(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và mảng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘYTẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MƠ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MƠ HÌNH THỎ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2022 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘYTẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MƠ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MÔ HÌNH THỎ NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH MÃ SỐ: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Công Toại PGS.TS Ngô Quốc Đạt Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2022 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Tran g LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT .ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ mô sụn 1.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .5 1.3 Giá thể sử dụng công nghệ mô sụn 15 1.4 Yếu tố tăng trưởng công nghệ mô 19 1.5 Công nghệ tạo tế bào 20 1.6 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 21 1.7 Mơ hình động vật đánh giá vật liệu ghép 22 1.8 Các phương pháp đánh giá trình lành thương mô sụn 24 1.9 Các nghiên cứu liên quan 26 CHƯƠNG 33 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thiết kế nghiên cứu 33 2.2 Đối tượng nghiên cứu 33 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.4 Quy trình nghiên cứu 34 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 2.5 Đạo đức nghiên cứu 46 CHƯƠNG 47 KẾT QUẢ 47 3.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ .47 3.2 Tạo tế bào sụn từ tế bào gốc trung mơ mỡ thỏ màng chân bì 53 3.3 Kết đánh giá tiềm tái tạo mô sụn in vivo mảnh ghép tế bào sụn mơ hình thỏ 64 CHƯƠNG 74 BÀN LUẬN 74 4.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ thỏ 74 4.2 Tạo tế bào sụn từ tế bào gốc trung mơ mỡ thỏ màng chân bì 78 4.3 Bàn luận kết ghép tế bào sụn mơ hình thỏ 85 KẾT LUẬN 89 KIẾN NGHỊ 91 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Đặng Trần Quân TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT TIẾNG VIỆT Chữ viết tắt BN CS TBG TBGTM TIẾNG ANH Chữ viết tắt ADSC BMSC CFU CM DMEM/F12 DMSO ECM EDTA EV FBS FDA FGF TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com iii GMP G HA H HBsAg H HCV H H&E H HIV IGF ISCT ISO H V In In T In S PBS P PLA P RT-PCR R re SEM S SAL S TGF T TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng PL1.4 Nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi cho gien đặc trưng TBGTM Gien Nhiệt độ bắt cặp ( C) 3.4 Khảo sát biểu gien tạo sụn Bảng PL1.5 Danh sách đoạn mồi khảo sát gien tạo sụn Gien Sox-9 Mồi xuôi Mồi ngược Col I Mồi xuôi Mồi ngược Col II Mồi xuôi Mồi ngược Col X Mồi xuôi Mồi ngược Aggrecan TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Mồi xuôi Mồi ngược Runx2 Mồi xuôi Mồi ngược Bảng PL1.6 Nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi cho gien tạo sụn Gien Nhiệt độ bắt cặp ( C) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC QUY TRÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TBGTM MỠ THỎ VÀ MÀNG CHÂN BÌ Quy trình thu nhận giá thể màng chân bì da người Quy trình thiết kế theo quy trình thực chuẩn (Standard Operation Procedure – SOP), mô tả phương pháp thu nhận màng chân bì từ da người hiến 1.1 Thu nhận màng chân bì da người Bước 1: Cắt lọc - Dùng dao loại bỏ mô thừa mô mỡ, mạch máu, giữ lại phần chân bì thượng bì - Mơ da cắt thành mảnh có kích thước 3x3 cm - Mơ da xử lý với dd: NaCl 1M, EDTA, dd nhược trương, ddSDS, PBS, dựa theo qui trình [25] số cải tiến từ nhóm nghiên cứu - Sau lần xử lý với dung dịch trên, mẫu mô quay ly tâm lạnh 3000 vòng/ phút, lặp lại lần, nhằm làm mẫu mô - Mẫu mô sau xử lý bảo quản theo qui trình đơng lạnh, đem đơng khơ: - 0 Bảo quản mẫu mô tủ lạnh C vòng 30 phút, -20 C vịng giờ, sau chuyển sang bảo quản nhiệt độ -80 C vịng 24 Đơng khơ mẫu chân bì áp suất 0.4mbar vịng 48 Mẫu mơ đóng gói đem khử trùng tia gamma với liều chiếu 25kGy nhiệt độ C Trung tâm nghiên cứu triển khai công nghệ xạ Với liều chiếu