Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ đảo Trường Sa Lớn

Bài viết Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ đảo Trường Sa Lớn trình bày các kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn có khả năng sinh tổng hợp PHA từ đảo Trường Sa Lớn. Hai mươi chủng đã được phân lập, trong đó, có 2 chủng vi khuẩn ưa mặn có khả năng sinh tổng hợp PHA nhiều hơn được lựa chọn để định danh bằng giải trình tự đoạn gen 16S rRNA.

Hóa học & Mơi trường Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoate (PHA) phân lập từ đảo Trường Sa Lớn Nguyễn Thị Tâm Thư*, Lê Huy Hoàng, Bùi Thị Thu Hà, Nguyễn Lâm Anh, Phạm Kiên Cường Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học Công nghệ quân * Email: thu.n3t.cnm@gmail.com Nhận bài: 16/8/2021; Hoàn thiện: 06/11/2021; Chấp nhận đăng: 10/12/2021; Xuất bản: 28/6/2022 DOI: https://doi.org/10.54939/1859-1043.j.mst.80.2022.126-131 TĨM TẮT Polyhydroxyalkanoate (PHA) loại nhựa sinh học có khả phân hủy sinh học vi sinh vật sinh PHA dạng dự trữ lượng C tế bào vi sinh vật điều kiện môi trường dư thừa nguồn C thiếu số hợp chất N, S, P, Có nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp PHA vi khuẩn ưa mặn có ưu vượt trội tiết kiệm chi phí lượng q trình ni cấy thu hồi PHA[3, 7] Nghiên cứu trình bày kết phân lập tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn có khả sinh tổng hợp PHA từ đảo Trường Sa Lớn Hai mươi chủng phân lập, đó, có chủng vi khuẩn ưa mặn có khả sinh tổng hợp PHA nhiều lựa chọn để định danh giải trình tự đoạn gen 16S rRNA Kết phân tích cho thấy chủng TSLT14 thuộc chi Klebsiella đặt tên Klebsiella sp TSLT14 với mã số GenBank MZ165335 Chủng TSLS23 thuộc chi Bacillus đặt tên Bacillus sp TSLS23 với mã số MZ165340 Từ khóa: Phân hủy sinh học; Bioplastic; Polyhydroxyankanoate; Ưa mặn; Trường Sa ĐẶT VẤN ĐỀ Polyhydroxyalkanoate (PHA) loại nhựa có nguồn gốc sinh học có khả phân hủy sinh học điều kiện hiếu khí, kị khí, đất, nước nước mặn [2, 6, 8, 10] PHA dạng dự trữ nguồn C lượng vi sinh vật điều kiện môi trường cân bằng, dư thừa nguồn C thiếu nguồn N, P, S, Khi môi trường thiếu hụt nguồn C, vi sinh vật lại sử dụng hạt PHA cho sinh trưởng Các vi sinh vật có khả sinh tổng hợp PHA thuộc nhiều nhóm khác nhau, bao gồm vi khuẩn Gram dương, Gram âm, vi khuẩn thông thường nhóm vi khuẩn cực trị có nhóm vi khuẩn ưa mặn [3] Các vi khuẩn ưa mặn sinh PHA công bố nhiều giới, chúng thuộc chi Halomonas, Halococcus, [3, 6, 8] Các PHA vi khuẩn ưa mặn sinh thường PHA mạch ngắn trung bình Các vi khuẩn ưa mặn có khả sinh PHA ứng dụng cơng nghiệp chúng sinh trưởng nồng độ muối cao (> 10%) mà hầu hết vi sinh vật sinh trưởng Do đó, lên men để thu PHA khơng cần khử trùng mơi trường thiết bị nuôi cấy nên tiết kiệm lượng Ngoài ra, vi sinh vật ưa mặn sinh PHA có khả sử dụng nhiều nguồn chất rẻ tiền phụ phế phẩm nông nghiệp nên tiết kiệm chi phí Một yếu tố làm giảm giá thành PHA tạo thành công nghiệp việc tách chiết thu hồi PHA từ vi sinh vật ưa mặn sinh trưởng với nồng độ muối 10% sử dụng nước cất hay nước máy để làm phá vỡ tế bào thay việc sử dụng dung môi [3, 8] Trên giới, nghiên cứu nhóm vi sinh vật ưa mặn sinh tổng hợp PHA nghiên cứu nhiều, Bacillus megaterium, (Gram dương), Halomonas TD01, Haloferax mediterannei, Halococcus morrhuae, Halomonas boliviensis, Pseudomonas sp CT13 (Gram âm) Đây chi có khả sinh PHA lên tới 50% chịu mặn tới 15% [4, 7, 8] Tuy nhiên, nghiên cứu Việt Nam nghiên cứu Nghiên cứu Trần Hữu Phong đánh giá khả sinh tổng hợp PHA chủng vi