Thẩm định phương pháp xác định hạt vi nhựa trong mẫu nước, ứng dụng phân tích mẫu nước biển cần giờ phần 2 luận văn thạc sĩ

32 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2 1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2 1 1 Hóa chất LDPE của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ hơn 300 micron PA 6 của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt từ 5 50 micron, cỡ hạt trung ình từ 15 – 20 micron PET của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ hơn 300 micron PVC của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ hơn 250 micron PMMA của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt 85 micron Chitin from shrimp shells (Poly (1→4) β N acetyl D glucosamine) của hãng Sigm.

CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2.1.1 Hóa chất - LDPE hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ 300 micron - PA hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt từ - 50 micron, cỡ hạt trung ình từ 15 – 20 micron - PET hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ 300 micron - PVC hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ 250 micron - PMMA hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt 85 micron - Chitin from shrimp shells (Poly-(1→4)-β-N-acetyl-D-glucosamine) hãng Sigma-aldrich, code C7170 - Nile red (for microscopy) hãng Sigma-aldrich, code 72485 - Acetone (> 99%) hãng Scharlau - Methanol 99.8 % hãng Merck - n-Hexan 98.5 % hãng Merck - H2O2 (30%) hãng Merck - FeSO4.7H2O (99.5 – 102 %) hãng Merck - H2SO4 (95 - 97%) hãng Merck - Nƣớc c t sử dụng phân tích nƣớc siêu tinh khiết có điện trở > 18,3 MΩ⋅cm Cách pha hóa ch t 32 - Dung dịch lƣu trữ Nile red 500 mg/L: hòa tan mg Nile red 10 mL acetone, ảo quản lạnh chai nâu - Dung dịch lƣu trữ Nile red 250 mg/L: hòa tan mg Nile red 20 mL acetone, ảo quản lạnh chai nâu - Dung dịch lƣu trữ Nile red 50 mg/L: hòa tan mg Nile red 100 mL acetone, ảo quản lạnh chai nâu - Dung dịch Nile red 10 mg/L: pha loãng lẩn dung dịch Nile red 50 mg/L acetone, ảo quản lạnh chai nâu - Dung dịch Nile red mg/L: pha loãng 10 lẩn dung dịch Nile red 50 mg/L acetone, ảo quản lạnh chai nâu - Dung dịch Nile red mg/L (trong methanol): hòa tan 0,5 mg Nile red 100 mL methanol, ảo quản lạnh chai nâu - Dung dịch Nile red mg/L (trong n-hexan): pha loãng 10 lẩn dung dịch Nile red 50 mg/L (trong acetone) ằng n-hexan, ảo quản lạnh chai nâu - Thuốc thử Fenton: Kết hợp H2O2 dung dịch FeSO4 0,05M (hòa tan 7.5 g FeSO4.7H2O (278.02 g/mol) 500 mL nƣớc c t ml H2SO4 98%) - Dung dịch loại vi nhựa đƣợc chuẩn ị ằng cách cho khoảng 0,2 mg vi nhựa vào lít mẫu trắng (nƣớc iển qua màng lọc GF/C) - Dung dịch hỗn hợp loại vi nhựa chitin đƣợc chuẩn ị ằng cách cho khoảng 0,2 mg loại vào lít mẫu trắng (nƣớc iển qua màng lọc GF/C) - Dung dịch dùng để khảo sát độ thu hồi độ lặp lại đƣợc chuẩn ị ằng cách xác định số hạt vi nhựa cần khảo sát cho vào lít mẫu trắng (nƣớc iển qua màng lọc GF/C), trình ày mục 2.2.2.2 T t hóa ch t, thuốc thử đƣợc lọc qua màng lọc GF/C trƣớc sử dụng 33 2.1.2 Thiết bị dụng