Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.

Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium sp. trên khoai lang.

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây màu có khả năng thích nghi rộng, được trồng phổ biến trên toàn thế giới và là cây lương thực đứng thứ ba tại Việt Nam sau lúa và bắp Củ khoai lang chứa nhiều vitamin A, vitamin C, mangan, đồng, vitamin B6, chất xơ, sắt và canxi, trong khi thân lá còn được sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc Năm 2018, diện tích trồng khoai lang cả nước đạt 117.900 ha, trong đó Đồng bằng sông Cửu Long có 23.900 ha, đứng thứ ba cả nước về diện tích nhưng dẫn đầu về sản lượng với 559.500 tấn, chiếm 40,9% tổng sản lượng khoai lang quốc gia.

Theo đề án tái cơ cấu ngành nông nghiệp tỉnh Vĩnh Long giai đoạn 2017-2020, cây khoai lang được xác định là một trong ba cây trồng chủ lực để chuyển đổi cơ cấu cây trồng trên đất lúa Năm 2018, diện tích trồng khoai lang của tỉnh đạt 14.718 ha, trong đó huyện Bình Tân chiếm 96% với 14.132 ha và sản lượng lên tới 365.975 tấn Sản xuất khoai lang mang lại lợi nhuận cao gấp nhiều lần so với trồng lúa, giúp nâng cao thu nhập cho hộ dân Ngoài ra, việc trồng khoai lang cần nhiều lao động thủ công, góp phần giải quyết việc làm cho lao động phổ thông và thúc đẩy phát triển kinh tế địa phương.

Mặc dù canh tác khoai lang ở Bình Tân có nhiều thuận lợi, nhưng nông dân vẫn phải đối mặt với nhiều khó khăn, đặc biệt là sự xuất hiện của các mầm bệnh Trong số đó, bệnh héo rũ (héo vàng) do nấm gây ra đã gây thiệt hại nặng nề cho cây trồng.

Fusarium oxysporum là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn đến năng suất khoai lang trong quá trình canh tác Loại nấm này sống trong đất và có khả năng tồn tại lâu dài, gây thiệt hại đáng kể cho cây trồng.

Nấm phát triển nhanh ở thời tiết nóng ấm

(pH từ 4 t 5), thiếu đạm và lân thường bị bệnh nhiều, đất trồng độc canh cây khoai lang cũng là nguy cơ bị nhiễm bệnh cao.

Nấm bệnh cũng dễ dàng lây lan qua vết thương cơ giới hay tuyến trùng, côn trùng chích hút rễ cây

2006) Cây bị mắc bệnh có thể chết hoặc sinh trưởng, phát triển kém và giảm đáng kể về năng suất (Egel and Martyn, 2007).

Việc phòng và trị bệnh trong nông nghiệp chủ yếu phụ thuộc vào tập quán canh tác và việc sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên, lạm dụng nông dược dẫn đến nhiều hệ lụy như mầm bệnh biến đổi độc tính, mất cân bằng sinh thái, ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng sức khỏe con người và không hiệu quả về kinh tế Theo Nguyễn Trọng Ân (2013), nông dân ở huyện Ðình Tân sử dụng khoảng 78 hoạt chất với hơn 148 tên thương mại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) để quản lý dịch hại, với tần suất lên đến 19 ± 4 lần/vụ cho cây khoai Tím Nhật Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tất cả hộ được khảo sát đều sử dụng thuốc BVTV vượt quá liều lượng khuyến cáo, trong đó thuốc trừ sâu chiếm 94,1%, thuốc trừ bệnh 82,6%, thuốc trừ cỏ 71,5% và thuốc điều hòa sinh trưởng 91% (Võ Ngọc Thơ, 2018).

Để hạn chế mầm bệnh mà không ảnh hưởng đến môi trường, cần có giải pháp bền vững trong nông nghiệp, đặc biệt là thông qua các biện pháp sinh học Vi sinh vật đối kháng, đặc biệt là xạ khuẩn, đang cho thấy nhiều tiềm năng trong phòng trừ bệnh cây Xạ khuẩn có khả năng ức chế mầm bệnh bằng nhiều cơ chế như tiết kháng sinh, tiêu sinh, cộng sinh và ký sinh Chúng cũng tiết ra các enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, và cellulase, có khả năng ức chế nhiều loại mầm bệnh Đáng chú ý, khoảng 80% kháng sinh được phát hiện đến từ xạ khuẩn, và chúng còn kích thích khả năng kháng bệnh của cây trồng, giúp cây chống chịu với điều kiện bất lợi Hơn nữa, xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng trong phân giải chất hữu cơ và cố định nitơ, chứng tỏ tiềm năng to lớn của chúng trong nông nghiệp Nghiên cứu của Lê Minh Tường và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng một số xạ khuẩn thuộc chi này cần được nghiên cứu sâu hơn để khai thác hiệu quả.

Xạ khuẩn Streptomyces, được phân lập từ đất vùng rễ cây lúa, không chỉ hiệu quả trong việc phòng trị các bệnh như đạo ôn, đốm vằn và cháy bìa lá lúa mà còn tiết ra các enzyme quan trọng như chitinase, glucanase và cellulase Gần đây, nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số chủng Streptomyces có khả năng quản lý các bệnh hại quan trọng trên khoai lang ở Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm bệnh héo xanh do Ralstonia solanacearum, bệnh thối gốc do Slerotium sp và bệnh héo dây, thối củ do Fusarium solani Điều này chứng tỏ rằng xạ khuẩn có tiềm năng lớn trong việc quản lý bệnh hại trên cây khoai lang cũng như các loại cây trồng khác.

“Nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trị bệnh héo rũ do nấm

Fusarium sp trên khoai lang” được thực hiện là rất cần thiết.

MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã xác định loài nấm Fusarium sp là nguyên nhân gây bệnh héo rũ trên cây khoai lang tại huyện Ðịnh Tân, tỉnh Vĩnh Long Đồng thời, các chủng xạ khuẩn có khả năng quản lý bệnh héo rũ do nấm cũng đã được tuyển chọn thành công.

