh dòng TKT chúng L.monocytogenes phân lập 42 3.2.3 Đánh giá khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes cùa dòng thực khuẩn thể 42 3.3 Đánh giá kháng số vi khuân gây bệnh dòng thực khuẩn thể 43 SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội 3.4 Phân loại dòng thực khuấn thể triển vọng LM1 44 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng cùa thực khuấn với vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có sữa 46 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHÁO 50 Tiếng Việt 50 Tiếng Anh 51 Tài liệu Internet 53 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Viện Dại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Cấu trúc kháng nguyên 20 Bảng 2: Nguồn gốc cùa chùng phát triển môi trường chuyên biệt 37 Bảng 3: Ket quâ thứ nghiệm sinh lý, sinh hóa chủng phát triền 37 Bàng 4: Nguồn gốc dòng thực khuấn thể phân lập 40 Bảng 5: Khà ký sinh (tạo vết tan) dòng thực khuấn 42 Bàng 6: Đường kính vịng phân giãi vi khuấn L monocytogenes 42 Bảng 7: Hoạt tính phân giải cùa dịng TKT NA6 vi vi khuấn gây bệnh 44 Bảng 8: Độ tương đồng đoạn gen dòng TKT LM1 46 Bảng 9: Mật độ dòng TK.T LM1 sau 24, 48 nuôi cấy 46 Bảng 10: Mật độ vi khuấn L monocytogenes sau 24, 48 nuôi cấy 47 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Viện Dại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vi khn Listeria monocytogenes 15 Hình 2: Màng tế bào vi khuan Listeria monocytogenes 16 Hình 3: Lơng roi vi khuấn Listeria monocytogenes 18 Hình 4: Vi khuấn Listeria monocytogenes 18 Hình 5: Cơ chế gây bệnh vi khuấn Listeria monocytogenes 23 Hình 6: Sự di chuyển vi khuân Listeria monocytogenes 24 Hình 7: Ảnh hiền vi điện tử phage bám bề mặt tế bào vi khuẩn (trái); Hình mặt cắt (giữa) hình dạng ngồi phage T2 26 Hình 8: Đốm tan -“plaque”của phage À vi khuấn E coli 28 Hình 9: Hình dạng thứ nghiệm làm tan máu cùa chùng Listeria monocytogenes 40 Hình 10: Dịng TKT NA6 lập trêh phân mơi trường LEB vi khuẩn 41 Hình 11: Dịng thực khuẩn LM1 tách dịng mồi trường TSB 43 Hình 12: Đánh giá khà phát triền hoạt tính dòng TKT NA6 47 SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Viện Dại Học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ sinh học MỞ ĐẦU TÍNH CÁP THIÉT CỦA ĐÈ TÀI Ngộ độc thực phấm mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng giới Nguyên nhân người sử dụng loại thực phẩm bị nhiễm loài vi khuân gây bệnh hay độc tố chúng Mặc dù có cơng nghệ đại, phương pháp thực hành sán xuất kiếm soát chất lượng, vệ sinh tốt số lượng trường hợp bị ngộ độc bị bệnh thực phẩm tăng lên suốt thập kỷ qua Tại Việt Nam, theo thống kê Bộ Y tế, chi tháng đầu năm 2016, nước xảy gần 30 vụ ngộ độc thực phấm nghiêm trọng, làm 1.386 người bị ngộ độc, có trường hợp tử vong Hầu hết bệnh nhân bị ngộ độc ăn phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật E.coli, Listeria, Staphylococcus aureus, Salmonella, Trong vi khuân gây bệnh này, Listeria monocytogenes tác nhân gây bệnhTị^enỊOsữ yà vi khuẩn gây bệnh đứng thứ thuộc nhóm B sau Streptococus Ecoli Đồng thời nguồn gây nhiễm bệnh cho người sán phấm bào quàn lạnh, vi sinh vật có khả tồn tăng trưởng sản phầm suốt trình