đảm bảo độ đảm bảo vô trùng - Bảo quản màng chân bì nhiệt độ phịng TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 1.2 Đánh giá giá thể màng chân bì sau thu nhận 1.2.1 Đánh giá cấu trúc mơ học giá thể Giá thể màng chân bì sau thu nhận mang đánh giá cấu trúc mô học phương pháp xử lý tiêu nhuộm H&E quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) Kết nhuộm H&E: Mô liên kết bắt màu từ hồng đến đỏ, khơng cịn diện tế bào giá thể sau thu nhận Quan sát hình ảnh màng chân bì da kính hiển vi điện tử quét: - Quan sát bề mặt mẫu chân bì với mức độ phóng đại khác - Quan sát cấu trúc lỗ hổng 1.2.2 Đánh giá độc tính tế bào Màng chân bì da ni mơi trường huyết có chứa TBGTM từ mỡ thỏ: - Màng chân bì da ngâm dung dịch PBS - Dùng dao cắt màng chân bì da thành mảnh hình vng có kích thước 1x1 cm, ngâm PBS - Tách TBGTM khỏi chai ni, quay ly tâm màng chân bì với dịch tế bào thu nhỏ dịch tế bào lên màng chân bì với mật độ 10 tế bào/ cm Nuôi chai nuôi tiệt trùng Bổ sung 5ml môi trường nuôi - Sử dụng mơi trường huyết bị FBS 10%, thay mơi trường ngày o Chai nuôi giữ tủ ấm 37 C, CO2 5% - Quan sát hình ảnh TBGTM, kiểm tra tình trạng nhiễm khuẩn – nấm sau ngày, ngày 2.Quy trình chuyển TBGTM lên giá thể màng chân bì 2.1 Quy trình thực - TBGTM sau cấy chuyền lần thứ nuôi đĩa giếng, mật độ tế bào phủ kín bề mặt đĩa ni thay mơi trường ni mơi trường biệt hóa sụn (StemPro™ Adipogenesis Differentiation Kit) Mơi trường biệt hóa TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com thay ngày - Chuẩn bị đĩa nuôi TBGTM môi trường biệt hóa lúc Sau ngày cảm ứng biệt hóa tạo sụn, màng chân bì đưa vào đĩa để tiến hành chuyển lớp TBGTM lên màng Lớp TBGTM bóc tách khỏi đĩa ni lực học cuộn quanh mảnh màng chân bì chuẩn bị sẵn Sau tế bào tiếp tục ni mơi trường biệt hóa sụn Quan sát hình thái cấu trúc lớp TBGTM bám dính lên màng chân bì kính hiển vi đảo ngược - Đến ngày thứ 14, tiến hành chuyển màng chân bì bên đĩa sang đĩa 2, tiến hành bóc lớp TBGTM bên đĩa cuộn quanh màng chân bì lần thứ Sau tế bào sụn tiếp tục ni mơi trường biệt hóa sụn đến ngày thứ 21 - Tấm tế bào sụn sau mang chụp SEM nhuộm mô học để đánh giá đặc điểm cấu trúc tế bào học 2.2 Đánh giá cấu trúc mô học tế bào sụn  Nhuộm mô học (H&E Trichrome) : để đánh giá cấu trúc tế bào sụn, phân bố tế bào bên tế bào  Chụp SEM: đánh giá cấu trúc bề mặt, diện bám dính tế bào bề mặt giá thể  Nhuộm Safranin-O: để đánh diện nguyên bào sụn bên tế bào TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC XÂY DỰNG MƠ HÌNH ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ TBGTM MỠ THỎ VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI Nguyên tắc thiết lập quy trình ghép thực nghiệm thỏ Quy trình thiết kế theo quy trình thực chuẩn (Standard Operation Procedure – SOP), mô tả phương pháp xây dựng mơ hình điều trị thực nghiệm ghép thỏ tế bào sụn từ kết hợp TBGTM thu nhận từ mô mỡ màng chân bì từ lớp chân bì da người Để xây dựng mơ hình điều trị thực nghiệm tổn thương sụn thỏ cần phải có TBGTM thu nhận từ mơ mỡ màng chân bì từ lớp chân bì da người thực ghép mảnh ghép vào vùng tổn thương sụn thỏ Phương pháp thực thực nghiệm – mơ tả Đối với mơ hình này, tiến hành thu nhận mơ mỡ thỏ, sau tiến hành nuôi cấy định danh TBGTM Tiếp theo tạo mảnh ghép kết hợp màng chân bì TBGTM Mảnh ghép sau ghép vào đầu xương cẳng chân thỏ Do đó, mơ hình xây dựng dựa quy trình nghiên cứu: - Thứ nhất, quy trình phân lập, nuôi cấy định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ, nhằm mục đích thu nhận nguồn tế bào ghép để tạo tế bào sụn - Thứ hai, quy trình tạo tế bào sụn từ kết hợp giá thể màng chân bì TBGTM, nhằm mục đích tạo tế bào sụn công nghệ mô để ứng dụng việc tái tạo tổn thương bề mặt sụn thỏ - Thứ ba, quy trình ghép tế bào sụn có mang tế bào tạo sụn (nguyên bào sụn) vùng đầu xương cẳng chân thỏ, nhằm đánh giá hiệu tiềm mảnh ghép lĩnh vực tái tạo tổn thương sụn Đây giai đoạn nghiên cứu bỏ qua theo tiêu chuẩn nước quốc tế mảnh ghép tiến hành thực nghiệm người phải thực nghiên cứu, đánh giá hiệu mơ hình động vật trước triển