Fusarium sp là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trên cây khoai lang Nghiên cứu cơ chế liên quan đến khả năng quản lý bệnh của một số chủng xạ khuẩn tiềm năng sẽ giúp phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả Việc tìm hiểu sâu về tương tác giữa Fusarium sp và các chủng xạ khuẩn có thể mở ra hướng đi mới trong việc bảo vệ cây khoai lang khỏi bệnh tật.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên cây khoai lang, cùng với các chủng xạ khuẩn có khả năng phòng trị bệnh này Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại các xã trồng khoai lang thuộc huyện Tân Bình, tỉnh Vĩnh Long.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

Bài viết tập trung vào việc thu thập và phân lập các chủng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên khoai lang, đồng thời đánh giá khả năng gây hại của chúng Ngoài ra, nghiên cứu cũng xem xét khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn từ đất trồng khoai lang đối với nấm Fusarium oxysporum trong điều kiện phòng thí nghiệm Các cơ chế đối kháng tiềm năng của xạ khuẩn, như khả năng phân giải chitin và β-glucan, cũng được khảo sát Đặc biệt, khả năng quản lý bệnh héo rũ của các chủng xạ khuẩn trong điều kiện nhà lưới được đánh giá để xác định tính hiệu quả Việc định danh chính xác các chủng xạ khuẩn có triển vọng được thực hiện bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân tử Cuối cùng, nghiên cứu đánh giá khả năng phòng trị bệnh héo rũ của các chủng xạ khuẩn trong điều kiện ngoài đồng để xác định ứng dụng thực tiễn.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

Đề tài nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, xác định chính xác tác nhân nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên khoai lang tại huyện ình Tân, tỉnh Vĩnh Long Nghiên cứu cũng tìm ra các chủng xạ khuẩn có khả năng quản lý bệnh héo rũ do nấm Fusarium oxysporum gây ra Kết quả này sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển chế phẩm sinh học từ xạ khuẩn, không chỉ hiệu quả trong việc quản lý bệnh héo rũ hại khoai lang mà còn thân thiện với môi trường.

TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã xác định loài nấm Fusarium oxysporum gây hại cho khoai lang tại huyện Bình Tân Đồng thời, ba chủng xạ khuẩn TTr4, TL8 và TTh15 đã được phát hiện có khả năng phòng trị bệnh héo rũ do nấm Fusarium oxysporum gây ra trong điều kiện nhà lưới Ba chủng xạ khuẩn này cho thấy khả năng đối kháng hiệu quả đối với nấm gây hại.

Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên khoai lang có liên quan đến khả năng tiết enzyme chitinase và enzyme glucanase.

- Xác định được loài của 3 chủng xạ khuẩn triển vọng là: TTr4 là loài

Streptomyces bacillaris TL8 và Streptomyces violaceoruber TTh15 là hai loài vi khuẩn có khả năng phòng trừ bệnh héo rũ hại khoai lang Trong nghiên cứu, hai chủng Streptomyces bacillaris (TTr4) và Streptomyces violaceoruber (TTh15) đã được tuyển chọn nhờ khả năng phòng trừ hiệu quả bệnh này trong điều kiện ngoài đồng.

SƠ LƯỢC VỀ CÂY KHOAI LANG

Khoai lang (Ipomea Batatas) thuộc chi Ipomoea, họ Convolvulaceae, có nguồn gốc từ Trung Mỹ vào khoảng 2600 đến 1000 trước Công Nguyên Qua thời gian, khoai lang đã trở nên phổ biến toàn cầu và trở thành một trong những loại cây lương thực chính ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Tại Việt Nam, khoai lang được trồng rộng rãi không chỉ ở các vùng đồng bằng và đất bãi ven sông mà còn ở các khu vực trung du và miền núi.

Khoai lang là loại cây thân thảo, có thể bò hoặc leo, thuộc nhóm cây đa niên Hoa của khoai lang có dạng phễu và cuống dài Rễ củ của cây phình to, đóng vai trò quan trọng trong việc dự trữ chất dinh dưỡng.

Khoai lang có ba loại rễ chính: rễ con, rễ củ và rễ mọc từ thân cây Thân cây bao gồm thân chính phát triển từ ngọn dây khoai lang được trồng, cùng với thân phụ phát triển từ các nách lá.

2004) Cây khoai lang có khả năng sinh sản bằng hạt, đồng thời có thể nhân giống vô tính bằng thân, ngọn hoặc củ (Vũ Đình Hòa, 1996).

Khoai lang, với khả năng thích nghi tốt và dễ trồng, đã trở thành một trong những cây trồng phổ biến trên toàn cầu, từ vĩ độ 0 đến 45 độ Bắc (Dương Minh, 1999) Đây là một trong năm loại cây có củ quan trọng nhất thế giới, bên cạnh sắn, khoai mỡ, khoai sọ và khoai tây Theo thống kê của FAO năm 2001, diện tích trồng khoai lang toàn cầu đạt 9.076 triệu ha, với năng suất trung bình 14,92 tấn/ha, tổng sản lượng lên tới 135,448 triệu tấn (Thái Hà và ctv., 2011) Tuy nhiên, trong những năm gần đây, diện tích trồng khoai lang có xu hướng giảm, mặc dù năng suất có tăng nhưng chưa ổn định, dẫn đến sản lượng cũng giảm nhẹ (Trịnh Xuân Ngọ và Đinh Thế Lộc, 2004).

Khoai lang là cây lương thực quan trọng thứ ba sau lúa và bắp, được trồng rộng rãi trên toàn quốc Theo FAO năm 2001, diện tích trồng khoai lang đạt 269.000 ha với sản lượng 1.745.300 tấn, trong đó Đồng bằng sông Cửu Long (Đ SCL) dẫn đầu về năng suất Năm 2001, diện tích trồng khoai lang ở Đ SCL tăng thêm 21.500 ha, với các tỉnh Vĩnh Long, Đồng Tháp và Kiên Giang là những địa phương có diện tích trồng lớn nhất.

