BÁO cáo môn THÍ NGHIỆM hóa SINH tên bài ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG – Bm CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO MÔN THÍ NGHIỆM HĨA SINH Người hướng dẫn: Ph.D Trần Thị Tuyết Nhung Lớp: 20060302 Nhóm: S4-N2 Hồng Trần Thảo Như MSSV: 62001024 Trần Thị Kim Huyền MSSV: 62000991 Nguyễn Thị Tâm Thanh MSSV: 62001047 4.Huỳnh Võ Trường Giang MSSV: 62000973 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2022 Bài số Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL Ngày thí nghiệm: 29/06/2022 I Nguyên tắc Điểm Qua giai đoạn: • Giai đoạn vơ hoá: Nitơ tổng số tất dạng nitơ có mẫu Khi đót nóng mẫu cần phân tích với H2SO4 đậm đặc có mặt chất xúc tác, nitơ tất dạng đạm có mẫu biến thành dạng vô (NH4)2SO4 tan dung dịch • Giai đoạn cất đạm: Sau vơ hoá Ta đuổi NH3 khỏi dung dịch NaOH Lượng NH3 lôi máy Parnas dẫn đến erlen có chứa lượng thừa H2SO4 biết xác nồng độ Định lượng H2SO4 cịn lại NaOH, qua tính nitơ có mẫu H2SO4dư + NaOH = Na2SO4 + H2O II (4) Cách tiến hành: II.2.1 Rửa bình Parnas-Wagner • Cho nước vào bình A khoảng nửa bình, thêm vài giọt methyl đỏ; thêm dung dịch H2SO4 2N nước bình hóa đỏ, khóa van (1) • Cho nước qua ống sinh hàn D, khóa van (2) (3) • Đun cho A sơi đều, cho vào C nước cất, mở van (2) cho nước chảy nitơ xuống B (lưu ý: không cho nƣớc chảy xuống hết mà giữ lại để hệ thống ln ln kín) Hơi nước A từ từ qua E, để E khoảng ml Tắt bếp A, nước máy nguội làm giảm áp suất A B nƣớc B rút qua G Khi nước rút hết thêm nước vào C, mở van (2) nước bị rút hết qua G Ta làm vài ba lần Nếu nước G đầy, mở van (3) xả hết Xong khóa van (1), (2), (3) Chú ý: để erlen E vào lấy không để hệ thống bị hở, đặc biệt vị trí nối 4,5,6 II.2.2 Cất đạm Cho vào ống Kjendahl 2mL nước mắm lắp vào thiết bị vơ hố mẫu Bổ sung từ từ 15 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống Kjeldahl Thêm 10mL HClO4 làm xúc tác Đun khoảng 2h đến dung dịch bình suốt Chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 100mL định mức vừa đủ 100mL Lấy 20mL dung dịch sau pha loãng cho vào bình cầu Lắp ráp thiết bị bổ sung 20mL H2SO4 vào erlen Bổ sung vào bình cầu lượng NaOH đậm đặc dư (khoảng 710mL) Đun cất đạm đến NH3 giải phóng hồn tồn Cho giọt phenolphtalein vào bình Định phân dung dịch H2SO4 dư dd NaOH 0.1N Tính tốn hàm lượng (%) nitơ có mẫu II.3 Tính tốn: II.3.1 Tính hệ số hiệu chuẩn F dung dịch NaOH • Lấy 10 ml H2SO4 0,1N chuẩn cho vào erlen, định phân NaOH 0,1N • Tính nồng độ thực tế dung dịch NaOH đem định phân • F tỉ số nồng độ thực tế nồng độ lý thuyết NaOH II.3.2 Tính kết Hàm lượng nitơ mẫu tính theo cơng thức: X= (𝑎−𝑏.𝐹).0,0014.100.1000 10.𝑉 Trong đó: X: hàm lượng nitơ tính g/l a: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ H2SO4 thừa V: số ml mẫu đem vơ hóa 0,0014: lượng gam nitơ ứng với ml H2SO4 0,1N F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dd NaOH 0,1 N Tính hàm lượng protein thơ thơng qua hàm lượng nitơ tổng • Nitơ vật liệu sinh học chủ yếu nitơ protein ngồi cịn có lượng nhỏ nitơ thành phần khác gọi nitơ phi protein Nitơ tổng = Nitơ protein + Nitơ phi protein • Hàm lượng