khuẩn Yangia sp ND199 phân lập từ đất rừng ngập mặn Nam Định (nơi có độ mặn thấp) [7] Nghiên cứu Hoàng Thị Lan 126 N T T Thư, …, P K Cường, “Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn … từ đảo Trường Sa Lớn.” Nghiên cứu khoa học công nghệ Anh phân lập vi khuẩn ưa mặn Halomonas maura rừng ngập mặn Giao Thủy Nam Định Đặc biệt, chưa có nghiên cứu chi tiết khả sinh tổng hợp PHA chủng vi sinh vật phân lập từ đảo Trường Sa Lớn (Việt Nam) để ứng dụng cho đội đóng quân biển, đảo Trong nghiên cứu này, vi sinh vật ưa mặn từ đảo Trường Sa Lớn có khả sinh tổng hợp PHA phân lập, tuyển chọn Các chủng định danh phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu, thiết bị, hóa chất 2.1.1 Vật liệu Các mẫu đất, nước chất thải nuôi heo lấy từ đảo Trường Sa Lớn (như bảng 1) Các mẫu lấy theo TCVN 7538-6:2010 (ISO 10381-6:2009) Mẫu đựng vào túi nilon vơ trùng, bọc kín, bảo quản lạnh đến sử dụng Chi tiết vị trí lấy mẫu tổng hợp theo bảng Bảng Vị trí mẫu đất mẫu dùng nghiên cứu TT Tên mẫu Vị trí lấy mẫu Tọa độ Mẫu đất Đất trồng lâu năm Vùng rễ bàng vuông, 8°38'46.56"Bắc sâu 30 cm, đất ẩm, nhiều cát 111°55'21.07"Đông Mẫu đất Đất trồng rau muống, sâu 10 cm so với bề mặt, đất 8°38'46.55"Bắc ẩm, nhiều cát sỏi nhỏ 111°55'21.08"Đông Mẫu đất Đất khu chăn nuôi, Cạnh bên trái hố ga khu chăn 8°38'46.58"Bắc nuôi 111°55'21.07"Đông Mẫu nước Nước bề mặt biển, Trường Sa 8°38'46.58"Bắc 111°55'21.06"Đông Mẫu chất thải Mẫu chất thải nuôi heo sau rửa chuồng 8°38'46.58"Bắc nước biển 111°55'21.06"Đông Mẫu nước thải Mẫu nước thải nuôi heo sau xử lý, chưa hố 8°38'46.59"Bắc gas 111°55'21.06"Đông 2.1.2 Thiết bị Box cấy vô trùng, máy lắc, máy ly tâm, tủ hút, tủ sấy, nồi khử trùng nước, cân phân tích, máy PCR (BioRad), thiết bị điện di ngang hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad) dụng cụ thí nghiệm khác Phịng Cơng nghệ Hóa sinh/Viện Cơng nghệ 2.1.3 Hóa chất Các dung môi dùng để tách chiết PHA: Acetone, ethanol, methanol, NaClO, nước cất Các hóa chất dùng để ni cấy vi sinh vật thành phần môi trường nuôi cấy Các hóa chất đảm bảo độ tinh khiết phân tích PA Thành phần môi trường nuôi cấy (g/l): MgSO4.7H2O 0,25; NaCl 50; CaCl2.2H2O 0,09; KCl 0,5; KBr 0,06; pepton 5; Cao nấm men 10; Glucose 10; pH 7-7,2 Môi trường khử trùng 115 oC 30 phút Môi trường thạch bổ sung 18 g/l agar 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập vi khuẩn ưa mặn tổng hợp PHA [5] Mẫu nước: Lắc mẫu, lấy 50, 100 l mẫu nước gạt thạch đĩa chứa môi trường nuôi cấy, ủ ấm 37 oC 72 để kiểm tra phát triển khuẩn lạc Mẫu đất, mẫu chất thải, nước thải nuôi heo: Cân 10 g đất/chất thải/nước thải lắc 100 ml nước muối sinh lý, sau đó, pha lỗng nồng độ theo dãy thập phân Lấy 100 l mẫu Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 80, - 2022 127 Hóa học & Mơi trường pha lỗng cấy gạt thạch đĩa chứa môi trường nuôi cấy, ủ ấm 37 oC 72 để kiểm tra phát triển khuẩn lạc Pha môi trường chứa Nile red: Mơi trường thạch đun nóng chảy, bổ sung Nile red đến nồng độ cuối 0,5 mg/l sau đổ đĩa, để nguội cấy vi khuẩn lên Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc soi đèn UV để phát vi khuẩn sinh PHA (khuẩn lạc phát sáng màu cam hồng) 2.2.