Diện tích canh tác khoai lang tại tỉnh Vĩnh Long đạt 11.765 ha, với huyện Bình Tân là khu vực trồng chủ yếu, chiếm 90% tổng diện tích trồng khoai lang của tỉnh, tương đương 10.563 ha (Niên giám Thống kê tỉnh Vĩnh Long, 2014).

Cây khoai lang có tiềm năng phát triển mạnh mẽ, đóng góp đáng kể vào việc tạo công ăn việc làm cho người dân vùng huyện ình Tân, tỉnh Vĩnh Long Loài cây này không chỉ phục vụ nhu cầu nội địa mà còn được xuất khẩu sang nhiều quốc gia như Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản, giúp gia tăng 46% sản lượng khoai lang toàn khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (Niên giám Thống kê tỉnh Vĩnh Long, 2014).

2.1.4 Giá trị cây kinh tế

Khoai lang được trồng chủ yếu trên toàn thế giới với mục đích làm lương thực cho con người chiếm 77%, trong khi 13% được dùng làm thức ăn cho gia súc và 3% được chế biến thành các sản phẩm khác Tuy nhiên, có tới 6% sản lượng khoai lang bị thất thoát hoặc loại bỏ (Dương Minh, 1999 và FAO, 2001).

Vùng nguyên liệu khoai lang ình Tân đã được chứng nhận 17 ha sản xuất theo tiêu chuẩn GlobalGAP, cùng với 32 ha cánh đồng mẫu lớn áp dụng kỹ thuật canh tác an toàn Các giống khoai phổ biến bao gồm khoai tím Nhật, trắng sữa, trắng giấy, bí đường, khoai bí nghệ và dương ngọc, trong đó khoai tím Nhật chiếm 70% diện tích với chất lượng và năng suất cao Nhãn hiệu tập thể “Khoai lang ình Tân BÌNH TÂN SWEET POTATOES” được Cục sở hữu trí tuệ cấp chứng nhận, góp phần xây dựng thương hiệu khoai lang Vĩnh Long trên thị trường quốc tế Sản phẩm khoai lang ình Tân đã xuất khẩu sang các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Úc.

Khoai lang tím Nhật có thân to, mập và ít phân cành, màu tím, với củ thuôn dài, vỏ nhẵn màu tím và ruột vàng đậm Giống khoai này thích nghi tốt với thổ nhưỡng tại huyện ình Tân, Vĩnh Long, cho năng suất cao và chất lượng tốt, được thị trường trong và ngoài nước ưa chuộng Trong những năm qua, huyện ình Tân đã phát triển mô hình trồng khoai lang "hai vụ màu, một vụ lúa", giúp tăng lợi nhuận gấp 3-5 lần so với trồng lúa, từ đó khoai lang tím đã trở thành cây chủ lực, góp phần xóa đói giảm nghèo cho người dân địa phương.

Cây khoai lang được sử dụng để chế biến nhiều sản phẩm có giá trị kinh tế cao Tại Ấn Độ, bột khoai lang khô được trộn với bột mì để làm bánh mì khoai lang (chapattis) Ở Nhật Bản, bột khoai lang được lên men với bột gạo để sản xuất rượu Shōchū, trong khi đó, tại Quảng Đông và Đài Loan có loại rượu từ khoai lang gọi là Imo-gohan Tại Nam Mỹ, nước ép khoai lang đỏ được dùng kết hợp với nước trái cây để tạo ra thuốc nhuộm vải, cho phép thu được nhiều màu sắc khác nhau Trong ngành công nghiệp, khoai lang là nguyên liệu cho sản xuất tinh bột và cồn công nghiệp Ngoài ra, các nhà nghiên cứu tại Đại học North Carolina State đang phát triển các giống khoai lang phục vụ sản xuất nhiên liệu sinh học.

Khoai lang là một loại cây trồng lấy củ với giá trị dinh dưỡng cao, giàu tinh bột, chất xơ và đường, cung cấp năng lượng dồi dào cho cơ thể.

Chất xơ thô đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng, bao gồm các hợp chất như lignin, cellulose, hemicellulose và pectin Những thành phần này không chỉ hỗ trợ tiêu hóa mà còn giúp duy trì sức khỏe tổng thể của cơ thể.

Nghiên cứu của Senanayake và cộng sự (2013) chỉ ra rằng chất xơ thô trong 5 giống khoai lang có tỷ lệ từ 2,1% đến 13,6% khối lượng chất khô Chất xơ này có tác dụng tích cực trong việc cải thiện tiêu hóa, tăng cường thải cholesterol và ngăn ngừa táo bón.

Tinh bột: là thành phần quan trọng của glucid chiếm 60 t 70% chất khô (Palmer,

Khoai tây chứa một lượng lớn tinh bột dễ tiêu, cùng với một phần lớn ở dạng đường, khiến khoai có vị ngọt Hàm lượng tinh bột trong khoai tây thay đổi đáng kể, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó giống khoai là yếu tố quan trọng nhất.

ỆNH HÉO RŨ TRÊN KHOAI LANG

2.2.1 Triệu chứng bệnh ệnh héo rũ khoai lang do nấm Fusarium sp gây ra là một trong các bệnh quan trọng ở Mỹ và các nước canh tác khoai lang Triệu chứng ban đầu là các lá già có màu vàng, sau đó lan dần lên các lá non phía trên dẫn đến héo toàn dây, cuối cùng dây khoai sẽ khô và chết Các mạch dẫn bên trong dây khoai sẽ có màu nâu, sau đó rễ khoai sẽ bị mục, lớp vỏ bên ngoài của rễ, thân dây khoai sẽ xuất hiện các sợi nấm nhỏ li ti màu trắng Trong một số trường hợp, có sự chuyển màu của mạch dẫn khi gần vết bệnh nếu các dây này được lưu tồn và làm giống cho vụ sau dây khoai sẽ truyền bệnh hay dễ bị nhiễm bệnh hơn so với các dây khác (Clark, 2009).