protein vật liệu sinh học tính cách nhân hàm lượng nitơ protein với hệ số chuyển đổi xác định hàm lượng nitơ có tỉ lệ ổn định từ 15 đến 18% protein, đại đa số protein 16% • Trong nguyên vật liệu sinh học hàm lượng nitơ phi protein nhỏ việc tách riêng phức tạp nên theo quy ước người ta tính hàm lượng protein theo nitơ tổng gọi protein thơ hay protein tổng Cơng thứ tính hàm lượng phần trăm protein thơ có đại đa số nguyên liệu là: Protein (%) = Nitơ (%) x 6,25 Riêng ngũ cốc đậu có hệ số chuyển đổi 5,7 Sữa có hệ số chuyển đổi 6,38 III Kết III.1 Kết thí nghiệm: Khi chuẩn độ ta thấy dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt với thể tích chuẩn độ 9.7mL Hình III.1: Kết sau chuẩn độ III.2 Kết tính tốn III.2.1 Tính hệ số chuẩn F dung dịch NaOH: VNaOH(mL) 10,2 10,3 10,3 CN 0,098 0,097 0,097 F 0,98 0,97 0,97 Ta tích chuẩn độ: V=10,3 mL CN(NaOH) = Ftrung bình = CN n VH2 SO4 ×n VNaOH = 0.097 = 0.97 III.2.2 Tính hàm lượng Nito có mẫu X= 𝑋= (𝑎−𝑏.𝐹).0,0014.100.1000 10.𝑉 (20 − 18,53 0,97).0,0014.100.1000 = 28,36𝑔/𝑚𝑙 10.1 Trong đó: X: hàm lượng nitơ tính g/l a: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ H2SO4 thừa V: số ml mẫu đem vơ hóa 0,0014: lượng gam nitơ ứng với ml H2SO4 0,1N F: hệ số hiệu chỉnh nông độ dd NaOH 0,1 N Hàm lượng protein thô là: Protein (%) = Nitơ (%) x 6,25 = 28,36 x 6.25 = 177,25 % IV Biện luận: IV.1 Giải thích tượng, cơng đoạn thơng số thí nghiệm: -Việc bổ sung từ từ 20mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống Kjendahl để vô hoá mẫu để tránh tượng háo nước nhanh làm bắn nước tung toé Ta dùng H2SO4 đậm đặc H2SO4 đậm đặc chất oxi hoad mạnh không bay nhiệt độ phòng mà bay nhiệt độ 450oC-500oC nên hạn chế việc nhiễm độc tránh thất Ngồi H2SO4 ngun liệu dễ kiếm giá thành không mắc - Ta bổ sung HClO4 để làm tăng nhiệt độ sôi hỗn hợp giúp trình xảy nhanh - Khi ta nhìn thấy bình suốt chứng tỏ sản phẩm vơ hố hồn tồn tạo muối (NH4)2SO4 Vì đay q trình phân tích tiết kiệm hoá chất nên ta pha dung dịch mẫu với nước lấy lượng nhỏ để phân tích Sau ta thêm NaOH đậm đặc đun nóng để đuổi NH3 muối (NH4)2SO4 - Ta định phân dung dịch NaOH 0.1N Trước dung dịch có bổ sung vài giọt phenolphtalein để biết điểm dừng định phân Khi dung dịch vừa chuyền sang màu hồng nhạt bền vững trình hồn tất IV.2 Nhận xét: - Kết thí nghiệm thu nhỏ số liệu mà sản phẩm cung cấp - Đánh giá kết quả: chấp nhận có kết bị ảnh hưởng nhiều yếu tố khách quan -Nguyên nhân ảnh hướng đến kết thí nghiệm: • Do phương pháp đo: phương pháp kjendahl có mức độ sai số định • Do dụng cụ đo: dụng cụ đo có mức độ sai số khác nhau, sai số thiết bị lớn kết bị ảnh hướng nhiều • Do cách tiến hành đo: thao tác tiến hành người thực nên trình đong chưa đạt đến độ xác cao, thao tác bị hạn chế định -Các phương pháp giảm thiểu sai số: • Sử dụng phương pháp khác có độ xác cao • Sử dụng dụng cụ đong đo xác hươn có kinh phí đầu tư loại máy tự động giúp người giảm thao tác trực tiếp vào thí nghiệm • Nâng cao tay nghề người thực việc luyện tập nhiều lần -Mở rộng vấn đề: thực tế phương pháp kjendahl đo lượng nitơ tổng xác áp dụng khác phổ biến phòng thí nghiệm