NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN. LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN Chuyên ngành : Sinh lý học thực vật Mã số : 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học HÀ NỘI, 2015 i Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Hà tận tình hƣớng dẫn, động viên giúp đỡ tơi suốt trình thực luận án Xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, cán Phòng Quản lý tổng hợp, phận quản lý đào tạo sau đại học tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Phịng Tổ chức cán bộ, Phịng Khoa học Cơng nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi mặt suốt q trình thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới TS Phạm Bích Ngọc-Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, PGS.TS Lê Văn Sơn-Phịng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thành đề tài Trong thời gian thực đề tài nhận đƣợc giúp đỡ tận tình tập thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng Công nghệ ADN ứng dụng Nhân dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, bạn đồng nghiệp, ngƣời ln động viên góp ý cho tơi thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh La Việt Hồng ii Lời cam đoan Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2015 Tác giả La Việt Hồng iii Mục lục Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Ý nghĩa lý luận ý nghĩa thực tiễn .3 4.1 Ý nghĩa lý luận 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đóng góp luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN .4 1.1.1 Protein protein tạo cảm giác 1.1.2 Đặc điểm sinh học thần kỳ miraculin 1.2 TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT .14 1.2.1 Lựa chọn hệ thống biểu .14 1.2.2 Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) .15 1.2.3 Ảnh hƣởng terminator đến biểu gen chuyển 20 1.2.4 Thay đổi mã di truyền gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu 20 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA 22 1.3.1 Dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) .22 1.3.2 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật 24 1.3.3 Cây cà chua chuyển gen 25 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 iv 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Vật liệu thực vật 30 2.1.2 Vector chủng vi khuẩn 30 2.1.3 Hóa chất thiết bị máy móc 31 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu .31 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu họ cà 33 2.2.2 Thiết kế mồi 34 2.2.3 Phân lập promoter terminator 34 2.2.4 Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin 38 2.2.5 Phƣơng pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc cà chua chuyển gen 41 2.2.6 Phân tích tiêu sinh lý dòng chuyển gen 43 2.2.7 Phân tích dịng chuyển gen kỹ thuật sinh học phân tử 44 2.2.8 Phân tích biểu gen dòng chuyển gen 47 2.2.9 Phân tích thống kê kết thực nghiệm .48 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .49 3.1 THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ TERMINATOR HSP 18.2 49 3.1.1 Thay đổi mã di truyền gen miraculin phù hợp với hệ biểu họ cà 49 3.1.2 Phân lập tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis .51 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA .58 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter 60 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62 3.2.4 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 v 3.2.5 Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium .65 3.3 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ .66 3.3.1 Biểu protein miraculin tái tổ hợp dòng tế bào BY2 66 3.3.2 Biểu protein miraculin tái tổ hợp rễ tơ thuốc 71 3.4 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY CÀ CHUA 79 3.4.1 Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin .79 3.4.2 Kiểm tra có mặt gen miraculin dòng cà chua kỹ thuật PCR 83 3.4.3 Phân tích biểu mức