Do nấm Fusarium oxysporum f sp batatas

Tuy nhiên, có một vài nòi nấm trên cây thuốc lá như F oxysporum f sp. nicotianae cũng mẫn cảm và gây bệnh héo dây khoai lang (Clark, 2009).

2.2.3 Đặc tính của nấm bệnh

Phân loại t Lớp nấm ất toàn (Deuteromycetes) t Họ Tuberculariaceae t ộ nấm bông (Hyphomycetales)

Fusarium là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, thường gây hại cho nhiều loại cây trồng, cây ăn trái và rau, dẫn đến hiện tượng héo rũ ở cây ký chủ Việc phân loại và giám định các loài nấm Fusarium spp có thể dựa vào các yếu tố như màu sắc tản nấm, sự thay đổi môi trường, hình thái sợi nấm, thể bình, hình dạng đại bào tử, tiểu bào tử và bào tử áo vách dày Đồng thời, việc lây nhiễm bệnh nhân tạo trên cây ký chủ cũng được thực hiện để xác định tính gây bệnh và nguyên nhân gây bệnh.

Theo nghiên cứu của Theo Burgess và cộng sự (1994), có gần 1.000 loài Fusarium đã được mô tả và nghiên cứu về khả năng sinh bào tử trên cây trồng Nhiều loài Fusarium biến dị đã được phát hiện, cho thấy sự thay đổi trong các đặc tính vốn có của chúng, đặc biệt khi phát triển trên các chất nền và trong điều kiện môi trường khác nhau Những loài này còn được nhận diện nhờ khả năng tiết ra chất nhầy trong suốt, tạo nên tính đặc trưng riêng.

Việc phân loại nấm Fusarium gặp khó khăn do sự tương đồng về hình thái giữa các loài, như kích thước và hình dạng bào tử, cũng như hình thái cuống bào tử và sắc tố sợi nấm Những đặc điểm này có thể thay đổi theo điều kiện môi trường và thành phần dinh dưỡng, dẫn đến nhầm lẫn trong việc phân biệt giữa các loài như F proliferatum, F oxysporum và F solani Nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng nấm Fusarium rất đa dạng về di truyền, và kỹ thuật này giúp nâng cao độ chính xác trong việc định danh các loài thuộc chi Fusarium.

Theo Vũ Triệu Mân (2007), trong môi trường PDA, tản nấm xốp màu hồng nhạt sẽ hình thành sắc tố màu đỏ tím sau 4 đến 5 ngày Trên môi trường CLA (carnation leaf agar), bào tử được hình thành với số lượng lớn, trong đó đại bào tử có hình dạng hơi cong giống như lưỡi liềm và có 3 t.

Nấm có cấu trúc với 5 vách ngăn, kích thước từ 27 đến 46 x 3 đến 5 µm, có thể không màu hoặc màu vàng nhạt Tiểu bào tử có hình dạng ụ van hoặc elip, kích thước từ 5 đến 12 x 2,2 đến 3,5 µm, không có vách ngăn và được hình thành trong bọc giả Trên môi trường PDA, sau 3 đến 5 tuần cấy, nấm sẽ hình thành hậu bào tử Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, thường không màu nhưng chuyển sang màu nâu khi già.

Trong môi trường CLA, đại bào tử có hình dạng thon dài hơn với chiều dài trung bình, trong khi tiểu bào tử lại có kích thước nhỏ, thường không có vách ngăn Tiểu bào tử thường hình thành trong bọc giả gắn trên các tế bào sinh bào tử rất ngắn (Urgess et al., 1994).

Nấm Fusarium sinh sản vô tính thông qua ba kiểu bào tử: đại bào tử (macroconidia), tiểu bào tử (microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào tử chlamydospores) Đại bào tử có vỏ ngăn, chiều dài trung bình từ 41 đến 46,8 µm và chiều rộng từ 4,5 đến 4,7 µm (CABI, 2007) Điều kiện phát sinh và phát triển của bệnh liên quan chặt chẽ đến các yếu tố môi trường.

Nhiệt độ và độ ẩm đất đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh do nấm Fusarium oxysporum Theo nghiên cứu, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của bệnh là 28°C, trong khi điều kiện từ 23 đến 33°C cũng ảnh hưởng đến sự phát triển này (CABI, 2007) Beckman et al (1962) đã chỉ ra rằng nhiệt độ đất có tác động đến mức độ mẫn cảm và triệu chứng bệnh khi Fusarium oxysporum f sp cubense tấn công cây chuối (được trích dẫn bởi Nelson, 1981).

Theo nghiên cứu của Nelson (1981), nhiệt độ của đất và không khí có tác động đáng kể đến sự phát triển triệu chứng và tiến triển bệnh trên cây cẩm chướng do nấm Fusarium oxysporum f sp dianthi gây ra.

Theo nghiên cứu của Theo Burgess et al (1994), mầm bệnh có nguồn gốc từ đất thường bị hạn chế khả năng hoạt động do sự cạnh tranh và đối kháng với các vi sinh vật khác, điều này giúp ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh trừ khi có điều kiện thuận lợi Ngoài ra, loại phân bón sử dụng cũng ảnh hưởng đến độc tính của nấm; cụ thể, độc tính này tăng lên khi sử dụng phân vi lượng, phân lân và đạm amôn, trong khi đó, độc tính giảm khi bón đạm nitrat (Vũ Triệu Mân, 2007).

Sự lan truyền và lưu tồn của mầm bệnh

Nấm Fusarium, đặc biệt là Fusarium oxysporum, có khả năng tồn tại lâu dài trong đất và xác bã thực vật nhờ vào cấu trúc vách tế bào dày của hậu bào tử (chlamydospores) Theo nghiên cứu của Theo Shlevin et al (2003) và SutytHeinze cùng Dutzmann (2004), nấm này có thể sống hơn 13 tháng trong môi trường đất và xác bã thực vật, với khả năng lưu tồn tốt nhất trên xác bã thực vật, từ đó dễ dàng phát tán sang các khu vực lân cận.