cụ - Thiết ị kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX53 - Thiết ị quang phổ hồng ngoại iến đổi Fourier (Thermo iS50 FT-IR) - Bếp cách cát (Harry gestigkeit) có điều chỉnh nhiệt độ, công su t - Tủ s y (Memmert) có điều chỉnh nhiệt độ, thời gian - Cốc thủy tinh 250 ml (Duran) - Chai thủy tinh 1000 ml (Duran) - Lam kính thủy tinh - Mặt kính đồng hồ - Bộ lọc chân khơng Glassco - Đ a petri thủy tinh đƣờng kính 60 mm có nắp đậy - Màng lọc sợi thủy tinh GF/C, Whatman, code: 1822-047, đƣờng kính 47 mm, cỡ lọc 1.2 µm - Màng lọc cellulose acetate (CA), Sartorius, đƣờng kính 47 mm, cỡ lọc 0.45 µm - Nhíp gắp ằng inox - Rây inox mm 34 Hình 2.1 Kính hiển vi huỳnh quang hệ thống ATR-FTIR 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến ảnh huỳnh quang Trong nghiên cứu khảo sát ảnh huỳnh quang với a ộ lọc huỳnh quang với thông số sau: - Bộ lọc 1: Bƣớc sóng kích thích/phát xạ tƣơng ứng 430/470 nm - Bộ lọc 2: Bƣớc sóng kích thích/phát xạ tƣơng ứng 515/560 nm - Bộ lọc 3: Bƣớc sóng kích thích/phát xạ tƣơng ứng 650/670 nm 2.2.1.1 Khảo sát dung môi mang Nile red Nile red có khả n ng hịa tan cao phát huỳnh quang mạnh nhiều loại dung môi hữu nhƣ metanol, ethanol, ethylacetate, acetonitril, dichloromethane, toluene, n-hexane cyclohexane [86] Các cơng trình cơng ố gần cho th y dung môi nhƣ n-hexan [86], methanol [87], acetone [89] cho hiệu cao việc nhuộm MPs Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát với loại dung môi gồm: nhexan, methanol acetone Các thí nghiệm đƣợc tiến hành điều kiện 35 với MPs nhƣ PA 6, PE, PET, PVC, PMMA polyme tự nhiên Chitin Dựa vào ảnh huỳnh quang thu đƣợc lựa chọn loại dung môi để pha NR cho thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo ảng sau; Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi mang NR Polyme NR/Acetone NR/Methanol NR/n-hexan PA PE PET PVC PMMA Chtin 2.2.1.2 Khảo sát nồng độ thuốc nhuộm Nile red Nồng độ thuốc nhuộm NR có ảnh hƣởng đến cƣờng độ huỳnh quang thu đƣợc [86][87][89][91] Ở ngƣỡng nồng độ th p, cƣờng độ huỳnh quang t ng theo nồng độ thuốc nhuộm, t ng nồng độ thuốc nhuộm làm t ng tần xu t tƣơng tác thuốc nhuộm đối tƣợng nhuộm Tuy nhiên vƣợt mức nồng độ thuốc nhuộm tối ƣu xu hƣớng ị đảo ngƣợc giá trị huỳnh quang giảm dần theo mức t ng nồng độ thuốc nhuộm [91] Để khảo sát nồng độ làm việc NR tiến hành ố trí thực nghiệm dựa q trình nhuộm NR nồng độ khác iến thiên từ 0,05 đến mg/L với ch t nhựa PA 6, đánh giá ảnh huỳnh quang thu đƣợc (trong điều kiện xác định) tƣơng ứng với ộ lọc huỳnh quang, từ kết luận nồng độ NR làm việc tối ƣu Bố trí thực nghiệm theo ảng sau: 36 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NR Polyme Nồng độ NR (mg/L) PA 0,05 PA 0,1 PA 0,5 PA 2,5 PA 5,0 Bộ lọc Bộ lọc Bộ lọc 2.2.1.3 Khảo sát độ nhạy lọc huỳnh quang Tiến hành khảo sát độ nhạy ộ lọc huỳnh quang ằng cách xác định giá trị exposure time (thời gian phơi sáng) th p nh t để phát rõ nét ảnh huỳnh quang mẫu Thời gian phơi sáng ảnh hƣởng lớn đến khả n ng phát tín hiệu huỳnh quang, khoảng thời gian máy ảnh tiếp xúc với ánh sáng (photon) phát từ mẫu [92] Thời gian phơi sáng dài, đầu dò nhận đƣợc nhiều photon, dẫn đến cƣờng độ điểm ảnh t ng lên hình ảnh sáng hơn, thời gian phơi sáng cao dẫn đến ảnh huỳnh quang sáng khó xác định đƣợc hình dạng vi hạt Trong thời gian phơi sáng ngắn không phát phát đƣợc ảnh huỳnh quang nhƣng mờ khơng rõ nét Do việc xác định thời gian phơi sáng phù hợp để phát ảnh huỳnh quang cách nhanh chóng ch t lƣợng r t quan trọng, từ điều chỉnh (t ng) thời gian phơi sáng để thu đƣợc tín hiệu huỳnh quang sáng rõ nét tƣơng ứng với ộ lọc 37 Để khảo sát chúng tơi tiến hành ố trí thí nghiệm với nhựa gồm PA 6, PE, PET, PVC, PMMA Các hạt nhựa đƣợc nhuộm với dung dịch Nile red Ảnh huỳnh quang hạt nhựa đƣợc ghi nhận mốc thời gian phơi sáng lần lƣợt ms, 10 ms, 50 ms, 100 ms, 200 ms 500 ms tƣơng ứng với ộ lọc huỳnh quang Kết dự kiến xác định đƣợc ộ lọc phát tín hiệu huỳnh quang thời gian phơi sáng th p nh t Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát độ nhạy ộ lọc huỳnh quang Polyme Thời gian phơi sáng Nile red ms PA + PE + PET + PVC + PMMA + 10 ms 50 ms 100 ms 200 ms 500 ms 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích Dựa vào kết thu đƣợc từ trình khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến ảnh huỳnh quang, tiến hành thẩm định phƣơng pháp phân tích với thơng số thẩm định nhƣ: Độ đặc hiệu, độ thu hồi độ lặp lại 2.2.2.1 Đánh giá độ đặc hiệu phương pháp Trong mơi trƣờng tự nhiên ngồi polyme tổng hợp (hạt vi nhựa) cịn có diện vật liệu hữu tự nhiên nhƣ Chitin (vỏ loài động vật nhƣ tôm, cua ), ột gỗ, ch t éo (lipid), vi tảo vật liệu hữu tự nhiên 38 nhuộm với Nile Red [86][87][89][91] Sự có mặt vật liệu hữu tự nhiên làm sai lệch kết phân tích hạt vi nhựa (gây sai số dƣơng), cần phải phân hủy vật liệu hữu tự nhiên đồng thời không làm ảnh hƣởng đến kết phân tích Đã có nghiên cứu với phƣơng thức phân hủy khác nhƣ sử dụng acid HCl, acid HNO3, NaOH, H2O2, Fenton, enzim…[93] Theo NOAA, thuốc thử Fenton đƣợc sử dụng để phân hủy vật ch t hữu diện mẫu [94], số nghiên cứu cho th y Fenton loại ỏ 80% mà không ảnh hƣởng đến vi nhựa [95] Trong nghiên cứu sử dụng thuốc thử Fenton để phân hủy Chitin, vật liệu hữu tự nhiên thƣờng có nƣớc iển Để khảo sát độ đặc hiệu phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm loại nhựa (PA 6, PE, PET, PVC, PMMA) Chitin Bố trí thí nghiệm theo ảng 2.4 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu Phân hủy Fenton Polyme Nhuộm Nile red PA + + PE + + PET + + PVC + + PMMA + + Chitin + + Nhựa + Chitin + + 39 Ảnh huỳnh quang Phổ FTIR Từ kết thu đƣợc tiến hành đánh giá: - Ảnh huỳnh quang loại nhựa Chitin - Ảnh huỳnh quang mẫu hỗn hợp gồm loại nhựa Chitin - Phổ hồng ngoại FTIR loại nhựa Chitin 2.2.2.2 Đánh giá độ thu hồi độ lặp lại phương pháp Để đánh giá độ thu hồi độ lặp lại phƣơng pháp, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với hai loại vi nhựa chuẩn PE PVC Với loại nhựa khảo sát a mức nồng độ khác hạt/L, hạt/L 10 hạt/L (khoảng nồng độ thƣờng có nƣớc iển [83][96]) Các hạt nhựa đƣợc thêm vào mẫu trắng (ở sử dụng nƣớc iển lọc qua