Đang tải... (xem toàn văn)
Trang 67 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 1 Nguyên liệu và hóa chất Các hóa chất như carbazole, diethyl phosphite, amine thơm, tất cả các dung môi và chất xúc tác Polyethylen glycol 400 (code 202398 250G) mua từ Công ty Hóa chất Aldrich Tất cả các phản ứng được thực hiện trong điều kiện khí quyển và ở nhiệt độ môi trường Điểm nóng chảy được xác định trên thiết bị điểm chảy Mel Temp (IA9100) Phổ hồng ngoại đã được ghi lại trên máy quang phổ Bruker FT IR (Tensor 37), dạng viên nén KBr Phổ 1H, 13.
CHƯƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu hóa chất Các hóa chất carbazole, diethyl phosphite, amine thơm, tất dung môi chất xúc tác Polyethylen glycol-400 (code: 202398-250G) mua từ Công ty Hóa chất Aldrich Tất phản ứng thực điều kiện khí nhiệt độ mơi trường Điểm nóng chảy xác định thiết bị điểm chảy Mel-Temp (IA9100) Phổ hồng ngoại ghi lại máy quang phổ Bruker FT-IR (Tensor 37), dạng viên nén KBr Phổ 1H, 13C-NMR 31P đo máy quang phổ Varian Gemini-2000 (200 MHz) Các độ dời hóa học cho 1H, 13C NMR 31P báo cáo đơn vị ppm, nội chuẩn TMS Mueller Hinton Agar (MHA), Potato Dextrose Agar (PDA), Becton, Công ty Dickinson Các vi sinh vật sử dụng Bacillus subtilis (KCTC 1022), Staphylococcus aureus (KCTC 1916), Escherichia coli (KCTC 2441), Candida albicans (ATCC 1023) Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7904) Các đối chứng dương Fluconazole Ampicillin dạng thương mại từ Sigma Aldrich Các dung dịch Fluconazole, mg/mL Ampicillin, mg/mL) điều chế theo khuyến nghị nhà sản xuất Dung dịch đệm phosphate, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) DPPH (1,1-Diphenyl-1-2 picrylhydrazyl) cung cấp từ PBS, Gibco, Hoa Kỳ Thuốc kháng tế bào ung thư chuẩn Camptothecin, Aldrich Sigma Thiết bị sử dụng cho thử độc tính tế bào theo phương pháp MTT thực ELISA Bio-Rad Các dòng tế bào chống ung thư hỗ trợ Giáo sư Jeong-Hyung Lee- Đại học Gangwon quốc tế, Hàn Quốc 2.2 Qui trình 2.2.1 Qui trình tổng hợp hợp chất, 3a-j Sơ đồ Tổng hợp sản phẩm, 3a-j a) Et-Br, KOH, DMSO khô, đung hồi lưu 24 h, 91% 1; b) Vilsmeier Haack: DMF (khan) CH2Cl2; POCl3 ClCH2CH2Cl, N2, đun hồi lưu, 48 h, NaOH, 95% 2; c) Kabachnik-Fields: 9–ethyl–9H–carbazole–3–carbaldehyde (1 mmol), diethyl phosphite (1.3 mmol), analogue primary aromatic amine (1 mmol), PEG–400 catalyst (0.38 % mol), 100 oC, 6–7 h, 3a-j: 84-91% Trang 67 2.2.1.1 Tổng hợp 9–Ethyl–9H–carbazole (1) Carbazole (5 g, 0,03 mol) thêm vào huyền phù KOH (4,1 g, 0,073 mol) 15 mL DMSO mơi trường khí nitơ Sau 1h khuấy mạnh, bromoethane (3,4 mL, 0,045 mol) thêm vào Hỗn hợp phản ứng khuấy qua đêm, sau phản ứng kết thúc, đổ vào nước đá chất rắn kết tủa lọc Chất rắn rửa nước sấy khô Sản phẩm thô kết tinh lại ethanol 95% sấy khơ khơng khí 2.2.1.2 Tổng hợp 9–ethyl–9H–carbazole–3–carbaldehyde (2) Cho dung dịch 9-ethyl-9H-carbazole (5 g, 26 mmol) DMF khô (2,89 mL, 39 mmol) 15 mL (0,235 mol) CH2Cl bể nước đá, (3,49 mL, 39 mmol) POCl3 1,2-dichloroethane thêm vào giọt điều kiện làm lạnh nước đá Sau đun nóng hồn lưu qua đêm, dung dịch NaOH lỗng thêm vào chiết lần (3 x100 mL) dichloromethane Lớp hữu làm khô natri sulfat khan sau loại bỏ dung mơi, phần rắn làm sắc ký cột, thu chất rắn màu vàng 2.1.1.3 Quy trình chung để điều chế hợp chất (3a-j)[5] Hỗn hợp 9–ethyl–9H–carbazole–3–carbaldehyde (3) (3 mmol) thêm vào PEG-400 (3,3 g, 8,25 mmol, 0,83% mol) hỗn hợp đun nóng đến 100 °C khuấy 6-7 Sau hoàn thành phản ứng theo dõi TLC, hỗn hợp sau pha lỗng với nước lạnh kết tủa thu được lọc rửa nước Phần dư sấy khô tinh chế sắc ký cột silicagel (hexane: ethyl acetate, V:V = 6: 4) để tạo α-amino phosphonate tinh khiết Trong trường hợp sản phẩm dầu nhựa chiết xuất ethyl acetate, rửa nước sấy khô qua natri sulfat Loại bỏ dung môi sau tinh chế sắc ký cột silicagel cho αamino phosphonate tinh khiết 2.2.1.4 Quy trình ngắn gọn thực để tái sử dụng chất xúc tác PEG-400 Hỗn hợp phản ứng bình thủy tinh sau hồn thành phản ứng (kiểm tra TLC) rót vào phễu chiết 1000 mL 250 mL Chloroform thêm vào phễu chiết 250 mL nước thêm vào Hỗn hợp phễu chiết giữ tách thành pha bao gồm pha nước (dietyl photphat, PEG-400) pha sản phẩm thô Pha sản phẩm thô CHCl3 lớp phễu chiết pha nước lớp Pha nước thêm 250 mL dung môi toluene lắc vài phút Pha toluene nước tách thành pha Lớp toluene làm bay thiết bị bay chân không để thu hồi xúc tác PEG-400 dung môi toluene 2.2.2 Hoạt tính sinh học 2.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn nấm[36] Trang 68 Hoạt tính kháng khuẩn: ester amino phosphate thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa kháng lại vi sinh vật Bacillus subtilis (KCTC 1022), Staphylococcus aureus (KCTC 1916), Escherichia coli (KCTC 2441), Candida albicans (ATCC 1023) Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7904) Các sinh vật thử nghiệm nuôi môi trường dinh dưỡng 24 37 °C Muller-Hinton agar (MHA) sử dụng làm môi trường thạch cho vi khuẩn Potato Dextrose agar (PDA) cho nấm Các giếng có đường kính mm tạo đĩa gel PDA đĩa giấy có đường kính mm đặt đĩa gel MHA Mỗi chủng làm vào đĩa riêng vô trùng Sử dụng micropipette vô trùng cho 30 μL mẫu hợp chất ester amino phosphate, (3a- j) dung dịch đối chứng dương rót vào giếng đĩa giấy Sau ủ 35oC 24 giờ, mức độ ức chế khác đo thước 2.2.2.2 Độc tính tế bào [37] Thử độc tính tế bào hợp chất 3a-j thực phương pháp MTT ba dòng tế bào ung thư người MCF-7 (dòng tế bào ung thư vú), A-549 (dòng tế bào ung thư phổi người) HeLa (dòng tế bào ung thư cổ tử cung người) vitro mà khơng có thay đổi đáng kể Phương pháp đánh giá độc tế bào Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) phương pháp so màu, đo độ giảm màu vàng MTT MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể tế bào tạo thành formazan dạng tinh thể Có thể dùng số dung mơi hữu (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào hoà tan tinh thể formazan, sau đo độ hấp thụ quang học dung dịch 570nm Chuẩn bị dòng tế bào Các dòng tế bào ung thư cung cấp GS Jeong-Hyung Lee, trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc Tế bào ung thư nuôi cấy theo phương pháp Mosmann cs Các dòng tế bào nuôi cấy 37oC môi trường RPMI 1640 DMEM có bổ sung huyết phơi bị 10% (FBS), 100U/ml penicillin 100mcg/ml streptomycin tủ nuôi cấy CO2 5% 48 Các bước tiến hành: Tế bào nuôi cấy 48 môi trường RPMI 1640 DMEM 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) streptomycin (100µg/mL) Sau chúng ni cấy giếng phiến 96 với thể tích 200 µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ loại tế bào) Sau 24 giờ, chúng thử với hợp chất pha sẵn nồng độ khác DMSO Sau 72h, cho phản ứng với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h 