Sử dụng giống kháng bệnh héo dây khoai lang là phương pháp quan trọng để phòng ngừa thiệt hại có thể lên tới 50% năng suất Các giống kháng hiệu quả bao gồm Xushu 18, Jishu 15, Jishu 98 và Jinshan, kết hợp với biện pháp hóa học, giúp kiểm soát sự lây lan của bệnh.

Hom bánh tẻ có chiều dài từ 20 đến 30 cm và có từ 5 đến 6 mắt, thường được xử lý bằng nước ấm ở nhiệt độ 51-54°C trong 10 phút hoặc sử dụng thuốc trừ nấm như carbendazim (1:500) và thiophanatemethyl (1:400) trong cùng thời gian Phương pháp xử lý bằng nước nóng là phổ biến nhất (Zhang et al., 2009) Việc chọn phương pháp xử lý phù hợp cần dựa vào khí hậu và lịch thời vụ.

Khoai lang có thể trồng quanh năm, nhưng thời vụ trồng rất quan trọng vì ảnh hưởng đến chất lượng và năng suất Điều kiện khí hậu lý tưởng là ngày nắng ấm, đêm mát mẻ, với biên độ nhiệt trung bình và lượng nước tưới hoặc mưa vừa đủ, giúp củ khoai phát triển lớn và đạt năng suất cao Ở Ấn Độ, thời vụ trồng tốt nhất là vào tháng 9 và 10, khi tất cả các yếu tố thuận lợi hội tụ Trong khi đó, ở Trung Quốc, khoai lang được trồng vào mùa xuân khi nhiệt độ đạt trên 15 độ C.

XẠ KHUẨN

Xạ khuẩn, một loại vi sinh vật nhân nguyên, đã được biết đến từ hàng trăm năm và có nhiều đặc điểm tương đồng với vi khuẩn và nấm mốc.

Vi sinh vật nhân nguyên được chia thành 7 nhóm chính, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, Rickettsi, dạng L của vi khuẩn, và vi khuẩn lam Trong số đó, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật ít gây hại cho cây trồng, theo nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng (2012) Hiện nay, xạ khuẩn đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt trong phòng trừ sinh học, cũng như trong nhiều lĩnh vực khác.

Vào năm 1950, xạ khuẩn đã được xác định về thành phần và cấu trúc, hiện nay được phân loại vào bộ Actinomycetales theo hệ thống phân loại của Ergey hoặc Actinomycetes theo hệ thống của Kracinhicop Đây là loại vi sinh vật Gram dương, có khả năng hình thành hệ sợi phân nhánh và có thành phần G+C trong DNA trên 55% (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2009).

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ,

35 họ, 110 chi và 1.000 loài Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi xạ khuẩn hiếm khác đã được xác định Tại Việt Nam, các chi xạ khuẩn đã được phân lập bao gồm Streptomyces.

Actinoplanes, Micromonospora, Catenoloplanes, Kineosporia, Pseudonocardia, Actinosynnemia, Amycolatopsis, Catellatospora, Couchioplanes, Nocardiopsis, Streptosporangium và Nocardia (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2009).

2.3.1 Sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm đất, nước ngọt, nước biển và trầm tích biển Chúng cũng xuất hiện dưới dạng cộng sinh trong hệ đường ruột của các động vật đất, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, đặc biệt là ở mối (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2009).

Sự phát triển của xạ khuẩn trong đất chịu ảnh hưởng lớn từ pH, với nghiên cứu của Hsu và Lockwood (1975) chỉ ra rằng khuẩn lạc xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong khoảng pH từ 6,5 đến 8,5 Khi pH dưới 6,5 hoặc trên 8,5, sự phát triển của khuẩn lạc sẽ giảm Ngoài ra, nhiệt độ ôn hòa từ 25 đến 30 độ C kết hợp với pH trung tính được xem là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của xạ khuẩn (Đỗ Thị Tuyến, 2011).

Theo Valois và các cộng sự (1996) cho biết, trong sinh khối vi sinh vật đất, xạ khuẩn chiếm tỷ lệ đáng kể, với khoảng 29.000 đến 24.000 mầm xạ khuẩn trong mỗi gam đất, tương đương với 9 đến 45% tổng số vi sinh vật.

2.3.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có kích thước lớn hơn vi khuẩn nhưng nhỏ hơn nấm, với sợi xạ khuẩn phân bố phức tạp Khuẩn lạc xạ khuẩn phát triển trên môi trường đặc, tạo ra các vân xậm và vân nhạt xen kẽ, hình thành dạng hình tia đặc sắc.

Hiện tượng khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ được giải thích bởi Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2004) là do sợi khuẩn ty thấm vào môi trường xung quanh, dẫn đến sự phát triển yếu đi của chúng Ban đầu, sợi khuẩn ty lan ra môi trường bên ngoài, sau đó phát triển mạnh và sinh ra chất ức chế, ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi khuẩn ty Quá trình này lặp đi lặp lại, tạo ra hình phóng xạ đặc trưng.

Xạ khuẩn không chỉ tạo ra lớp sợi nấm mỏng phân nhánh mà còn sản xuất các bào tử ở đầu sợi nấm, có thể xuất hiện riêng biệt hoặc trong các túi bào tử (Dyakov, 2007).

Theo nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2009), xạ khuẩn có nhiều đặc điểm khác biệt so với nấm nhưng lại tương đồng với vi khuẩn Chúng có giai đoạn đơn bào và đa bào, với khuẩn lạc có dạng sợi phân nhánh phức tạp nhưng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào đa nhân, không có vách ngăn ngang Kích thước của xạ khuẩn rất nhỏ, tương tự như vi khuẩn, và nhân của chúng không có màng nhân và tiểu hạch Vách tế bào của xạ khuẩn không chứa cellulose hoặc chitin, và quá trình phân chia tế bào cũng giống như vi khuẩn Đặc biệt, xạ khuẩn không có giới tính, không có tế bào đực hay cái, và chúng có thể sống hoại sinh hoặc ký sinh.