bảo quàn lạnh Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng phát bệnh người hấp thu dù liều lượng, sau thời gian ủ bệnh triệu chứng lâm sàn biếu Trong Listeria monocytogenes diện với số lượng nhị thực phẩm, vào thể chúng khơng bị đào thài mà tích lũy chờ hội Mặc dù bệnh Listeria monocytogenes gây tần số thấp, 2-5 trường hợp triệu người năm, ti lệ chết vi khuẩn cao, 25 - 30 % trường hợp tữ vong ca nhiễm bệnh Tinh hình nhiễm bệnh việc sử dụng chất hóa học để bão quăn thực phẩm chấp nhận nhiều chất bảo quăn hóa học làm ảnh hường lâu dài lới sức khỏe cộng đồng Trong số chất bão quàn sinh học nay, thực khuẩn thể xem tác nhân phòng trừ SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội sinh học quan trọng thương mại mại hóa để phòng trừ vi khuân Listeria monocytogenes quăn thực phẩm Chế phẩm LISTEX™ P100 (Micreos) FDA cấp phép cho lưu hành sử dụng năm 2006 chât phụ gia bão quân thực phẩm dùng đê tiêu diệt vi khuân gây bệnh Listeria Đây chế phấm có nguồn gốc tìr thực khuấn sử dụng rộng rãi Mỹ nước giới mà không gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phấm Ớ Việt Nam chưa có nghiên cứu ghi nhận sừ dụng thực khuẩn thể phòng trừ vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có thực phẩm, đặc biệt có sữa Vì vậy, đề tài thực nhằm “phân lập, tuyển chọn đánh giá hiệu ức che vi khuân gây bệnh Listeria monocytogenes cùa dòng thực khuân thê nham ứng dụng bào quán sữa.” MỤC TIÊU NGHIÊN cứu Phân lập vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa Phân lập, tuyến chọn, đánh giá hiệu ức ché cùa dòng thực khuẩn thể lới vi khuân gây bệnh Liberia monocytogenes sữa NỘI DUNG NGHÊN cúu - Phân lập, tuyến chọn dòng thực khuấn thề có khà ức che vi - Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes khuẩn Listeria monocytogenes sữa dòng thực khuẩn Phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes - Nghiên cứu đặc điểm sinh lí, hóa sinh dịng thực khuấn thể - Phân loại dòng thực khuần the tuyến chọn - Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn với vi khuẩn gây bệnh tuyến chọn Listeria monocytogenes có sữa SV: Lê Thị Trang Lớp: DH 13-02 Viện Dại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Bảng 3: Kết thủ' nghiệm sinh lý, sinh hóa chủng phát triến mơi trưịng Oxford Chủng MCI MC2 MC3 GL4 Thạch Thạch CAMP Canh Canh Soi Thử Thứ máu ỏ’ mềm canh nghiệm nghiệm XPR, RPR, vói 37°C, khuẩn ủ ỏ' s.aureu Catalase Oxidase ủ ủ ỏ' 25"c, 37°C, 37°ẽ, BHI 4-4811 25đã li ỏ' R.cqui 48 48 25°C 48h giò' + + Chuyền s.aureu(+) Tan Di ■ động động máu hình xoay R.equi(-) trịn dù Tan Di Chun s.aureu(+) + ■ máu động động hình xoay R.equi(-) dù trịn Không Không Không s.aureu(+) chuyển tan di máu động động R.equi(-) Tan Di Chuyến s.aureu(+) + máu động động iỌệ nW : Mơ I Nội GL5 NA6 NA7 NA8 NA9 Chuyền s.aureu(+) + Di động động hình xoay R.equi(-) dù trịn Tan Di Chuyển s.aureu(+) + máu động động hình xoay R.equi(-) dù trịn Khơng Không Không s.aureu(+) di “ chuyên tan máu động động R.equi(-) Không Không Không s.aureu(+) chuyền tan di động động R.equi(-) máu Tan Di Chuyên s.aureu(+) + máu động động hình xoay R.equi(-) trịn dù Chú thích: + dương tính Tan máu + 4- - - - - - + - âm