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Sau phân lập vi khuẩn có khả sinh tổng hợp PHA, chủng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng Sau 48 - 72 giờ, mẫu lấy ly tâm thu sinh khối tách chiết thu hồi PHA theo mục 2.2.3 Mẫu thu hàm lượng PHA cao tuyển chọn cho nghiên cứu Các thí nghiệm lặp lại lần 2.2.3 Tách chiết thu hồi PHA [1] Mỗi mẫu lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft biết khối lượng Ly tâm loại bỏ dịch thu sinh khối sấy khô, cân khôi lượng để tính hàm lượng tế bào khơ Tách chiết thu hồi PHA thực theo quy trình mơ tả trước đây, sử dụng metanol để kết tủa PHA [1] Các thí nghiệm lặp lại lần Cân lại khối lượng tính khối lượng PHA thu (g/l) theo công thức: 𝑚𝑠𝑎𝑢 − 𝑚𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 (𝑔) 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑃𝐻𝐴 ℎ𝑜ặ𝑐 ℎà𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑠𝑖𝑛ℎ 𝑘ℎố𝑖 (𝑔/𝑙) = 𝑉 (𝑙í𝑡) Trong đó: mban đầu khối lượng ống eppendoft hay ống falon ban đầu; msau khối lượng ống sau sấy khô sinh khối PHA; V thể tích mẫu lấy để phân tích 𝑚 𝑃𝐻𝐴 (𝑔/𝑙) ∗ 100 𝑇ỷ 𝑙ệ 𝑃𝐻𝐴 (%) = 𝑚 𝑠𝑖𝑛ℎ 𝑘ℎố𝑖 (𝑔/𝑙) 2.2.4 Định danh vi sinh vật [7] Các chủng thu hàm lượng PHA cao định danh giải trình tự 16S rRNA Các chủng vi khuẩn nuôi cấy đĩa thạch để tạo khuẩn lạc riêng rẽ Từ khuẩn lạc, sinh khối vi khuẩn lấy để tách ADN tổng số theo kit Genomic DNA Extraction ADN tổng số thu được kiểm tra điện di gel agarose 1% đệm TAE 1X Các đoạn ADN tổng số đủ điều kiện sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen 16S rRNA Thành phần phản ứng PCR (l): ADN tổng số 1; Buffer 2,5; Tag polymerase 1, dNTP 2,5, Primer 27f/1492r 1/1; dH2O 16 Phản ứng PCR thực theo quy trình 35 chu kỳ mơ tả trước [7] Các sản phẩm PCR làm giải trình tự thiết bị iSeq100 (Illumina) Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh so sánh với ngân hàng liệu gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi sinh vật ưa mặn sinh tổng hợp PHA Từ mẫu nước, đất chất thải nuôi heo ngồi đảoTrường Sa Lớn, có 20 chủng vi sinh vật phần lập có khả sinh tổng hợp PHA có chủng nấm sợi (TSM1, TSM2, TSM3, TSM4) Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu sinh khối lâu nên lựa chọn chủng vi khuẩn để nghiên cứu tiếp Kết cho thấy cấy mơi trường có bổ sung Nile red soi đèn UV, chủng vi sinh vật sinh tổng hợp PHA có phát sáng màu hồng cam với mức độ khác (hình 1) Theo Ratnaningrum 2018, mức độ phát sáng đèn UV thể mức độ sinh tổng hợp PHA [5] Kết phân lập cho thấy chủng có khả sinh tổng hợp PHA với mức độ khác nhau, phát sáng màu hồng cam nhạt Tuy nhiên, nghiên cứu định tính khả 128 N T T Thư, …, P K Cường, “Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn … từ đảo Trường Sa Lớn.” Nghiên cứu khoa học công nghệ sinh tổng hợp PHA Các chủng nghiên cứu định lượng khả sinh PHA để chọn chủng sinh tổng hợp PHA nhiều Hình Hình ảnh cấy ria vi khuẩn sinh tổng hợp PHA ánh sáng UV Hình Hình ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn sinh PHA cấy môi trường dinh dưỡng sau ngày 35 oC 3.2 Tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp PHA cao Cấy chủng vi khuẩn phân lập môi trường dinh dưỡng mục 2.1.3 Sau 48 giờ, dịch nuôi cấy ly tâm thu sinh khối tách chiết thu hồi PHA Lượng sinh khối hàm lượng PHA thu được trình bày hình 3, hình Từ kết hình 3, hình cho thấy hầu hết vi khuẩn có khả sinh PHA với mức độ khác nhau, từ 2,47% đến 33,66% so với lượng tế bào khô Các chủng TSL10, TSLS1.2 có hàm lượng sinh khối cao hàm lượng PHA (g/l) lại thấp nên tỷ lệ % PHA thu thấp Các chủng TSL1, TSL3, TSL5, TSL9, TSL12, TSLT14, TSLW1, TSLS1.3, TSLS23 có khả sinh PHA cao so với chủng lại Tuy nhiên, có chủng TSLT14 TSLS23 có tỷ lệ % PHA thu cao (khoảng 30%) nên chủng sử dụng để định tên, phân loại cho nghiên cứu Đây khảo sát ban đầu khả sinh tổng hợp PHA chủng vi sinh vật địa đảo Trường Sa