khai thực lâm sàng TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Xử lý tất thành phần mơ mỡ hóa chất vật liệu truyền nhiễm bệnh Mang găng găng vơ trùng q trình vận chuyển thao tác xử lý mẫu Xử lý mẫu tủ thao tác đạt tiêu chuẩn cho yêu cầu nuôi cấy tế bào người động vật Quy trình ghép thực nghiệm thỏ 2.1 Chuẩn bị dụng cụ               Nồi hấp khử trùng (Nuaire) Hệ thống thao tác phẫu thuật động vật Hệ thống chuồng trại chăm sóc động vật sau phẫu thuật Găng sạch, Găng vô trùng, Gạc vô trùng Bơm tiêm (Vinahankook) Kéo cong, kéo thẳng Nẹp tách Nẹp, vít phẫu thuật Mũi khoan phẫu thuật xương Dao mổ phẫu thuật Chỉ khâu phẫu thuật Cồn sát khuẩn 70 o Betadine Gentamicine 2.2 Quy trình thực 2.2.1 Tiến hành tạo tế bào sụn:  Chọn thỏ đực khoảng tháng tuổi, cân nặng từ 2,0 – 2,5 kg, nuôi điều kiện dinh dưỡng chăm sóc TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com  30 phút trước tiến hành phẫu thuật lấy mô mỡ, thỏ tiêm 0,5 ml Atropin sulfate, tiến hành cạo lông vùng da bụng thỏ, sát trùng vùng phẫu thuật betadine ®  Gây mê thỏ Zoletil 50 với liều 10 mg/kg, cố định thỏ vào bàn tiểu phẫu  Dùng dao phẫu thuật rạch da bụng, bóc tách lấy mơ mỡ vùng da Mô mỡ sau lấy đựng tuýp 50 ml, chuyển phịng thí nghiệm để thực theo quy trình thu nhận TBGTM  Khâu lại da phẫu thuật, sát trùng lại vết khâu betadine Thỏ sau chuyển chuồng chăm sóc hậu phẫu  Màng chân bì thu nhận theo quy trình cắt thành miếng hình trịn, kích cỡ khoảng 0,5 cm  TBGTM sau thu nhận từ mô mỡ nhân khối, cấy chuyền đến lần thứ (khoảng 14 ngày) chuyển lên đĩa nuôi giếng nuôi môi trường cảm ứng biệt hóa tạo sụn Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tạo sụn, lớp TBGTM chuyển lên màng chân bì chuẩn bị sẵn trước đó, đến ngày thứ 21 sau biệt hóa tiến hành ghép mảnh ghép lên thỏ 2.2.2 Tiến hành ghép tế bào sụn mơ hình thỏ  Chọn thỏ đực khoảng tháng tuổi, cân nặng từ 2,0 – 2,5 kg, nuôi điều kiện dinh dưỡng chăm sóc  Thực nhóm thí nghiệm song song nhau: o Nhóm 1: Gối trái tạo tổn thương bề mặt sụn không ghép mảnh ghép, gối phải tạo tổn thương bề mặt sụn ghép giá thể màng chân bì khơng có mang tế bào o Nhóm 2: Gối trái tạo tổn thương bề mặt sụn không ghép mảnh ghép, gối phải tạo tổn thương bề mặt sụn ghép tế bào sụn TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com  30 phút trước tiến hành phẫu thuật ghép, thỏ tiêm 0,5 ml Atropin sulfate, tiến hành cạo lông vùng đầu gối thỏ, sát trùng vùng phẫu thuật betadine ®  Gây mê thỏ Zoletil 50 với liều 0.1 ml/kg, cố định thỏ vào bàn tiểu phẫu  Sử dụng dao mổ phẫu thuật để bọc lộ phần da bám xương Bộc lộ phần đầu khớp xương đầu gối  Sử dụng mũi khoan lõi có đường kính mm khoan vào vùng đầu gối xương cẳng chân Lấy lõi xương sụn loại bỏ phần bề mặt sụn khớp, phần xương sụn đặt trở lại lỗ khoan  Đầu gối chân trái sau tạo tổn thương bề mặt sụn khâu lại lớp da Đầu gối chân phải tiến hành ghép màng chân bì khơng mang tế bào mảnh ghép tế bào sụn chuẩn bị sẵn Sau dùng phẫu thuật khâu phần mô da để cố định vị trí ghép khâu lại vết mổ  liều Sát trùng lại vết mổ Betadine, chích kháng sinh Baytril 5% với lượng 0,1 ml/kg thể trọng ngày liên tục vòng ngày để chống nhiễm trùng vết mổ chích kháng viêm glucortin 20 với liều 0,1 ml/kg thể trọng ngày liên tục vòng ngày để kháng viêm giảm đau  Q trình phẫu thuật ghép chăm sóc hậu phẫu có tư vấn giám sát bác sĩ thú y Các thỏ ghép chăm sóc nuôi dưỡng với chế độ dinh dưỡng suốt trình nghiên cứu TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... dụng mà tế bào sụn mang lại, nhóm nghiên cứu định thực đề tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu chế tạo tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ màng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp mơ hình thỏ”... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘYTẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN... tế bào khác TBGTM, tế bào gốc tạo máu tế bào tế bào gốc tế bào nội mạch, nguyên bào sợi, tế bào máu, tế bào tiềm tạo mỡ tế bào quanh mao mạch Để phân lập TBGTM khỏi tế bào khác, tế bào nuôi bề