2.3.2.2 Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn a Khuẩn ty

Xạ khuẩn có cấu tạo đơn bào, dạng sợi phân nhánh, đường kính mỗi sợi từ 0,8 t

Phần sợi cắm vào môi trường gọi là khuẩn ty cơ chất, trong khi phần sợi mọc trên môi trường được gọi là khuẩn ty khí sinh Sau một thời gian phát triển, khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện những nhánh nhỏ gọi là cuống bào tử, với hình dạng khác nhau tùy thuộc vào loại xạ khuẩn, bao gồm dạng thẳng, xoắn, tua cuốn hoặc vòng Bào tử có thể có hình cầu, bầu dục hoặc hình que (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2009).

Trên bề mặt sợi xạ khuẩn, những mấu lồi xuất hiện và lớn lên thành chồi, sau đó kéo dài thành sợi Những nhánh mới này tiếp tục phát triển bằng cách mọc chồi mới, tạo thành các nhánh mới.

Màng của khuẩn ty khí sinh có chứa nhiều lipid, acid nucleic và men, với hoạt tính men mạnh hơn so với khuẩn ty cơ chất, trong khi khuẩn ty cơ chất lại chứa ít hoặc không có lipid (Nguyễn Như Thanh và ctv., 2004).

Xạ khuẩn có hình dạng khuẩn lạc đa dạng, bao gồm dạng nhung tơ, màng dẻo và xù xì, khác biệt so với các vi sinh vật khác Kích thước khuẩn lạc của xạ khuẩn thay đổi tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh, với đường kính thường từ 0,5 đến 2 mm, nhưng cũng có thể đạt đến 1 cm hoặc lớn hơn.

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được thực hiện từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 10 năm 2018 tại Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, cùng với các hoạt động ngoài đồng tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.

PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.2.1 Dụng cụ thiết bị t Đĩa Petri nuôi cấy nấm, xạ khuẩn, giấy lót, beaker t Chai nắp thủy tinh chịu nhiệt, bình tam giác, nước cất, giấy thấm, kẹp inox t Cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, lame, pipette, cồn 70 0 t 90 0 , khử trùng dụng cụ, bọc giấy, dụng cụ đo nhiệt độ, ẩm độ… t Kính hiển vi, máy vi ly tâm, cân điện tử, máy đo pH, máy khuếch đại PCR (TAKARA, Japan), máy điện di, lò vi sóng, thiết bị thanh trùng, tủ sấy, tủ cấy

3.2.2 Nguồn vật liệu nghiên cứu (nấm, nguồn xạ khuẩn, thuốc hóa học, giống khoai):

Nguồn nấm: Thu thập mẫu bệnh trên các ruộng khoai lang canh tác tại các xã thuộc huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.

Nguồn xạ khuẩn: Thu thập, phân lập từ những mẫu đất ở những ruộng trồng khoai lang trên địa bàn huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.

Thuốc hóa học dùng làm đối chứng dương cho thí nghiệm ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng:

Thuốc Carbenzim 500FL, sản xuất bởi công ty cổ phần BVTV Sài Gòn, thuộc nhóm hóa học Carbamate Đây là loại thuốc trừ bệnh nội hấp, có dạng bột rắn không màu, không tan trong nước và tan ít trong dung môi hữu cơ Với hoạt chất Carbendazim 500g/L, thuốc có tác dụng phòng và trị nấm bệnh trên cây trồng, hiệu quả kéo dài và diệt nấm nhanh chóng Carbenzim 500FL được sử dụng để phòng trị bệnh đốm lá trên cây lạc, bệnh thán thư trên cây điều, bệnh thối quả trên cà phê, và bệnh phấn trắng, đốm đen trên hoa hồng Tuy nhiên, theo Quyết định số 03/QĐtBNNt VTV ngày 03 tháng 01 năm 2017 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, thuốc này đã bị cấm sử dụng tại Việt Nam kể từ ngày 03 tháng 01 năm 2019.

Tinomyl 50WP là thuốc trừ nấm được sản xuất bởi công ty TNHH Thái Phong, thuộc nhóm hóa học Carbamate Thuốc ở dạng tinh thể không màu, gần như không tan trong nước và có khả năng phân hủy trong môi trường axit, kiềm mạnh Tinomyl 50WP có tác dụng rộng rãi trong việc phòng trừ các bệnh đạo ôn, khô vằn, vàng lá, lem lép hạt trên lúa; bệnh đốm lá trên đậu tương; sương mai trên khoai tây; bệnh sẹo trên cây có múi; thán thư trên xoài, điều; phấn trắng trên chôm chôm và rỉ sắt trên cà phê Thuốc có thể pha trộn với nhiều loại thuốc trừ sâu khác Tuy nhiên, theo Quyết định số 03/QĐtBNNt VTV ngày 03 tháng 01 năm 2017 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tinomyl 50WP đã bị cấm sử dụng tại Việt Nam kể từ ngày 03 tháng 01 năm 2019.

Giống khoai lang tím Nhật (Ipomoea batatas (L.) Lam) có nguồn gốc từ Nhật Bản, được nhập nội bởi Trung tâm Nghiên cứu và Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc vào năm 1997 và đã được trồng phổ biến tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2002 Đặc điểm nổi bật của giống này bao gồm lá xẻ thùy, gân lá màu xanh nhạt ở mặt dưới, thân tròn nhỏ màu xanh tím, củ màu tía và thịt củ màu tím đậm Thời gian sinh trưởng của giống khoảng 95-110 ngày, năng suất đạt từ 15-27 tấn/ha và tỷ lệ chất khô dao động từ 27-31%.