mRNA gen miraculin số dòng cà chua chuyển gen .84 3.4.4 Xác định số copy dòng cà chua chuyển gen kỹ thuật Southern 85 3.4.5 Đánh giá số tiêu sinh trƣởng số dòng cà chua chuyển gen 86 Chƣơng THẢO LUẬN 91 4.1 Tăng cƣờng biểu protein tái tổ hợp thực vật .91 4.2 Biểu miraculin tái tổ hợp dòng tế bào BY2 rễ tơ thuốc .94 4.3 Biểu miraculin tái tổ hợp cà chua chuyển gen .99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .104 NHỮNG CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105 SUMMARY 106 Overview: 106 Objectives: .107 Contents: 107 Results: 107 Discussion: 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .112 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc tính protein tạo cảm giác Bảng 1.2 So sánh ƣu nhƣợc điểm hệ thống biểu protein tái tổ hợp 14 Bảng 2.1 Trình tự nucleotide cặp mồi sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng lai ghép tạo vector tái tổ hợp 37 Bảng 3.1 So sánh trình tự promoter E8 phân lập với trình tự promoter E8 cơng bố 53 Bảng 3.2 So sánh trình tự nucleotide promoter HSP 18.2 phân lập đƣợc với trình tự gen/promoter HSP 18.2 công bố 56 Bảng 3.3 Kết tạo chọn lọc dòng tế bào BY2 mang gen chuyển miraculin 66 Bảng 3.4 Khối lƣợng tƣơi khối lƣợng khô số dòng tế bào BY2 chuyển gen 69 Bảng 3.5 Kết tạo dòng rễ tơ chuyển gen miraculin 72 Bảng 3.6 Khối lƣợng tƣơi khối lƣợng khơ số dịng rễ tơ chuyển gen 75 Bảng 3.7 Chỉ tiêu chiều dài số dòng rễ tơ chuyển gen 76 Bảng 3.8 Kết tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin 81 Bảng 3.9 Một số tiêu sinh trƣởng hình thái năm dịng cà chua chuyển gen 87 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) cắt dọc Hình 1.2 Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy phần thịt thần kỳ Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc 3D protein miraculin dạng homodimer Hình 1.4 Mơ hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác 10 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32 Hình 3.1 Trình tự gen miraculin trƣớc (AB512278.1) sau thay đổi mã di truyền 50 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập nhân dịng promoter E8 52 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập nhân dịng promoter HSP 18.2 55 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập nhân dòng terminator HSP 18.2 57 Hình 3.5 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 59 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S/Mir/HSP-ter 61 Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 64 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ Agrobacterium 65 Hình 3.13 Q trình tạo dịng tế bào thuốc BY2 mang gen miraculin 67 Hình 3.14 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen miraculin dịng BY2 kỹ thuật PCR 68 viii Hình 3.15 Hình ảnh phân tích biểu protein miraculin số dòng tế bào BY2 chuyển gen 70 Hình 3.16 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp số dịng BY2 chuyển gen 71 Hình 3.17 Q trình tạo chọn lọc dịng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin 73 Hình 3.18 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen miraculin dịng rễ tơ kỹ thuật PCR 74 Hình 3.19 Hình ảnh chiều dài số dòng rễ tơ thuốc chuyển gen 74 Hình 3.20 Hình ảnh phân tích biểu protein miraculintrong số dòng rễ tơ 78 Hình 3.21 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp số dịng rễ tơ chuyển gen 79 Hình 3.22 Quá trình tạo sàng lọc cà chua chuyển gen miraculin 82 Hình 3.23 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen miraculin dịng cà chua kỹ thuật PCR 83 Hình 3.24 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra biểu mRNA gen chuyển miraculin dòng cà chua 84 Hình 3.25 Hình ảnh xác định số copy dòng cà chua chuyển gen kỹ thuật Southern Blot 86 Hình 3.26 Hình ảnh dịng cà chua chuyển gen ngồi tự nhiên 88 Hình 3.27 Quả cà chua giai đoạn chín đỏ 89 Hình 3.28 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp vỏ cà chua chuyển gen 89 ix DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT µg microgam 3‟UTR, 5‟ UTR Vùng 3' 5‟ không dịch mã 35S Promoter CaMV35S AS Acetosyringone Asn Asparagine BAP Benzylaminopurine bp Base pair BY2 Bright Yellow2 cDNA Complementary DNA CTAB Hexadecyltrimethyl ammonium bromide Cys Cysteine DEPC Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate E coli Escherichia coli E8-pro Promoter E8 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay HRP Horseradish Peroxidase HSE Heat shock Element HSP Heat shock protein HSP-pro Promoter HSP 18.2 HSP-ter Terminator HSP 18.2 IAA Indole Acetic acid kb Kilobase kDa Kilodalton x LB Biên trái (left T-DNA border) mg miligam mg/l mg/ml miligam/lít miligam/mililít MIR Protein miraculin ml mililít Mơi trƣờng LB Môi trƣờng Luria Bertani MS Murashige Skoog NAA Naphthaleneacetic acid ng nanogam NOS nopaline synthase gen NOS-ter Terminator nopaline synthase gene NptII (kanar) Gen kháng kanamycin PCR Polymerase Chain Reaction PCS Polycloning site RB Biên phải (right T-DNA border) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine v/p vòng/phút WT Wild type ZR Zeatin riboside MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, chất làm nhân tạo nhƣ saccharin, aspartame, sucralose acesulfame-K đƣợc ngƣời sử dụng phổ biến nhƣ chất làm lƣợng, nhằm giảm nguy mắc bệnh mạn tính liên quan đến đƣờng nhƣ béo phì, đái tháo đƣờng Tuy nhiên, số hợp chất gây ung thƣ (Kant 2005) Trong tự nhiên, có nhiều loại protein protein tạo cảm giác đƣợc phát bao gồm thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin, brazzein, neoculin (curculin) miraculin Các protein đƣợc sử dụng để thay chất làm nhân tạo chúng tạo vị cho ngƣời sử dụng, an tồn có nguồn gốc tự nhiên sinh lƣợng Tuy nhiên, sản lƣợng tự nhiên protein bị hạn chế hầu hết protein thu đƣợc từ sống vùng nhiệt đới, nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt (Kant 2005) Gần đây, nhà khoa học nghiên cứu biểu thành công số protein tạo vị nhƣ thaumatin, monellin, brazzein miraculin quy mơ phịng thí nghiệm số hệ thống biểu nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm, tế bào BY2, hệ thống nuôi cấy rễ tơ trồng chuyển gen (Masuda, Kitabatake 2006, Pham Bich Ngoc 2009) Tuy nhiên, mức độ tích lũy protein tái tổ hợp thấp, dẫn đến nghiên cứu protein protein tạo vị chƣa thể sản xuất thƣơng mại sản phẩm tái tổ hợp Miraculin số protein tạo vị ngọt, có thần kỳ (Richadella dulcifica), có đặc tính tạo cảm giác để thay đổi từ vị chua thành cảm giác mà chất miraculin khơng Tính chất độc đáo miraculin có ích cho ngƣời nhằm ngăn ngừa bệnh đại chất làm nhân tạo gây Miraculin chất sinh lƣợng Do vậy, sử dụng miraculin để thay đƣờng, giúp ngƣời sử dụng tránh đƣợc nguy mắc bệnh béo phì Với tính chất độc đáo nhƣ vậy, xong sản lƣợng miraculin tự nhiên bị hạn chế thần kỳ sinh trƣởng chậm nơi khí hậu khắc nghiệt Tây Phi Gần nhà khoa học nghiên cứu nhằm sản xuất miraculin tái tổ hợp số đối tƣợng khác Tuy nhiên, mức độ tích lũy miraculin tái tổ hợp hệ thống biểu chƣa đƣợc nhƣ kỳ vọng Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: “Nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp miraculin dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc cà chua chuyển gen” Mục tiêu nghiên cứu Thay đổi mã di truyền gen miraculin thần kỳ, thiết kế vector chuyển gen với promoter đặc hiệu promoter cảm ứng để chuyển vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc cà chua nhằm thu đƣợc dịng chuyển gen có khả biểu miraculin tái tổ hợp Nội dung nghiên cứu 1) Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu họ cà Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ cà chua, promoter HSP 18.2 terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana 2) Thiết kế vector biểu miraculin dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc cà chua 