tính SV: Lê Thị Trang 39 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Kết quà bàng cho thấy, có chúng vi khuẩn MCI, MC2, GL4 GL5, NA6 NA9 thuộc lồi L Monocytogenes chúng có khâ làm tan máu thạch, có khả dao động hình dù mơi trường thạch mền, có xoay tròn soi canh khuấn BHI, dương tính với s.aureu âm tính với R.equi, Catalase dương tính Oxidase âm tính, canh XPR âm tính canh RPR dương tính Các chúng đươc làm báo quản cho nghiên cứu Hình 9: Hình dạng thử nghiệm làm tan máu chủng Listeria Thư viện Vgn^li^Mo- nà Nội 3.2 Phân lập dịng thực khuẩn thể có khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 3.2.1 Phân lập thực khuẩn thể Từ 38 mẫu sữa tươi chưa trùng, phomai, sữa chua, thức ăn cho bò, dịch rửa sữa bò bị bệnh viêm vú, tinh Hà Nội, Nghệ An, Sơn La, phân lập dịng thực khn thê (TKT) có khà ức chê vi khuân gây bệnh Listeria monocytogenes Bảng 4: Nguồn gốc dòng thực khuẩn thề phân lập STT Chủng Nguồn gốc TKT LM1 Mộc Châu, Sơn La + LM2 Mộc Châu Sơn La + LM3 Gia Lâm, Hà Nội + LM4 Thái Hòa, Nghệ An + SV: Lê Thị Trang 40 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Ket báng cho thay, mẫu thu Sơn La có mật độ thực khuẩn thể cao Hà Nội Nghệ An Thực khuan the (bacteriophages) chi nhân lên tế bào vi khuấn sống nhạy câm Vì kích thước khơng cho phép quan sát trực tiếp khơng có kính hiến vi điện tứ theo dõi hoạt động chúng bàng phương tiện gián tiếp quan sát vùng phân giải vi khuẩn phát triền đìa thạch Vùng phân giãi gọi vết tan hay cịn gọi đốm tan (plaque), tạo thành tế bào vi khuân bị nhiễm bacteriophages phân giai phóng thích nhiều hạt bacteriophages mới, bacteriophages liền xâm nhiễm tế bào vi khuân ke cận Quá trình lặp lại cho đen phát triền cúa vi khuấn đĩa thạch ngừng lại hết thức ăn Những vết tan tách khỏi đĩa thạch, ly lâm thu thực khuẩn thể nghiên cứu Hình 10: Dịng TKT NA6 lập phân môi trường LEB vi khuẩn ký chủ Listeria monocytogenes SV; Lê Thị Trang 41 Lớp: DH 13-02 Viện Dại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học 3.2.2 Khả ký sinh dòng TKT chủng L.monocytogenes phân lập Bảng 5: Khả ký sinh (tạo vết tan) dòng thực khuẩn thể Chủng vi Thực khuấn thể khuẩn LMI LM2 LM3 LM4 MCI + + - - MC2 + - + - GL4 + - - + GL5 - + - + NA6 + - - - NA9 + + - + Chú thích: + Có ký sinh - Khơng ký sinh Ket quà báng cho thấy dòng TKT có ký sinh cà chúng vi khuẩn L.monocytogenes phân lập với mức dộ khác Trong số dịng TKT dịng LM1 có ti lệ ký sinh cao thấp dịng LA3 Vi khuẩn bị thực khuẩn thể ký sinh NA6 3.2.3 Đánh giá khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn Các thực khuẩn thổ phân giãi vi khuấn gây bệnh Listeria monocytogenes sau phân tách, làm dùng đề đánh giá khả tiêu diệt vi khn gây bệnh dựa vào đường kính vịng phân giải (vết tan) Bảng 6: Đường kính vịng phân giải vi khuấn L monocytogenes cua dòng thực khuẩn thể Dịng TKT Đường kính phân giải (mm) 12 giị- 24 giò' 36 giò' 48 LM1 2,1 5,3 8,6 13.8 LM2 1,7 5.0 8.2 11,3 LM3 1.6 3.8 6,9 8,9 LM4 1.8 5,1 7.3 10,5 SV: Lê Thị Trang 42 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Kêt báng cho thây, hoạt tính kháng khuân gây bệnh L monocytogenes cúa dòng thực khuẩn thế: LM1, LM2, LA3 LM4 tăng dần