Một sooss phương pháp khác áp dụng nhiều việc xác định nitơ tổng phương pháp Dumas, phương pháp Biuret, phương pháp Lowly Bài số Điểm Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C VÀ KHẢO SÁT CÁC ENZYME HƠ HẤP Ngày thí nghiệm: 29/06/2022 I ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C: I.1 Nguyên tắc: - Acid ascorbic (vitamin C) hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol Acid ascorbic bị phá hủy nhanh tác dụng chất oxy hóa bền môi trường acid - Phương pháp dựa nguyên tắc acid ascorbic có khả oxy hóa thuận nghịch nhờ phân tử có nhóm endiol – C(OH) = (OH)C – Ta xác định acid ascorbic phương pháp chuẩn độ KIO3/KI theo phản ứng sau - Lượng iod tạo phương trình (1) oxy hóa acid ascorbic thành acid dehydroascorbic, phương trình (2) Khi hết acid ascorbic, iod thừa làm thị hồ tinh bột hóa xanh I.2 Cách tiến hành: I.2.1 Chuẩn bị mẫu: + Nếu mẫu rắn: cân m (g) mẫu (sao cho 10ml dịch chiết dùng định phân chứa từ 0,15 – 0,20 mg vitamin C, nguyên liệu giàu vitamin C chanh, ớt, khoai tây cân – 5g, rau khác cân 10 – 50g; sản phẩm đóng hộp cân – 10g tùy loại) Cho mẫu vào cối, đổ HCl 1% ngập mẫu, lấy mẫu tránh dùng dụng cũ sắt đồng Nghiền mẫu (không 10 phút), lọc chuyển vào bình định mức, định phân đến vạch HCl 15 + Nếu mẫu lỏng, chuyển thẳng vào bình định mức, định phân đến vạch HCl 1% I.2.2 Tiến hành: + Hút 10ml dịch chứa vitamin C từ bình định mức vào erlen 100ml, thêm vào vài giọt hồ tinh bột 1% định phân KIO3/KI 0,01N xuất màu xanh (định phân lần, kết định phân không sai lệch 0,03ml) + Tiến hành song song mẫu kiểm chứng, thay dịch chứa vitamin C dung dịch HCl 1% I.3 Kết quả: I.3.1 Kết thí nghiệm: Định phân lần 1, lần lần 3: Đều xuất màu xanh với thị hồ tinh bột 0,3ml KIO3/KI Định phân mẫu kiểm chứng Mẫu định phân Mẫu kiểm chứng Hình I.3.1 Kết mẫu sau định phân mẫu kiểm chứng I.3.2 Kết tính tốn: a = 0,3 ml b = 0,1 ml VDM = 50 ml V = 10 ml (𝑎 − 𝑏) × 0,88 × 100 × 𝑉𝐷𝑀 10 × 𝑉( ℎ𝑎𝑦 𝑚) 𝑋= = (0,3−0,1)×0,88×100×50 10×10 = 8,8 mg/50 ml II CÁC ENZYME HƠ HẤP II.1 Dehydrogenase: ` II.1.1 Nguyên tắc: Dehydrogenase nhóm enzyme oxi hóa khử xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ chất giai đoạn đầu chuỗi hơ hấp Có vai trị quan trọng trình sinh tổng hợp II.1.2 Cách tiến hành: Bước 1: Cho vào ống nghiệm vài lát củ cải cắt mỏng cỡ 2x2x1mm (dài x rộng x dày) đến 1/3 ống nghiệm Bước 2: Thêm dung dịch xanh Methylene 0,01% ngập củ cải cm Bước 3: Đổ lên lớp dầu lửa kín khí Để Dehydrogenase khơng tác dụng với O2 khơng khí Bước 4: Đặt ống nghiệm vào nước ấm 40°C 30 phút Bước 5: Làm ống kiểm chứng không chứa củ cải Bước 6: Quán sát kết quả, nhận xét giải thích II.1.3 Kết quả: II.1.3.1 Kết thí nghiệm Hình II.1.3.1 Kết thu thí nghiệm Chú thích: + Ống thí nghiệm bên trái: sau 30 phút, khơng có thấy tượng xảy + Ống thí nghiệm bên phải: sau 30 phút, thấy tượng dung dịch Methylene bị màu chuyển từ màu xanh sang màu xanh trắng II.1.4 Bàn luận: + Ống thí nghiệm bên phải: chứa củ cải dung dịch có nhạt màu Vì Dehydrogenase oxi hóa khử màu xanh Methylene trình sinh tổng hợp enzyme Dehydrogenase củ cải + Ống thí nghiệm bên trái: khơng chứa củ cải khơng có tượng xảy II.2 Catalase II.2.1 Nguyên tắc Catalase loại enzyme Hemoprotein Ở tế bào thực vật catalase chứa nhóm Hem, enzyme xúc tác Fe nhóm ngoại khơng thay đổi hóa trị II.2.2 Cách tiến hành • Nghiền kỹ 10g khoai tây • Thêm 10ml nước cất nghiền → Lọc vào ống nghiệm • Hút 0,5ml dịch lọc cho vào ống nghiệm có chứa 2ml H2O2 1%, lắc nhẹ II.2.3: Kết thí nghiệm: Hình II.2.3.1: Hình khoai tây sau lọc Hình II.2.3.2: Sau cho H2O2 1% vào xuất sủi bọt khí II.4 Bàn luận: - Có tượng sủi bọt sủi bọt khí nhiều lắc nhiều khí oxi bay lên trình khoai tây phản ứng với H2O2 1% Bài số 4: Điểm Tên bài: ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN Ngày thí nghiệm: 29/06/2022 ĐỊNH TÍNH ACID AMIN BẰNG NINHYDRIN I I.1 Nguyên tắc: Khi phản ứng với ninhydrin nhiệt độ cao acid amin bị dezamin hóa, oxy hóa nhóm COOH tạo thành NH3 aldehyde tương ứng ninhydrin bị khử tạo hydidren Sau diceto oxyhydidren, NH3 tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử ninhydrin thứ hai tạo phức hợp có màu xanh tím I.2 Cách tiến hành: Lấy ống nghiệm tiến hành sau: Ống nghiệm Protein trứng Ninhydrin Gia nhiệt 1ml 1ml Đun nhẹ (hấp cách thủy) 1ml 1ml Không đun I.3 Kết quả: I.3.1 Kết thí nghiệm: Hình I.3.1: Hai ống nghiệm ban đầu Hình I.3.2: Kết ống nghiệm sau đun I.4 Bàn luận: Ta thấy sau ống nghiệm đem đun nóng thời gian dung dịch tạo phức có màu xanh tím có kết tủa lắng xuống đáy ống nghiệm Có xuất kết tủa protein trứng nhiệt độ cao có tượng đơng tụ tạo thành tủa Do ninhydrin nhiệt độ cao acid amin bị dezamin hóa Oxy hóa nhóm COOH tạo thành NH3 aldehyde tương ứng ninhydrin bị khử tạo thành diceto oxyhydidren NH3 tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử ninhydrin thứ hai tạo phức hợp có màu xanh tím ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN THEO PHƯƠNG PHÁP II SORENSEN II.1 Nguyên tắc: Dưới tác dụng formaldehyde (formol) nhóm amin bị methylene hóa tạo thành dẫn xuất methylene acid amin (Còn gọi phương pháp chuẩn độ formol) R─CH─COOH + HCHO → NH2 R─CH─COOH N=CH2 Các hợp chất tạo thành acid mạnh acid amin tự do, dễ dàng định phân kiềm qua gián tiếp tính lượng nitơ amin acid amin có nguyên liệu R─CH─COOH + NaOH → N=CH2 R─CH─COONa + H2O N=CH2 Khi dùng phương pháp cần ý điểm sau: ❖ Để cho phản ứng tạo dẫn xuất methylene tiến hành hoàn toàn, cần có dư dung dịch formaldehyde phản ứng trung hịa hồn tồn nhóm cacboxyl thực pH môi trường đạt tới 9,2 – 9,5 ❖ Arginin không phản ứng với formaldehyde không tính chuẩn kiềm ❖ Tirozin cho kết cao ngồi nhóm cacboxyl, nhóm phenol có tác dụng với kiềm Một số acid amin cho kết prolin ❖ Nếu dung dịch có chứa nhiều NH3, dịch thủy phân protein phải loại bỏ NH3 trước chân không nhiệt độ 40°C ❖ Các muối amon NH4Cl, (NH4)2SO4 tác dụng với formaldehyde tạo thành hexamethylene tetramin acid Acid sau trung hịa kiềm: 2(NH4)2SO4 + 6CH2O 4NH4Cl + 6CH2O → (CH2)6N4 + 2H2SO4 + 6H2O → (CH2)6N4 + 4HCl + 6H2O ❖ Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật lỗng màu đậm khó nhận biết thay đổi màu chuẩn độ ❖ Dùng phương pháp kết thật với trường hợp acid monoamino monocacboxylic Để