màng lọc GF/C), mức nồng độ làm lặp lại lần (n = 6) [97][98] Tiến hành thí nghiệm cho loại nhựa nhƣ sau: - Tạo mẫu trắng thêm chuẩn: hạt nhựa PE (hình 2.4), PVC (hình 2.5) đƣợc chuyển lên lam kính thủy tinh (đã đƣợc làm sạch) đƣợc đặt tối màu đen, xác định số hạt cần khảo sát, dùng mẫu trắng chuyển hạt vào chai thủy tinh lít, dùng màng nhôm ao phủ miệng chai, đậy nắp lƣu giữ (hình 2.6) - Xử lý mẫu theo quy trình, nhuộm với thuốc thử Nile red - Xác định số hạt tìm đƣợc kính hiển vi huỳnh quang Dựa vào số hạt thêm vào số hạt tìm lại, tính toán hiệu su t thu hồi độ lặp lại nhƣ sau: - Độ thu hồi phƣơng pháp đƣợc tính theo cơng thức: %R  X *100  Trong đó:  X: Số hạt tìm lại, đƣợc xác định qua kính hiển vi huỳnh quang 40  µ: Số hạt thêm vào - Độ lặp lại phƣơng pháp đƣợc tính theo cơng thức: % RSD  SD *100 x Trong đó:  SD: Độ lệch chuẩn kết lặp lại, SD   ( x  x) i n 1  n: số lần thí nghiệm (n = 6)  xi : Số hạt tìm lại lần thử nghiệm thứ ‗i‘  x : Số hạt tìm lại trung ình n lần thử nghiệm Bố trí thí nghiệm xác định độ thu hồi độ lặp lại theo ảng 2.5 Hình 2.2 Số hạt PE thêm vào: – – 10 hạt 41 Hình 2.3 Số hạt PVC thêm vào: – – 10 hạt Hình 2.4 Mẫu trắng thêm chuẩn hạt PE 42 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát độ thu hồi độ lặp lại Mẫu trắng thêm chuẩn Phân hủy Fenton hạt MPs + + hạt MPs + + 3 hạt MPs + + hạt MPs + + hạt MPs + + hạt MPs + + hạt MPs + + hạt MPs + + hạt MPs + + 10 hạt MPs + + 11 hạt MPs + + 12 hạt MPs + + 13 10 hạt MPs + + 14 10 hạt MPs + + 15 10 hạt MPs + + 16 10 hạt MPs + + 17 10 hạt MPs + + 18 10 hạt MPs + + Stt 43 Nhuộm NR Ảnh huỳnh quang 2.2.3 Phân tích mẫu thực Để phân tích hạt vi nhựa mẫu nƣớc iển, lên kế hoạch l y mẫu khu vực iển Cần Giờ theo vị trí dự kiến nhƣ sau: Hình 2.5 Vị trí l y mẫu dự kiến Kế hoạch l y mẫu: - Phƣơng tiện l y mẫu đƣợc sử dụng ghe, thuê ngƣ dân khu vực l y mẫu - Vị trí l y mẫu đƣợc xác định khu vực iển Cần Giờ, tọa độ l y mẫu đƣợc ghi nhận ằng ứng dụng ―google map‖ điện thoại di động Samsung A71 Mẫu đƣợc l y 03 vị trí dọc theo ãi iển 30/4 - Đô sâu l y mẫu: mẫu đƣợc l y tầng nƣớc mặt, độ sâu l y mẫu khoảng 30 cm - Tổng số lƣợng mẫu đƣợc l y 60 mẫu, vị trí l y 20 mẫu, thể tích mẫu 01 lít Phân tích mẫu theo quy trình, xác định số vi nhựa ằng phƣơng pháp hiển vi huỳnh quang, định danh vi nhựa ằng phƣơng pháp quang phổ FTIR quang phổ Raman Đánh giá kết phân tích ằng kiểm định ANOVA (single factor) Tukey (post - hoc test) 44 ... mẫu đƣợc l y 60 mẫu, vị trí l y 20 mẫu, thể tích mẫu 01 lít Phân tích mẫu theo quy trình, xác định số vi nhựa ằng phƣơng pháp hiển vi huỳnh quang, định danh vi nhựa ằng phƣơng pháp quang phổ FTIR... MPs + + 17 10 hạt MPs + + 18 10 hạt MPs + + Stt 43 Nhuộm NR Ảnh huỳnh quang 2. 2.3 Phân tích mẫu thực Để phân tích hạt vi nhựa mẫu nƣớc iển, lên kế hoạch l y mẫu khu vực iển Cần Giờ theo vị trí... 100 ms 20 0 ms 500 ms 2. 2 .2 Thẩm định phương pháp phân tích Dựa vào kết thu đƣợc từ trình khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến ảnh huỳnh quang, chúng tơi tiến hành thẩm định phƣơng pháp phân tích với