theo thời gian thời diêm khăo sát 12 giờ, 24 giờ, 36 48giờ Tại thời diêm 48 hoạt tính kháng khuẩn dịng TKT cao (đường kính vịng phân giái từ 8,9 mm- 13,8 mm), dịng TKT LM1 LM2 có hoạt tính lốt dịng TKT lại (13,8 mm 11,3 mm) dòng TKT LM4 thấp (8,9 mm) Dòng LM1 phân lập từ sữa tươi chưa trùng LM2 phân lập từ thức ăn cho bò Kết quà cho thấy dịng TKT LM1 có triển vọng đê sử dụng bảo quăn sữa tươi nguyên liệu có nhiễm vi khuẩn gây bệnh L monocytogenes Hình 11: Dịng thực khuẩn thể LM1 tách dịng mơi trường TSB vi khuấn ký chủ 3.3 Đánh giá kháng số vi khuẩn gây bệnh dòng thục khuẩn thể Hiện tượng thực khuan the nói chung thường đặc hiệu (một vi khuẩn chí bị thực khuẩn thể tương ứng làm tan mà thôi), cấu tạo hóa học chủ yếu thực khuẩn AND protein Nó có cấu tạo kháng nguyên đặc hiệu riêng cho loại Thực khuân the chì nhân lên ký sinh vào tế bào vi khuấn Trước tiên thực khuẩn thể bám vào tế bào vi khuân bề mặt cuối đuôi, màng vi khuẩn bị thủy phân AND chửa đầu thực khuân bơm vào tế bào vi khuẩn Việc tong hợp AND, ARN protein cùa vi khuấn 5V: Lê Thị Trang 43 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội bị đình chí tức khắc, việc tổng hợp AND protein thực khuẩn bắt đầu Các thí nghiệm hóa học sinh vật cho thấy khà tổng hợp tế bào vi khuẩn giữ nguyên vẹn mức độ động viên lượng, việc kiểm sốt sè tồng hợp quyền hướng dẫn bời AND cùa thực khuẩn thể, dần tới nhân lên thành phần đơn vị thực khuấn thề, cuối chúng tự xếp lại thành hạt thực khuẩn hoàn chình phá vỡ vi khuấn chứa Các thực khuẩn vừa giái phóng lại tìm đen ký sinh vào tế bào vi khuấn khác lại tiếp tục xảy loạt q trình nói Dịng TKT LM1 có hoạt tính phân giãi khả ký sinh cao nên chọn để đánh giá hoạt tính phân giái vi khuẩn gây bệnh loài (vi khuẩn chú) loại vi khuẩn gây bệnh lồi khác Bảng 7: Hoạt tính phân giải dòng TKT NA6 vi vi khuẩn gây bệnh Chủng vi khuẩn Hoạt tính phân giái Staphylococus aureus s aureus SAỠfâư Staphylococus + vjện A ^iện Đại học Mb' Hà Nội - epidermidis - Listeria monocytogenes E coll Salmonella enteritidis Chú thích: - khơng có hoạt tính + có hoạt tính Ket q bảng cho thấy, dịng TKT NA6 có hoạt tính phân giãi với vi khn chủ mà khơng có hoạt tính với vi khuấn khác, đặc biệt vi khuân Gram âm 3.4 Phân loại dòng thực khuẩn thể triển vọng LM1 Dòng thực khuẩn LM1 có hoạt tính phân giải vi khuấn gây bệnh L Monocytogenes cao dòng có khả ký sinh nhiều chửng vi khuấn gây bệnh lồi Đây dịng có triển vọng ứng dụng thực tế nên dòng giãi trình từ gen cho nghiên cứu SV: Lê Thị Trang 44 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Trình tự nucleotide dòng thực khuẩn thể LM1 CATATGACGAGCTACTACTACAGCCGTAGCCTGGCGAACGTT AACAACTGGCGGATAACACTAAAGCGGCGCGTCGTAAACTGCTGG ATTGGTCTGAATCTAACGGTATCGAAGTTCTGATCTACGAAACCAT ACGTACCAAAGAACAGCAGGCGGCGAACGTTAACTCTGGTGCTAG CCAGACCATGCGTAGCTACCACCTGGTTGGTCAGGCTCTGGATTTC GTGATGGCTAAAGGTAAAACCGTTGATTGGGGCGCGTACCGTAGT GATAAAGGTAAAAAATTTGTAGCTAAAGCTAAATCTTTAGGTTTTG AATGGGGCGGTGATTGGTCAGGTTTTGTTGATAATCCGCACCTGCA GTTTAATTATAAAGGTTACGGTACCGATACCTTCGGTAAAGGCGCC AGCACCTCTAACAGCAGCAAACCGAGCGCGGATACCAACACCAAC TCTCTGGGTCTGGTTGATTACATGAACCTGAACAAACTGGATTCTA GCTTCGCGAACCGTAAAAAACTGGCGACCTCTTACGGTATCAAAA