3.2.3 Các loại môi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: t Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu sinh học:

Môi trường PDA (Potato dextrose agar) (Shurtleff and Averre, 1997)

Môi trường WA ( Water Agar )

Môi trường Manitol Soya Flour medium (MS) (Hobbs et al., 1989)

Nguyên liệu Định lượng ột đậu nành 20g

Môi trường PDA kháng sinh (Shurfleff and Averre, 1997)

Môi trường Chitin agar có điều chỉnh (Hsu and Lockwook, 1975)

Môi trường β-glucan (Renwick glucan (Renwick et al., 1991)

FeSO4.7H2O 0,01 g β 1,3tglucan –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí Merck 5 g

Nước cất 1.000 ml pH 7 t Thuốc thử Lugol: 2 g KI + 1 g I2 + 100 ml nước cất. t Thuốc thử Congo red: 0,6g Congo red + 100 ml nước cất.

Môi trường ISP1 (Shirling and Gottlieb, 1966)

Nước cất 1.000 ml pH 7,0 –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí 7,2

Môi trường ISP2 (Shurtleff and Averre, 1997)

Nước cất 1.000 ml pH 7,0 –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí 7,2

Môi trường ISP5 (Pridham and Lyons, 1961)

Nước cất 1.000 ml pH 7,0 –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí 7,4

Môi trường ISP6 (Tresner and Danga, 1958)

Nước cất 1.000 ml pH 7,0 –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí 7,2

Môi trường ISP7 (Shirling and Gottlieb, 1966)

L –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí Tyrosine 0,5 g

L –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí Asparagine 1 g

Nước cất 1.000 ml pH 7,2 –glucan của 5 chủng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí 7,4

Môi trường ISP9 (Shirling and Gottlieb, 1966)

Dung dịch muối A: FeSO4.7H2O t 0,1 gam; ZnSO4.7H2O t 0,15 gam;

MnCl2.4H2Ot0,1 gam; Nước cấtt100 ml.

Dung dịch muối B: CuSO4.5H2O t 0,64 gam; FeSO4.7H2O t 0,11 gam; ZnSO4.7

H2O t 0,15 gam; MnCl2.4H2O t 0,79 gam; Nước cất t 100 ml

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nội dung 1: Thu thập, phân lập, khảo sát đặc điểm hình thái và đánh giá khả năng gây hại của các dòng nấm Fusarium spp gây bệnh héo rũ hại khoai lang.

* Thu mẫu và phâp lập nấm Fusarium spp gây hại trên khoai lang

Vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát, thu thập dây khoai lang nhiễm bệnh từ các ruộng có diện tích ≥ 1000 m² tại 5 xã trồng khoai chủ lực ở huyện Bình Tân, mỗi xã lấy 1 mẫu bệnh Mẫu bệnh được đặt trong túi nylon riêng biệt cho từng ruộng và tiến hành phân lập, nuôi cấy ngay trong ngày hoặc chậm nhất là ngày hôm sau tại phòng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ.

Phương pháp phân lập mẫu bệnh: theo phương pháp của Burgess (2009)

1 Chọn vị trí mô (gốc, rễ) có triệu chứng bệnh héo rũ, cắt một đoạn và khử trùng bề mặt bằng cồn 70 0

2 Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt mô bệnh thành những miếng cấy nhỏ (dài khoảng 5 mm).

3 Khử trùng những mẫu cấy nhỏ này bằng cồn 70 0 trong 30 giây, rửa lại với nước cất thanh trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng.

4 Tiếp tục, chuyển những mẫu này vào môi trường nghèo dinh dưỡng Water agar Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng.

5 Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những mẫu cấy, tách ròng chúng sang môi trường PDA Cuối cùng, cấy truyền từ đỉnh sợi nấm vào ống nghiệm chứa môi trường PDA để mặt nghiêng và trữ nguồn ở nhiệt độ từ 4t8 0 C.

Thí nghiệm 1 được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2016 tại phòng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ thực vật, trường Đại học Cần Thơ, nhằm khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm Fusarium spp gây hại trên khoai lang.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố

(dòng nấm), với 4 lặp lại, mỗi lặp lại là một đĩa petri.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cấy nấm vào giữa đĩa Petri, với mỗi dòng nấm được nuôi trong 10 ml môi trường PDA Điều kiện thí nghiệm được duy trì ở nhiệt độ phòng khoảng 28 độ C, với chế độ chiếu sáng cho 5 chủng xạ khuẩn là 12 giờ sáng và 12 giờ tối trong môi trường tối.

+ Quan sát bằng mắt thường: Ghi nhận thời gian nấm mọc đầy đĩa, màu sắc tản nấm, cách mọc của tản nấm trên môi trường nuôi cấy

+ Quan sát trên kính hiển vi: quan sát đặc điểm hình thái của bào tử nấm (hình dạng và kích thước của bào tử).

Thí nghiệm 2 nhằm đánh giá khả năng gây hại của các dòng nấm Fusarium spp được thực hiện trong điều kiện nhà lưới tại Bộ môn Bảo vệ thực vật, trường Đại học Cần Thơ Thời gian thực hiện thí nghiệm kéo dài từ tháng 5 đến tháng 7 năm 2016.

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố duy nhất và bao gồm 5 lần lặp lại, trong đó có 11 nghiệm thức, bao gồm 10 dòng nấm phân lập và 1 nghiệm thức đối chứng không bị lây bệnh.

-glucan (Renwick Chuẩn bị chậu và đất: Chậu nhựa dùng trong thí nghiệm có đường kính 25 cm

Diện tích bề mặt chậu trồng là 0,049 m², đất được trộn với xơ dừa oai mục theo tỷ lệ 2:1 (v:v) và thanh trùng ướt ở nhiệt độ 121°C trong 30 phút trước khi cho vào chậu nhựa thí nghiệm với 5 kg mỗi chậu Giống khoai lang tím Nhật sạch bệnh được cắt thành hom có từ 6-7 mắt lá, trồng vào chậu với 3 mắt lá vùi sâu (5-6 cm), mỗi chậu trồng 5 hom Cây khoai lang được tưới nước 2 lần/ngày để đảm bảo độ ẩm cần thiết cho sự phát triển Tất cả các chậu đều được chăm sóc và bón phân đồng đều, phân được hòa vào nước tưới cho các chậu Nguồn nấm được nuôi trong đĩa petri chứa 10 ml môi trường.