kết với trường hợp (khi dung dịch acid monoamino monocacboxylic cịn có chứa acid monoamino dicacboxylic diamino monocacboxylic) cần phải trung hòa dung dịch đến pH trước phân tích ❖ Để xác định điểm bắt đầu (pH 7) điểm kết thúc (pH 9,2), người ta dùng phương pháp so màu Tạo hai thang màu chuẩn pH pH 9,2 đưa pH mẫu 7(so sánh màu với màu chuẩn pH 7) sau định phân đến pH 9,2 (so sánh màu với màu với pH 9,2) II.2 Cách tiến hành: II.2.1 Chuẩn bị thang màu có pH pH 9,2: Lấy bình erlen có dung tích Cho vào bình thứ nhất: 20mL dung dịch có pH giọt Bromthymol Blue 0.04% Cho vào bình thứ 2: 20mL dung dịch có pH 9,2; giọt Bromthymol Blue 0.04% giọt phenolphtalein 0.5% Bình thứ hai pH 9.2 Bình thứ pH7 Hình II.2.1 Hai bình erlen sau pha mẫu Khi dung dịch bình thứ có màu xanh lục nhạt, dung dịch bình có màu tím xanh II.2.2 Chuẩn bị dung dịch formol trung tính Cho vào erlen luợng formol cần dùng, cho vào giọt phenolphtalein 0.5%.; nhỏ từ từ dung dịch NaOH màu hồng nhạt xuất Đậy nắp erlen Lưu ý tránh formol xộc vào mũi, mắt Hình II.2.2 Dung dịch formol sau pha II.3 Tiến hành địnnh phân mẫu: Xác định lượng nitơ amin nước mắm Nước mắm dung dịch thủy phân protein định lượng phương pháp chuẩn độ formol Pha loãng 100 lần 1ml nước mắm nước cất Lấy vào erlen 20ml mẫu pha loãng Thêm giọt Bromthymol Blue Nếu dung dịch có màu xanh dương: thêm giọt HCl hay H2SO4 0.05N Nếu dung dịch có màu vàng: thêm giọt NaOH 0.05N Dung dịch có màu ứng với màu bình (pH 7) Thêm giọt phenolphtalein 0.5% + mL formol trung tính Hình II 3.1 Kết theo pH Chuẩn độ NaOH dung dịch có màu ứng với màu bình (pH 9,2) Hình II 3.2 Kết theo pH 9,2 • Mẫu kiểm chứng: Thay mẫu nước mắm pha lỗng mẫu nước cất Hình II 3.3 Kết mẫu kiểm chứng pH Hình II.3.4 Kết mẫu kiểm chứng pH 9,2 Hình Hình II.4 Kết quả: 𝑋= (𝑎 − 𝑏) × 𝑇 × 0.0007 × 𝑉𝐷𝑀 × 1000 20 × 𝑉 Trong đó: x: lượng gam Nitơ acid amin có 1L nước mắm a: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm b: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn VDM: thể tích bình định mức V: số mL nước mắm cho vào bình định mức 0,0007: số gam Nitơ ứng với 1mL NaOH 0.05N II.4.1 Kết tính tốn • Mẫu nước mắm: a1 = 3.4mL a2 = 3.4mL a3 = 3.4mL => a = 3.4mL • Mẫu kiểm chứng: b = 0.25 • Hệ số hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn: T = 0.1 0.05 =2 Số gam Nitơ acid amin có lít nước mắm: 𝑋= = (𝑎 − 𝑏) × 𝑇 × 0.0007 × 𝑉𝐷𝑀 × 1000 20 × 𝑉 (3.4 − 0.25) × × 0.0007 × 100 × 1000 = 22,05𝑔 20 × Kết luận: có 22,05g Nitơ acid amin có lít nước mắm  ... phương pháp khác áp dụng nhiều việc xác định nitơ tổng phương pháp Dumas, phương pháp Biuret, phương pháp Lowly Bài số Điểm Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C VÀ KHẢO SÁT CÁC ENZYME HƠ HẤP Ngày thí nghiệm: ... Bài số Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL Ngày thí nghiệm: 29/06/2022 I Nguyên tắc Điểm Qua giai đoạn: • Giai đoạn vơ hoá: Nitơ tổng số tất dạng nitơ có mẫu Khi... vào thí nghiệm • Nâng cao tay nghề người thực việc luyện tập nhiều lần -Mở rộng vấn đề: thực tế phương pháp kjendahl đo lượng nitơ tổng xác áp dụng khác phổ biến phịng thí nghiệm Một sooss phương