Lớn Để nâng cao hiệu suất tạo thành PHA chủng cần nghiên cứu điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng (nguồn C, nguồn N, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nồng độ muối tỷ lệ C/N), điều kiện lên men tối ưu để thu nhận lượng sinh khối PHA nhiều So với chủng tự nhiên phân lập thuộc chi Bacillus sp B58, B51, B60, Bacillus cereus B52, Bacillus thuriengensis có khả sinh tổng hợp PHA với hàm lượng dao động từ 20 đến 35% [5] Hình Hàm lượng sinh khối PHA (g/l) Hình Tỷ lệ PHA tạo thành chủng vi khuẩn sinh chủng phân lập 3.3 Định danh vi khuẩn Kết giải trình tự so sánh trình tự ngân hàng gen cho thấy chủng TSLT14 thuộc chi Klebsiella, có trình tự 16S rRNA tương đồng 100% với chủng Klebsiella pneumoniae OU17, Klebsiella quasipneumoniae SNI47, NCTC11357 Chủng đặt tên Klebsiella sp TSLT14 Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 80, - 2022 129 Hóa học & Mơi trường Chủng TSLS23 thuộc chi Bacillus, có trình tự đoạn gen 16S rRNA tương đồng 100% với chủng Bacillus aureus G1-1, MLY1, tương đồng 99,88% với chủng Bacillus thuringiensis GAA07 Chủng đặt tên Bacillus sp TSLS23 Trên giới, có số công bố khả sinh PHA chủng thuộc chi Klebsiella Bacillus Chủng vi khuẩn Klebsiella aerogenes có khả sinh PHB nhanh chủng E Coli tái tổ hợp [11] Chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae có khả phát triển tốt môi trường chứa glucose, dầu thực vật sử dụng dầu ăn với tỷ lệ khác Chủng sinh PHA tốt chủng Bacillus cereus tương đương với Bacillus subtilis [9] Đây chi có khả nặng chịu mặn tốt, chịu mặn đến 5% [4, 7] số 19 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp PHA phân lập từ đất thuộc chi Bacillus [5] Trình tự đoạn gen 16S rRNA hai chủng đăng ký GenBank với mã số đăng ký cho chủng TSLT14 TSLS23 MZ165335 MZ165340 Cây phát sinh chủng loại chủng phân lập chủng gần gũi trình bày hình Hình Cây phát sinh chủng loại chủng có khả sinh PHA phân lập từ đảo Trường Sa Lớn KẾT LUẬN Nghiên cứu phân lập 20 chủng có khả sinh tổng hợp PHA mức độ khác Trong số đó, chủng TSLT14 phân lập từ nước thải chăn nuôi đảo Trường Sa Lớn thuộc chi Klebsiella đặt tên Klebsiella sp TSLT14 Chủng TSLS23 phân lập từ đất đảo Trường Sa Lớn thuộc chi Bacillus đặt tên Bacillus sp TSLS23 Trình tự 16S rRNA đăng ký GenBank với mã số đăng ký cho chủng TSLT14 TSLS23 MZ165335 MZ165340 Kiến nghị: Để nâng cao hiệu suất tạo thành PHA, cần nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng khả tạo PHA chủng nguồn C, nguồn N, tỷ lệ C/N, nồng độ muối, nhiệt độ ni cấy quy trình lên men để thu nhận PHA tốt Lời cảm ơn: Bài báo hoàn thành với hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Viện KH-CN quân năm 2021: “Nghiên cứu chế tạo nhựa sinh học (bioplastic) có khả tự phân hủy môi trường biển đảo” TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ali WS, Zaki NH, “Production of bioplastic by bacteria isolated from lcal soil and organic wastes” Current Research in Microbiology and Biotechnology, 5(2), pp 1012-1017, (2017) 130 N T T Thư, …, P K Cường, “Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn … từ đảo Trường Sa Lớn.” Nghiên cứu khoa học công nghệ [2] Dilkes-Hoffman LS, Lant PA, Laycock B, Pratt S “The rate of biodegradation of PHA bioplastics in the marine environment: A meta-study” Marine Pollution Bulletin 142, pp 15-24, (2019) [3] Koller M “Production of Hydroxylankanoate (PHA) biopolyesters by extremophiles?” MOJ Polymer Science, I (2), pp 69-85, (2017) [4] Mitra R, Xu T, Xiang H, Han J, “Current