3) Biểu protein tái tổ hợp miraculin dòng tế bào BY2 rễ tơ thuốc 4) Biểu protein tái tổ hợp miraculin cà chua 3 Ý nghĩa lý luận ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa lý luận Đề tài cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu tăng cƣờng mức độ biểu gen chuyển thực vật cách thay đổi mã di truyền, promoter, terminator hệ thống biểu thực vật 4.2 Ý nghĩa thực tiễn 1) Sản xuất protein tái tổ hợp miraculin quy mơ phịng thí nghiệm dịng tế bào BY2 rễ tơ chuyển gen 2) Sản xuất protein tái tổ miraculin tự nhiên cà chua chuyển gen Đóng góp luận án 1) Protein tái tổ hợp miraculin đƣợc biểu thành cơng dịng tế bào BY2 với hàm lƣợng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng số; biểu hệ thống rễ tơ thuốc lá, hàm lƣợng tự 13,7-19,97 ng/µg protein tan tổng số 2) Miraculin tái tổ hợp đƣợc biểu thành cơng cà chua, gồm dòng mang đơn copy gen chuyển, hàm lƣợng cao dòng cà chua đƣợc chuyển cấu trúc biểu đặc hiệu quả, đạt 118,0 ng/µg protein tan tổng số, cao gấp lần so với dòng đƣợc chuyển cấu trúc mang promoter 35S 4 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN 1.1.1 Protein protein tạo cảm giác Hiện nay, nghiên cứu giới xác định đƣợc loại protein protein tạo cảm giác từ tự nhiên Theo đặc tính chia thành nhóm: (i) protein (thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin brazzein), (ii) protein cảm ứng độ (miraculin) (iii) protein có đủ đặc tính hai nhóm (neoculin) Các thuộc tính tính chất chất protein đƣợc trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số đặc tính protein tạo cảm giác (Kant 2005) Đặc tính Nguồn gốc Phân bố Biến thể Thaumatin Monellin Mabilin Pentadin Brazzein Curculin Miraculin T danielli Benth Tây Phi I, II, a, b, c D cumminsii Diels Tây Phi - C masaikai P Baillon P Baillon R dulcifica Tây Phi - Tây Phi - Độ (*) KLPT (kDa) Acid amin 3000 3000 Trung Quốc I, II-a, III, IV 100 C latifolia Malaysia - 500 2000 550 - 22,2 10,7 12,4 12,0 6,5 24,9 24,6 207 45 (chuỗi A) 50 (Chuỗi B) - 54 114 191 Monomer (A+B) 33 (chuỗi A) 72 (Chuỗi B) (A+B)(1) - Monomer (A+A)(2) (A+A), (A+A+A+A)(3) Dạng hoạt tính (*) Tây Phi - độ tính dựa theo khối lượng phân tử, (1) : heterodimer, (2): homodimer, (3): tetramer Trong số protein kể trên, monellin có độ 100.000 lần, sau brazzein thaumatin lần lƣợt khoảng 500 lần 3000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít) Tất protein đƣợc phân lập từ sống rừng mƣa nhiệt đới Các protein có tiềm ứng dụng công nghiệp để thay chất làm nhân tạo mà sinh lƣợng an tồn cho ngƣời sử dụng Brazzein Brazzein protein nhỏ thuộc nhóm protein tạo vị ngọt, protein chứa 54 acid amin Brazzein bền với nhiệt độ độ pH, có độ vào khoảng 500-2000 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử) có tiềm sử dụng nhƣ chất làm với lƣợng thấp Brazzein đƣợc phân lập từ Pentadiplandra brazzeana Baillon, loại sống Châu Phi Với đặc tính bền nhiệt bền với pH brazzein giúp nhà khoa học sử dụng brazzein để nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ độ pH đến hoạt tính tạo cảm giác protein nói chung (Izawa et al., 1996) Thaumatim Thaumatin thuộc nhóm protein tạo vị đƣợc phân lập từ vùng nhiệt đới Thaumatococcus danielli Thaumatin có 207 acid amin với cầu liên kết disulfide không chứa cystein tự Khi nhiệt độ 70oC pH 7,0 thaumatin có xu hƣớng kết dính lại hoạt tính tạo vị (Kaneko, Kitabatake 1999) Thaumatin có độ khoảng 10.000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít), protein đƣợc sử dụng nhiều quốc gia theo hƣớng tạo cảm giác tăng cƣờng độ (Zemanek, Wasserman 1995) Monellin Monellin protein chứa chuỗi peptide, chuỗi A có 44 acid amin chuỗi B chứa 50 acid amin (Ota et al., 1999) Protein đƣợc tinh từ Dioscoreophyllum cumminsii sống Tây Phi Độ monellin khoảng 100.000 lần so với đƣờng sucrose khoảng vài trăm lần dựa theo nồng độ mol/lít khối lƣợng Chuỗi đơn monellin có 94 acid amin đƣợc