TRỊNH THỊ QUỲNH TRANG NGHIÊN cứu CHIET XUẤT và TINH CHE TANSHINON IIA từ dược LIỆU ĐAN sâm làm CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIEM NGHIỆM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ QUỲNH TRANG Mã sinh viên: 1701618 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TANSHINON IIA TỪ DƯỢC LIỆU ĐAN SÂM LÀM CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Chử Thị Thanh Huyền ThS Bạch Thị Thắm Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Bộ môn DHCT – Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung thuộc đề tài nghiên cứu mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đồng hành, giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu khoa học Khoa Đơng Dược – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn TS Chử Thị Thanh Huyền – giảng viên Bộ môn Dược học Cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội ThS Bạch Thị Thắm – Khoa Đông Dược, Dược liệu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tận tình bảo hướng dẫn, động viên tơi q trình nghiên cứu, giúp tơi hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị Khoa Đông Dược, Dược liệu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn chân thành cho gia đình, bạn bè ln ủng hộ động viên suốt năm tháng học tập nghiên cứu mái trường Đặc biệt, xin cảm ơn bạn Bùi Thị Ngân đồng hành, chia sẻ buồn vui giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu mơn Hà Nội, ngày 27 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Trịnh Thị Quỳnh Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu Đan sâm 1.1.1 Mô tả 1.1.2 Tác dụng 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.3.1 Thành phần tan dầu 1.1.3.2 Thành phần tan nước 1.1.3.3 Các thành phần khác 1.2 Tổng quan tanshinon IIA 1.2.1 Đặc tính tính chất tanshinon IIA 1.2.2 Tác dụng dược lý 1.3 Tình hình chiết xuất, phân lập tinh chế tanshinon IIA 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tượng nghiên cứu 10 2.1.1 Nguyên liệu 10 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 10 2.1.3 Hóa chất, dung môi 10 2.1.4 Chất chuẩn 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.2.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm 11 2.2.2 Chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon IIA dược liệu Đan sâm 11 2.3.1.1 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 11 2.3.1.2 Định tính, định lượng tanshinon IIA bằng phương pháp HPLC 12 2.3.2 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon IIA cao Đan sâm 13 2.3.3 Chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 14 2.3.3.1 Chiết xuất 14 2.3.3.2 Tinh chế sử dụng phương pháp sắc ký cột 14 2.3.4 Định tính chất tanshinon IIA tinh chế 15 2.3.5 Xác định hàm lượng chất tanshinon IIA tinh chế 15 2.3.6 Xác định giới hạn tạp chất liên quan tanshinon IIA tinh chế 16 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Quy trình chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 18 3.1.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm 18 3.1.1.1 Mô tả 18 3.1.1.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 18 3.1.1.3 Định tính, định lượng tanshinon IIA bằng phương pháp HPLC 19 3.1.2 Quy trình chiết xuất tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 21 3.1.3 Quy trình tinh chế tanshinon IIA 23 3.1.3.1 Tinh chế tanshinon IIA cột sắc ký pha thuận 23 3.1.3.2 Tinh chế tanshinon IIA cột sắc ký pha đảo 26 3.2 Định tính chất tinh chế 32 3.2.1 Tính chất 32 3.2.2 Phổ hồng ngoại 32 3.2.3 Phân tích khối phổ 32 3.2.4 Định tính bằng HPLC 34 3.3 Xác định hàm lượng tanshinon IIA tinh chế 35 3.4 Xác định giới hạn tạp chất 37 3.5 Tóm lược kết nghiên cứu 39 BÀN LUẬN 40 KẾT LUẬN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt B Tài liệu tiếng Anh DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ASB Acid salvianolic B BP Dược điển Anh CP Chinese Pharmacopeia (Dược điển Trung Quốc) DAD Diod Array Detector DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide EtOAc Ethyl acetat HLPC High Performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IR MeOH Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại) Methanol RP Reversed phase (Pha đảo) RSD