ACTACTCTGGTACCGCGACCCAGAACACCACCCTGCTGGCGAAAC TGAAAGCGGGTAAACCGCAGAqCGCGGCGTCTAAAAACACCTACT ACACCGAAAACCCGCGTAAAGTTAAAACCCTGGTTCAGTGCGATC TGTACAAAAGCGTTGATTTCACCACCAAAAACCAGACCGGTGGTA CCTTCCCTCCTGGCACCGTTTTCACCATTTCTGGTATGGGTAAAAC CAAAGGCGGTACCCCGCGTCTGAAAACCAAATCTGGTTACTACCT GACCGCTAACACCAAATTCGTTAAAAAGATCCTCGAG So sánh trình tự ngân hàng liệu NCBI bàng chương trình BLAST đe xác định mức độ tương đồng cùa dòng TKT LM1 Ket cho thấy dòng TKT LM1 có độ tương đồng tới >98% với Listeria phages như: WSLC 1118 PSA SV: Lê Thị Trang 45 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 8: Độ tuông đồng đoạn gen dịng TKT LM1 Dịng Chiều dài trình tự Dòng bacteriophage tuong Mức độ tưong so sánh (nu) đồng đồng (%) Listeria phages WSLC 1118 100 Listeria phages PSA 98 TKT LM1 851 Theo liệu NCBI thơng tin vê dịng bacteriophage Listeria phages WSLC 1118 Listeria phages PSA cho thay dịng phage có hoạt tính kháng vi khuân gây bệnh L monocytogenes cao 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn thể vói vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có sữa Các nghiên cứu thực khuẩn thể độc lực cho thấy thực khuẩn thể chi nhân lên ký sinh vào tế bào vi khuẩn Theo nghiên cứu cùa Iriarte ctv., 2007 cho thấy nhiệt độ độ ẩm, yếu tố mơi trường có ành hường đến lớn đến tuổi thọ thực khuấn thể Dịng TKT NA6 có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế nên chọn đế đánh gịá,khậ tồn tai NA6 hoạt tính phân giãi với vi khuân gây bệnh L monocytogenes (chúng NA9) môi trường sữa tươi nguyên liệu Băng 9: Mật độ dòng TKT LM1 sau 24, 48 giò’ nuôi cấy Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ TKT (pfu/ml) Trước nuôi cấy Sau nuôi cấy 24 l,7xio2 5,3x10” 48 l,7xio2 2,9x10* SV: Lê Thị Trang 46 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 12: Đánh giá khả phát triển hoạt tính dịng TKT NA6 Bảng 10: Mật độ vi khuẩn Li monocytogenes sau 24,48 nuôi cấy Mật độ vi khuân (cfu/ml) Thời gian nuôi cấy (giờ) Trước nuôi cấy Sau nuôi cấy Đối chứng 24 1,8x10' 3,2x10' 5,3xlOv 48 1,8x10' 2,9x10' 7,1 xio" Vì thí nghiệm đánh sữa tươi nguyên liệu có độ đục nên không đo OD mà phải cấy trang đếm mật độ với vi khuẩn gây bệnh môi trường chọn lọc Theo kết quà báng cho thay mật độ thực khuan the NA6 tăng lên sau 24 48 ni cấy Hoạt tính kháng dịng TKT NA6 bàng 10 qua giám mật độ vi khuân gây bệnh Mật độ vi khuẩn giám chứng tỏ khả tiêu diệt vi khuấn TKT cao Theo kết bàng 10, mật độ vi khuấn giảm rõ rệt sau 24 48 nuôi cấy TKT, đối chứng (chi nuôi cấy vi khuẩn môi trường phù SV: Lê Thị Trang 47 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội hợp) mật độ vi khuấn tăng cao Điều cho thấy dòng TKT NA6 có khả nàng tiêu diệt vi khuân chù, vi khuân gây bệnh cao có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội SV: Thị Trang 48 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội PHÀN 4: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân lập làm chúng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes từ nguồn sữa tươi nguyên liệu, mai, thức ăn cho bò tinh thành Sơn La Hà Nội Nghệ An - Đã phân lập dịng thực khuấn thể Trong dịng TKT NA6 có hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes cao TKT có ký sinh nhiều chúng vi khuẩn chù gây bệnh - Giải trình tự gen dịng thực khuẩn LMlvà so sánh NCBI chương trình BLAST đế xác định mức độ tương đồng dòng TKT NA6 Kết q cho thấy dịng TKT NA6 có độ tương đồng tới >98% Listeria phages WSLC 1118 Listeria phages PSA 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu dòng thực khuẩn thể, đặc biệt dòng TKT LM1 đế ứng dụng bào quàn sữa bào quán thực phâm Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội SV: Lê Thị Trang 49 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Báo cáo long kết đề tài cấp bộ: Nghiên cứu sử dụng hydrogen pcroxyde đê báo quàn sữa tươi” (2007) Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Học viện Nơng nghiệp trì Nguyễn Văn Hiếu, Phí Quyết Tiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010) Tách dịng biếu gen mã hố protease serine chủng Bacillus subtilis HT24 Escherichia coll Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3A), 841-846 Lê Huy Chính (2001), Vi sinh y học, Nhà xuất bán Y học, Hà Nội Lê Vàn Việt Mần (2013) Giáo trình cơng nghệ săn xuất sản phấm từ sữa thức uống pha chế, Tập 1, Công nghệ sán xuất sữa NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Văn Việt Man (2013) Giáo trình cơng nghệ săn xuất sản phàm từ sữa thức uống pha chg, Tập IjjQong nghệ sán Xuất sữa NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lý Hương, Nguyền Thị Phấn Bùi Thị Kim Dung (2005), Kháo sát tình hình nhiễm vi sinh vật so mặt hàng thực phẩm ăn liền bán chợ Tp.Hồ Chí Minh năm 2002-2004, Trung tâm Y te dự phịng Tp.Hồ Chí Minh, Thơng tin khoa học, Cục An tồn vệ sinh Thực phẩm Nguyễn Văn Hiếu, Phí Quyết Tiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010) Tách dòng biêu gen mã hoá protease serine chùng Bacillus subtilis HT24 Escherichia coli Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3 A), 841-846 SV; Lê Thị Trang 50 Lóp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Tiếng Anh Borysowski, J., Wcbcr-Dabrowska, B., & Gorski, A (2006) Bacteriophage cndolysins as a novel class of antibacterial agents Experimental Biology Medicine (Maywood), 231, 366-377 Briers Y, Walmagh M, Lavigne R Use of bacteriophage endolysin EL 188 and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa J Appl Microbiol 2011; 110(3):778—785 Briers, Y„ Volckaert, G., Cornelissen, A., Lagaert, s„ Michiels, c w., Hertveldt K., et al (2007) Muralytic activity and modular structure of the endolysins of Pseudomonas aeruginosa bacteriophages phiKZ and EL Molecular Microbiology, 65, 1334-1344 Diaz E Lopez R, Garcia JL Chimeric phage-bacterial enzymes: a clue to the modular evolution of genes Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87(20):8125-8129 Fischetti, Ỵ A (£Q04() The ọf phage JytjcXghfymes to control bacterial infections In E s Kutter (Ed.), Bacteriophages: Biology and applications (pp 321-334), Boca Raton - Florida Kretzer, J w., Lehmann, R„ Schmelcher, M., Banz, M„ Kim, K p., Korn, c„ et al (2007) Use of high-affinity cell wall-binding domains of bacteriophage endolysins for immobilization and separation of bacterial cells Applied and Environmental Microbiology, 