37oC 5% CO2 Sau hút bỏ hết mơi trường bề mặt, kết tủa formazan hòa tan isopropanol Độ hấp thụ đo 570 nm Camptothecin sử dụng làm đối chứng dương Trang 69 Tính kết Tính giá trị CS % (% Cell Survival) Giá trị CS: khả sống sót tế bào nồng độ ban đầu mẫu thử, mẫu cho giá trị CS ≤ 50% đánh giá có hoạt tính Giá trị CS(%) tính theo cơng thức: 𝐶𝑆% = [ Trong đó: OD (mẫu thử) – OD ( ngày 0) × 100] ± 𝜎 OD (DMSO) – OD ( ngày 0) OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn (∑ 𝑥𝑖 −𝑥̅ )2 σ tính theo cơng thức: 𝜎 = √ 𝑛−1 ; Trong đó: xi : giá trị OD giếng i x ̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) chọn cho thử nghiệm bước hòa tan isopropanol Độ hấp thụ đo 570 nm 2.2.3 In silico Molecular docking Các hợp chất đích, 3a-j cho thấy hoạt tính cao vitro tiếp tục thực nghiên cứu silico molecular docking model 3c, 3h 3b để giải thích hoạt tính ức chế nấm vi khuẩn mạnh Phần mềm AutoDockTools phiên 1.5.6rc3 sử dụng để tính tốn docking ligand receptor Các cấu trúc tinh thể receptor Candida albicans (PDB: 6TZM, có độ phân giải 1.714 Å, DOI: 10.2210/pdb6TZM/pdb), Saccharomyces cerevisiae (3ET5, 2.5 Å, DOI: 10.2210/pdb3TE5/pdb) Bacillus megaterium (6NVW, 2.203 Å, DOI: 10.2210/pdb6NVW/pdb) download từ ngân hàng liệu Protein hiệu lực Trong q trình tính tốn xử lý docking, receptor tiến hành loại bỏ phân tử nhỏ phân tử nước, phối tử nhỏ dị tố lưu file định dạng (receptor.pdb), thực gói phần mềm Discovery Studio 2019 Client (DSC).[38] Đối với ligand, chúng tối ưu hóa phương pháp học phân tử & trường lực (MMFF94), thực gói phần mềm Avogadro Cấu dạng tối ưu ligand chọn lọc để tính tốn docking Phần mềm AutoDock 4.2 sử dụng để tính tốn receptor ligand (hợp chất tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn, nấm mạnh toàn cấu trúc (3a-j) với tính tốn độc tính tế bào).[39] Đối với protein mục tiêu, điện tích Kollman liên kết hydrogen phân cực thêm vào tất tất nguyên tử Trong trường hợp ligand, thêm tất hydrogens phân cực, điện tích Gasteiger tính tốn, trộn lẫn liên kết hydrogen khơng phân cực file lưu định dạng *.pdbqt Khoảng cách điểm lưới, số lượng điểm lưới tham số thay đổi Trang 70 tọa độ điểm lưới trung tâm đồ lưới cài đặt giá trị 0,375Å, (60 x 60 x 60) (120x120x120) (X = 38.324, Y = 10.387, Z = 94.100), tương ứng Một phối tử liên kết vào receptor phương pháp sử dụng giải thuật di truyền Lamarckian Giá trị âm tối đa lượng tự liên kết chọn tương ứng với cấu trúc ổn định sau 2.500.000 đánh giá lượng chạy 200 lần cho receptor vi khuẩn nấm, dòng tế bào ung thư.[38,40-44] Các gói phần mềm Discovery Studio 2019 Client Molegro (MMV) sử dụng để xây dựng mơ hình trình bày kết dạng bảng hình Trang 71 ... 25 0 mL dung môi toluene lắc vài phút Pha toluene nước tách thành pha Lớp toluene làm bay thiết bị bay chân không để thu hồi xúc tác PEG-400 dung mơi toluene 2. 2 .2 Hoạt tính sinh học 2. 2 .2. 1 Hoạt. .. tốn docking Phần mềm AutoDock 4 .2 sử dụng để tính tốn receptor ligand (hợp chất tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn, nấm mạnh toàn cấu trúc (3a-j) với tính tốn độc tính tế bào).[39] Đối với protein... chất rắn màu vàng 2. 1.1.3 Quy trình chung để điều chế hợp chất (3a-j)[5] Hỗn hợp 9–ethyl–9H? ?carbazole? ??3–carbaldehyde (3) (3 mmol) thêm vào PEG-400 (3,3 g, 8 ,25 mmol, 0,83% mol) hỗn hợp đun nóng