chứng minh có độ tƣơng tự nhƣ hai chuỗi monellin tự nhiên, dạng chuỗi đơn bền với nhiệt độ độ acid so với monellin tự nhiên (Lee et al., 1999) Các nghiên cứu gần xác định vị trí liên kết monellin với thụ thể vị giác ngƣời, vị trí gồm AsnA16, AsnA22, GlnA25 AsnA26 có hoạt tính tạo cảm giác lần lƣợt 7500, 750, 2500 5500 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử) (Kohmura et al., 1992) Curculin Curculin đƣợc thu nhận từ Curculigo latifolia, curculin có hoạt tính nhƣ chất làm sinh lƣợng Độ tối đa curculin tƣơng đƣơng với dung dịch sucrose 0,35 M Nó có khả tạo vị nƣớc chất chua sau sử dụng curculin Hoạt tính tạo vị curculin không thay đổi sau đƣợc xử lý nhiệt độ 50oC với pH từ 3-9 Mabinlin Mabinlin protein bền với nhiệt độ, đƣợc bắt nguồn từ Capparis masaikai, có độ khoảng 400 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử) Protein có chứa hai chuỗi, chuỗi A có 33 acid amin chuỗi B có 72 acid amin, chuỗi B có chứa hai liên kết disulfide chuỗi B liên kết với chuỗi A thông qua ba liên kết disulfide (Kohmura et al., 1992) Độ mabinlin-2 không thay đổi sau xử lý 48 điểm sôi, mabinlin-3 mabinlin-4 giữ đƣợc hoạt tính sau xử lý 80oC (Nirasawa et al., 1994) Pentadin Pentadin loại protein đƣợc tách chiết từ Pentadiplandra brazzeana, loại bụi đƣợc phát rừng nhiệt đới số quốc gia Châu Phi Độ khoảng 500 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử), phân tử chứa hai tiểu phần liên kết với qua cầu disulfide Đến chƣa có nhiều thơng tin protein (van der Wel et al., 1989) 1.1.2 Đặc điểm sinh học thần kỳ miraculin 1.1.2.1 Đặc điểm sinh học thần kỳ Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae) (Matsuyama et al., 2009) Đây loại bụi sống vùng nhiệt đới Tây Phi Trong điều kiện tự nhiên, cao khoảng m điều kiện nhân tạo chiều cao khoảng m Loại sinh trƣởng tốt đất có pH từ 4,5-5,8, điều kiện lạnh, chịu bóng nơi có độ ẩm tƣơng đối cao Cây thần kỳ có màu đỏ, kích thƣớc nhỏ (hình 1.1A, B), nhai phần thịt thần kỳ sau ăn vị chua chẳng hạn nhƣ chanh, lúc chanh có cảm giác mà khơng cịn vị chua Do vậy, đƣợc gọi tên “thần kỳ”, có đƣợc ngƣời dân Châu Phi dùng cách hàng trăm năm (Kurihara, Beidler 1968) Hình 1.1 Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) cắt dọc Tính chất tạo cảm giác sử dụng thần kỳ miraculin chứa tạo mà thân miraculin không Ƣu điểm việc sử dụng miraculin vừa tạo cảm giác vừa có lƣợng hấp thu thấp, tốt cho cải thiện bữa ăn bệnh nhân tiểu đƣờng béo phì (Sun et al., 2006a) Trong tự nhiên, miraculin đƣợc tích lũy thần kỳ tuần tuổi chuyển từ màu xanh sang màu cam miraculin đƣợc tích lũy nhiều trạng thái đỏ hoàn toàn, miraculin đƣợc tiết tích lũy lớp gian bào thần kỳ (Hirai et al., 2010b) (hình 1.2) 8 µg miraculin/g khối lƣợng tƣơi A B Quá chín Đỏ Da cam Đổi màu Quả xanh Quả xanh Hoa Nụ hoa Lá Thân Rễ C Quả Hình 1.2 Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy phần thịt thần kỳ (A) Hàm lƣợng miraculin đƣợc tích lũy thịt quả; (B) Miraculin thịt đƣợc phân tích Western blot; (C) Các giai đoạn phát triển thần kỳ (Hirai et al., 2010a, Hirai et al., 2011a, Kim et al., 2010b) Tại Việt Nam, Trần Danh Thế et al (2009) bƣớc đầu trồng thử nghiệm thần kỳ Thành phố Hồ Chí Minh, theo dõi đặc điểm sinh học nhƣ phân tích thành phần từ thịt thần kỳ giai đoạn chín đỏ, kết phân tích cho thấy dịch chiết gồm: nƣớc (68,9%), đƣờng tan tổng số (2,38%), đƣờng khử (0,40%), protein (0,10%), đạm tổng số (1,91%) khoáng tổng số (0,99%) Ngồi định tính đƣợc số thành phần dịch chiết thịt gồm tinh dầu, carotenoid, phytosterol, acid béo, flavonoid, polyphenol, acid hữu cơ, saponin steroid, đƣờng khử, hợp chất uronic (Trần Danh Thế et al., 2009) 1.1.2.2 Cấu trúc miraculin Miraculin glycoprotein, chuỗi polypeptide chứa 220 acid amin có 29 acid amin trình tự tín hiệu (Masuda et al., 1995) Khối lƣợng phân tử chuỗi đơn peptide đƣợc tính tốn dựa trình tự acid amin khoảng 24,6