Realative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SKĐ Sắc ký đồ Tan IIA Tanshinon IIA TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) USP United State Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) UV-VIS Ultraviolet visble (Tử ngoại – khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Độ tan tanshinon IIA dung môi Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng đề tài 11 Bảng 2.2: Các chuẩn sử dụng đề tài 11 Bảng 3.1: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn tanshinon IIA 20 Bảng 3.2: Kết tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon II A 20 dược liệu Bảng 3.3: Kết định lượng tanshinon IIA dược liệu Bảng 3.4: Kết tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon II A 21 22-23 cao Bảng 3.5: Kết định lượng tanshinon IIA cao dược liệu 23 Bảng 3.6: Các thông số cột sắc ký tinh chế tanshinon IIA cột RP 28 Bảng 3.7: Tổng hợp kết đo phổ khối 32 Bảng 3.8: Kết thời gian lưu chất chuẩn mẫu thử 34 Bảng 3.9: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn tanshinon IIA 35 Bảng 3.10: Kết tính thích hợp hệ thống định lượng tanshinon IIA 35-36 tinh chế Bảng 3.11: Kết định lượng tanshinon IIA tinh chế Bảng 3.12: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký Bảng 3.13: Kết xác định hàm lượng tạp chất 36 37-38 38 DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm Hình 1.2: Cấu trúc số diterpenoid có rễ Đan sâm Hình 1.3: Cấu trúc số acid phenolic Hình 1.4: Cấu trúc hóa học tanshinon IIA Hình 3.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm (mẫu nghiên cứu) 18 Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng định tính Đan sâm 18 Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b), kết chồng 19 phổ DAD (c) Hình 3.4: Sơ đồ chiết xuất tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 22 Hình 3.5: Hình ảnh sắc ký đồ HPLC cao Đan sâm 22 Hình 3.6: Hình ảnh TLC khảo sát dung mơi đưa lên cột sắc ký pha 24 thuận Hình 3.7: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn cột sắc ký 25 pha thuận (1) Hình 3.8: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn cột sắc ký 26 pha thuận (2) Hình 3.9: Hình ảnh TLC khảo sát tỷ lệ dung mơi cho cột sắc ký pha 27 đảo Hình 3.10a: SKĐ TLC lọ số 1.1 đến 1.10 cột pha đảo số (1) 29 Hình 3.10b: SKĐ TLC lọ số 1.11 đến 1.80 cột pha đảo số (1) 29 Hình 3.11: SKĐ HPLC phát hiện có mặt tanshinon IIA cột 30 sắc ký pha đảo (2) Hình 3.12: Sơ đồ tóm tắt quy trình tinh chế tanshinon IIA 31 Hình 3.13: Phổ IR mẫu thử mẫu chuẩn tanshinon IIA 32 Hình 3.14: Phổ khối mẫu chuẩn tan IIA chất tinh chế 33 Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi, mẫu thử mẫu chuẩn 34 Hình 3.16: Chồng phổ UV mẫu thử mẫu chuẩn tanshinon IIA 34 Hình 3.17: Sắc ký đồ dung môi, mẫu đối chiếu (2), (1) mẫu thử 37 Hình 3.18: Tóm tắt quy trình chiết xuất, tinh chế tanshinon IIA từ 39 dược liệu Đan sâm ĐẶT VẤN ĐỀ Dược liệu Đan sâm vị thuốc quý, sử dụng rộng rãi, phổ biến Trung Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ Châu Âu điều trị bệnh liên quan đến tim mạch [13], [31], sử dụng đơn độc kết hợp với thuốc khác để điều trị cho hiệu tốt ít tác dụng phụ [7] Theo Y học cổ truyền, Đan sâm có công hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hòn cục, tâm phiền ngủ, đau thắt ngực [2], [6] Theo Y học hiện đại, Đan sâm sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu đột quỵ nhiều nước giới [11], [19] Nhằm kiểm soát chất lượng dược liệu Đan sâm, Dược điển nước (Dược điển Việt Nam V, Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ liệu dược liệu chuẩn Hồng Kông, Dược điển Nhật Bản 17, Dược điển Mỹ, Dược điển Anh,….) đưa nhiều phương pháp khác Về hóa học, chuyên luận dược điển thường quy định tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng định lượng bằng phương pháp HPLC có xác định hàm lượng hai marker acid salvianolic B tanshinon IIA Trong đó, hàm lượng tanshinon IIA quy định không dưới: 0,2% (DĐVN V); 0,25% (CP2015); 0,12% (Hồng Kông, BP 2020); 0,1% (USP 42) Theo tài liệu công bố, tanshinon IIA thành phần hoạt chất chính sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm quy định Dược điển Trung Quốc (CP 2015) Hiện tại, chế