Trong quy trình PDA trong 6 ngày, đầu tiên, thu nấm bằng cách thêm nước cất thanh trùng vào đĩa petri và sử dụng lame để cạo nhẹ bề mặt Sau khi lọc qua vải lọc, ta thu được huyền phù bào tử nấm Tiếp theo, rút huyền phù bào tử nấm vào lame đếm và quan sát dưới kính hiển vi để xác định mật số bào tử Cuối cùng, điều chỉnh mật số về mức 5x10^6 bào tử/ml theo yêu cầu.

Để tiến hành lây bệnh nhân tạo cho khoai lang, cần thực hiện vào ngày thứ 15 sau khi trồng Trước khi lây bệnh, di chuyển các chậu khoai vào phòng ủ bệnh với nhiệt độ 25°C và độ ẩm ≥ 96%, sử dụng máy điều hòa và máy tạo ẩm để điều chỉnh Lây bệnh bằng cách tưới huyền phù nấm Fusarium spp với mật số 5x10^6 bào tử/ml, mỗi chậu 15 ml, và che chắn bằng màng nilo để ngăn ngừa lây lan từ các dòng nấm khác Đối với nghiệm thức đối chứng, tưới 15 ml nước cất thanh trùng vào gốc khoai lang Sau khi lây bệnh, các chậu khoai lang được đặt trong phòng ủ bệnh và che tối trong 24 giờ, sau đó chuyển ra điều kiện ánh sáng bình thường và phun sương để duy trì độ ẩm cho nấm phát triển.

Chỉ tiêu ghi nhận: t Tỷ lệ bệnh (TLB) (%)

TLB = (Số cây bị bệnh/tổng số cây quan sát)*100. t Chỉ số bệnh (Y%) được tính theo công thức

Bảng phân cấp bệnh được cải tiến dựa bào bảng phân cấp bệnh cho cây dưa hấu của Tziros et al., (2007) và được phân 4 cấp như sau:

+ Cấp 2: Xuất hiện mất màu diệp lục tố ở những lá bên dưới hoặc cây héo

+ Cấp 3: Xuất hiện hoại tử ở những lá bên dưới, lá ở bên trên bị vàng và héo+ Cấp 4: Cây chết

* Định danh đến loài các chủng nấm gây bệnh héo rũ hại khoai lang dựa vào trình tự vùng ITS-glucan (Renwick rDNA

Sau khi hoàn thành thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2, chúng tôi sẽ lựa chọn dòng nấm đại diện cho các dòng nấm phân lập dựa trên đặc điểm hình thái, đặc tính sinh học và triệu chứng đặc trưng của bệnh héo rũ hại khoai lang Mẫu nấm sẽ được ly trích DNA tại phòng thí nghiệm bệnh cây thuộc bộ môn Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Cần Thơ, và mẫu DNA này sẽ được gửi đi giải trình tự gen tại Công ty Trách nhiệm Hữu hạn MTV Sinh hóa Phù Sa.

* Ly trích DNA của nấm (thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây, thuộc bộ môn

Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Cần Thơ)

Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 6 ngày ở nhiệt độ phòng Sau đó, DNA của sợi nấm và bào tử nấm được chiết xuất theo phương pháp của Saitoh et al (2006).

* Phản ứng PCR và giải trình tự vùng gene ITS (thực hiện tại Công ty Trách nhiệm Hữu hạn MTV Sinh hóa Phù Sa)

Các mẫu nấm được khuyếch đại với cặp mồi ITS1 và ITS4.

Trình tự của ITS1 5’tTCCGTAGGTGAACCTGCGGt3’;

Hỗn hợp phản ứng PCR được chuẩn bị với tổng thể tích 25 µl, bao gồm 13,35 µl nước, 2,5 µl buffer, 2 µl MgCl2, 4 µl dNTPs, 0,25 µl Taq polymerase, 0,25 µl mồi ITS1, 0,25 µl mồi ITS4 và 2 µl DNA của nấm.

Phản ứng PCR bắt đầu bằng việc chuẩn bị hỗn hợp PCR cho từng chủng nấm, sau đó đưa vào máy PCR với chu kỳ nhiệt gồm giai đoạn biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ lặp lại với giai đoạn biến tính ở 95°C trong 1 phút, giai đoạn bắt cặp ở 53°C trong 30 giây và giai đoạn kéo dài ở 72°C trong 90 giây Cuối cùng, có một giai đoạn kéo dài thêm 5 phút ở 72°C để đảm bảo các sợi DNA được bổ sung hoàn toàn Sản phẩm PCR được bảo quản ở 4°C Để phân tích sản phẩm PCR, gel agarose 2% được điện di trong môi trường TBE 1X ở 100V trong 30 phút, sau đó nhuộm với ethidium bromide trong 30 phút và chụp hình dưới ánh sáng UV.

Sử dụng bộ QIA quickPCR Purification Kit của QIAGEN để tinh sạch sản phẩm PCR Sau đó, sản phẩm đã được tinh sạch sẽ được giải trình tự trên máy ABI 3130XL Trình tự mẫu nấm thu được sẽ được so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gene NCBI (National Center for Biotechnology Information) nhằm xác định loài của mẫu nấm khảo sát.

XỬ LÝ SỐ LIỆU

Dữ liệu được xử lý bằng Microsoft Excel, nơi các chỉ tiêu theo dõi được nhập và xử lý để tạo ra các biểu đồ và mối tương quan Phần mềm MSTATC được sử dụng để tính toán thống kê, áp dụng phép thử Duncan nhằm so sánh sự khác biệt với mức ý nghĩa 5%.