73, 1992- 2000 Lai MJ, Lin NT, Hu A, et al Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phage varphiAB2 endolysin (LysAB2) against both Gram positive and Gram-negative bacteria Appl Microbiol Biotechnol 2011; 90(2):529-539 SV; Lê Thị Trang 51 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội Liu, B„ Wu, S„ Song, Q„ Zhang, X., & Xie, L (2006) Two novel bacteriophages of thermophilic bacteria isolated from deep-sea hydrothermal fields Current Microbiology, 53, 163-166 Loessner, M.J., 2005 Bacteriophage endolysins—current state of research and applications Current Opinion in Microbiology 8.480-487 lO Mayer, M J., Payne, J., Gasson, M J., & Narbad, A (2010) Genomic sequence and characterization of the virulent bacteriophage phiCTPl from Clostridium tyrobutyricum and heterologous expression of its endolysin Applied and Environmental Microbiology, 76, 5415-5422 11 Oliveira, H., Azeredo, J., Lavigne, R., and Kluskens, L D (2012) Bacteriophage endolysins as a response to emerging foodbome pathogens Trends Food Technol Sci 28, 103-115 doi: l0.1016/j.tifs.2012.06.016 12 Schmelcher M, Shabarova T, Eugster MR, et al Rapid multiplex detection and differentiation of Listeria cells by use of fluorescent phage endolysin cell wall binding domains Appl Environ Microbiol 2010; 76(17):5745-5756 13,Tamakoshi, M„ Murakami, A., Sugisawa, M„ Tsuneizumi, K„ Takeda, s„ Saheki, T., et al (2011) Genomic and proteomic characterization of the large Myoviridae bacteriophage varphiTMA of the extreme thermophile Thermus thermophilus Bacteriophage, 1, 152-164 14 Turner MS, Waldherr F Loessner MJ, Giffard PM Antimicrobial activity of lysostaphin and a Listeria monocytogenes bacteriophage endolysin produced and secreted by lactic acid bacteria Syst Appl Microbiol 2007; 30(l):58-67 15 William Burrows, Rippon(1968) Fex Murdoch Robert book of Lewert, microbiology- John The Willard pathogenic Microorganisms SV; Lê Thị Trang 52 Lớp: DH 13-02 Khoa Công Nghệ sinh học Viện Dại Học Mở Hà Nội 16 Zhang, H Bao, H., Billington, c., Hudson J A., & Wang, R (2012) Isolation and lytic activity of the Listeria bacteriophage endolysin LysZ5 against Listeria monocytogenes in soya milk Food Microbiology, 31 133-136 Tài liệu từ Internet http://vietq.vn/ngo-doc-thuc-pham-gan-1400-nguoi-mac-chi-trong-4thang-dau-nam-d90443.html http://www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/130907vikhuanlisteria.htm Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội SV: Lê Thị Trang 53 Lớp: DH 13-02 ... tuyến chọn dòng thực khuấn thề có khà ức che vi - Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes khuẩn Listeria monocytogenes sữa dòng thực khuẩn Phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes. .. kháng vi khuân gây bệnh L monocytogenes cao 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn thể vói vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có sữa Các nghiên cứu thực khuẩn thể độc lực cho thấy thực khuẩn. . .VI? ??N ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Đê tài: Nghiên cứu, tuyển chọn dòng thực khuẩn thể ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa Thư vi? ??n Vi? ??n