phẩm đông dược Đan sâm Việt Nam đánh giá hàm lượng tanshinon IIA theo quy định Việc kiểm soát chất lượng dược liệu Đan sâm đòi hỏi phải có chất chuẩn đó có tanshinon IIA Đến chuẩn tanshinon IIA phải đặt mua từ nước ngoài, giá thành cao, thời gian cung cấp bị kéo dài gây khó khăn cho đơn vị kiểm nghiệm Ở nước ta, tanshinon IIA phân lập, tinh chế [1], [3] chưa có chuẩn tanshinon IIA thiết lập Việt Nam Từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) nghiên cứu với mục tiêu: • Xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm • Chiết xuất tinh chế tanshinon IIA đạt hàm lượng 90,0 % CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về dược liệu Đan sâm 1.1.1 Mô tả Dược liệu Đan sâm rễ thân rễ phơi sấy khô Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), họ bạc hà (Lamiaceae) [2] S miltiorrhiza phân bố rộng rãi miền Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc,… [24] Cây Đan sâm nhập nội, có nguồn gốc Trung Quốc, viện Dược liệu trồng trại thuốc Sa Pa, Tam đảo,…[9] Đặc điểm dược liệu: Rễ ngắn, thô, đầu rễ còn sót lại gốc thân Rễ hình trụ dài, cong queo, có phân nhánh có rễ dạng tua nhỏ, dài 10 cm đến 20 cm, đường kính 0,3 cm đến cm Mặt màu đỏ nâu đỏ nâu tối, thô, có vân nhăn dọc Vỏ rễ già bong ra, thường có màu nâu tía Chất cứng giòn, mặt bẻ gãy không có vết nứt, phẳng đặc, phần vỏ màu đỏ nâu phần gỗ màu vàng xám màu nâu tía với bó mạch màu trắng vàng, xếp theo hướng xuyên tâm Mùi nhẹ, vị đắng se [2] Dược liệu từ trồng tương đối mập chắc, đường kính 0,5 cm đến 1,5 cm Mặt màu nâu đỏ, có nếp nhăn dọc, phần vỏ bám chặt vào gỗ khó bóc Thể chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối phẳng, có dạng chất sừng [2] Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm 1.1.2 Tác dụng - Theo Y học cổ truyền: Đan sâm có vị đắng, tính mát, quy kinh tâm, can; công hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hòn cục, tâm phiền ngủ, đau thắt ngực [2], [6] - Theo Y học đại: Đan sâm sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu đột quỵ nhiều nước giới [11], [19] Các thuộc tính có lợi Đan sâm bao gồm cải thiện lưu lượng máu giải ứ máu [23] 1.1.3 Thành phần hóa học - Thành phần hóa học: Hiện có 100 chất hóa học chiết tách xác định từ Đan sâm Dựa vào tính tan chất hóa học có thể chia nhóm thành phần Đan sâm gồm loại: Thành phần tan dầu, thành phần tan nước thành phần khác [31] 1.1.3.1 Thành phần tan dầu Thành phần tan dầu diterpenoid bao gồm nhóm chính: Các dẫn chất phenanthro furan quinon, phenanthren, spiro ketal lacton, dẫn chất phenalenofuran diterpen, dẫn chất phenanthropyrandion, dẫn chất furonaphthopyrane phenathro [1,2b] furan-10,11-dion Các nhóm bao gồm 40 hợp chất: tanshinon IIA, tanshinon IIB, przewaquinon A, cryptotanshinon, có nhiều tác dụng sinh học tạo màu Đan sâm Trong số thành phần tan dầu, tanshinon IIA, cryptotanshinon, dihydrotanshinon tanshinon I diterpen chính có Đan sâm [29] Hình 1.2: Cấu trúc số diterpenoid có rễ Đan sâm 1.1.3.2 Thành phần tan nước Thành phần tan nước: Bao gồm acid phenolic dẫn chất Các acid phenolic thu hút ý nhà khoa học 20 năm qua chúng có tác dụng dược lý đáng ý thuận tiện việc sử dụng loại thảo mộc thông thường bằng cách sắc với nước Hơn 30 acid phenolic phân lập từ Đan sâm bao gồm acid salvianolic A, acid salvianolic B, acid salvianolic C, acid protocatechuic, danshensu, acid lithospermic dẫn xuất khác [8], [23] BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ QUỲNH TRANG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TANSHINON IIA TỪ DƯỢC LIỆU ĐAN SÂM LÀM CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 ... lượng tanshinon IIA bằng phương pháp HPLC 2.2.2 Chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm - Nghiên cứu tìm quy trình chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm có... tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp đánh giá hàm lượng tanshinon IIA dược liệu Đan sâm Tiến hành kiểm tra nguyên liệu theo chuyên luận. .. nguyên liệu chiết xuất tanshinon IIA 3.1.2 Quy trình chiết xuất tanshinon IIA từ dược liệu Đan sâm Bước 1: Chiết xuất tạo cao đan sâm Dược liệu đạt yêu cầu hàm lượng tanshinon IIA theo DĐVN V (Bảng