developments on polyhydroxyalkanoates synthesis by using halophlies as a promising cell factory” Microbial Cell Factories 19:86 https://doi.org/10.1186/s12934-020-01342-z, (2020) [5] Ratnaningrum D, Saraswaty V, Priatni S, Lisdiyanti P, Purnomo A, Pudjiraharti S “Screening of polyhydroxyalkanoates (PHA)-producing bacteria from soil bacteria strains” IOP Conf Series: Earth and Environmental Science 277 (2019) 012003 IOP Publishing DOI:10.1088/1755-1315/277 /1/012003, (2018) [6] Saharan BS, Grewal A, Kumar P “Biotechnological production of polyhydroxyankanoates: a review on trends and latest developments” Chinese Journal of Biology, Article ID 802984, 18 pages http://dx.doi.org/10.1155/2014/802984, (2014) [7] Trần Hữu Phong, “Nghiên cứu lên men thu nhận polyhydroxyalkanoates từ vi khuẩn phân lập số vùng đất Việt Nam” Luận án Tiến sĩ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội, (2017) [8] Thomas T, Sudesh K, Bazire A, Elain A, Tan HT, Lim H, Bruzaud S “PHA production and PHA synthases of the Halophilic bacterium Halomonas sp” SF2003 Bioengineering, 7, 29 DOI:10.3390 www.mdpi.com/journal/bioenginee-ring, (2020) [9] Tufail S, Munir S, Jamil N “Variation analysis of bacterial polyhydroxyalkanoate production using saturated and unsaturated hydrocarbons” Brazilian Journal of Microbiology, pp 48, 629 - 636, (2017) [10] Winnacker M “Polyhydroxyalkanoates: Recent advances in their synthesis and application” European Journal Lipid Science Technology DOI: 10.1002/ejlst.201900101, (2019) [11] Zhang H, Obias V, Gonyer K, Dennis D “Production of polyhydroxyalkanoates in Succrose-utilizing recombinant Escherichia coli and Klebsiella strains” Apply Environment Mirobiology 60, pp 1981205, (1994) ABSTRACT Screening of polyhydroxyalkanoate (PHA) produced by bacteria isolated from Truong Sa Lon island Polyhydroxyalkanoate (PHA) is a biodegradable plastic produced by microorganisms PHA is a form of energy and C storage in microbial cells in the conditions of excess C source and lack of one of the compounds N, S, P, etc Many microorganisms can biosynthesis PHA but halophilic bacteria have some advantages due to cost and energy savings In this study, the results of isolation and screening of halophilic bacteria from soils, wastes, and water on Truong Sa Lon island are presented Two strains of 20 strains of halophilic bacteria isolated from Truong Sa Lon island which are capable of biosynthesis of high PHA were identified by sequencing 16S rRNA gene segment The results showed that strain TSLT14 belonged to the genus Klebsiella and was named Klebsiella sp TSLT14 TSLS23 strain belongs to the genus Bacillus and was named Bacillus sp TSLS23 Keywords: Biodegradation; Bioplastic; Polyhydroxyankanoate; Halophilic; Truong Sa Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 80, - 2022 131 ... Anh phân lập vi khuẩn ưa mặn Halomonas maura rừng ngập mặn Giao Thủy Nam Định Đặc biệt, chưa có nghiên cứu chi tiết khả sinh tổng hợp PHA chủng vi sinh vật phân lập từ đảo Trường Sa Lớn (Vi? ??t... THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi sinh vật ưa mặn sinh tổng hợp PHA Từ mẫu nước, đất chất thải nuôi heo ngồi đảoTrường Sa Lớn, có 20 chủng vi sinh vật phần lập có khả sinh tổng hợp PHA có chủng nấm... P K Cường, ? ?Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn … từ đảo Trường Sa Lớn. ” Nghiên cứu khoa học công nghệ sinh tổng hợp PHA Các chủng nghiên cứu định lượng khả sinh PHA để chọn chủng sinh tổng hợp PHA nhiều