thử nghiệm sản xuất giống cá trê vàng đa bội (clarias macrocephalus gunther)

Xác định tỷ lệ cá trê vàng đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức sốc nhiệt.. Đa bội thể nguyên: Sự tăng nguyên lần số nhiễm sắc thể đơn bội của một loài.. Đa bội thể lai: Là sự kết hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

HUỲNH TẤN HỒNG

THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT GIỐNG

CÁ TRÊ VÀNG ĐA BỘI

(Clarias macrocephalus Gunther)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts BÙI MINH TÂM

2009

Chương I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Nhóm cá trơn nói chung và cá trê nói riêng phân bố khá rộng rãi, đặc biệt

là vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới Chúng sống được trong nhiều loại hình thủy vực khác nhau kể cả môi trường giàu chất dinh dưỡng

Trong 4 loài cá trê ở nước ta hiện nay thì cá trê vàng (Clarias

macrocephalus) là loài có giá trị kinh tế nhất, do chất lượng thịt thơm ngon nên

được nhiều người ưa chuộng và thịt cá có màu vàng nghệ trông hấp dẫn hơn nên càng thu hút nhiều thực khách Do cá chậm lớn hơn so với cá giống loài khác nên

xu hướng người ta nuôi các loại cá khác trong họ cá trê nhiều hơn, chính điều này đã làm sản lượng cá trê vàng ngày càng cạn kiệt

Với thực tế đó, để khắc phục nhược điểm trên của cá trê vàng thì một số biện pháp được đặt ra như cho lai tạo giữa các loài cá trê với nhau Bên cạnh đó thì cũng có vài nghiên cứu về gây đa bội thể cá được tiến hành nhưng chưa phổ biến rộng rãi Kết quả là sản lượng cá trê tăng lên nhưng lại làm chất lượng thịt

cá giảm đi và làm cho nguy cơ con cá trê vàng bị tuyệt chủng do sự phát triển lấn

át của các loài cá khác Từ vấn đề này nên đề tài “Thử nghiệm sản xuất cá trê

vàng (Clarias macroephalus Gunther, 1864) đa bội” được thực hiện ở Trại Thực

Nghiệm – Bộ môn kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt – Khoa thủy sản – Trường Đại Học Cần Thơ là rất cần thiết

1.2 Mục tiêu của đề tài

Nhằm tìm ra được thời gian sốc nhiệt hợp lý cho tỷ lệ cá trê vàng đa bội cao

1.3 Nội dung của đề tài

Tiến hành sốc nhiệt trứng đã thụ tinh sau 15 phút ở 4oC trong 10, 20, 30 phút

So sánh các chỉ tiêu về tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ dị hình giữa cá trê vàng bình thường và cá trê vàng đa bội

So sánh tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng về chiều dài và khối lượng giữa cá sốc nhiệt và cá bình thường sau khi ương

Xác định tỷ lệ cá trê vàng đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức sốc nhiệt

Theo dõi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng oxy hòa tan,

NH3, NO2-

Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đặc điểm sinh học cá trê vàng

2.1.1 Vị trí phân loại

Cá trê vàng có tên khoa học là Clarias macrocephalus Gunther (Nguyễn

Bạch Loan, 2003) với vị trí phân loại như sau:

2.1.2 Phân bố

Cá phân bố rộng trên thế giới, đặc biệt là vùng Á nhiệt đới và nhiệt đới.Chúng có khả năng sống tốt ở vùng nước thiếu oxy và giàu chất hữu cơ.Để nhận dạng cá trê vàng với các loài cá trê khác ta dựa vào: cá trê vàng xương chẩm hình vòng cung, trê trắng xương hình chữ V, trê phi xương chẩm hình chữ M, trê đen xương chẩm tương tự như cá trê trắng, nhưng gốc của xương chẩm hơi tù hơn Cá trê vàng mấu xương chẩm có dạng hình vòng cung, chiều rộng gốc mấu xương chẩm lớn hơn 3 lần chiều cao của chính nó (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993)

ao, mực nước nông, nhiệt độ cho cá sinh sản tốt từ 28-30oC Sau khi cá sinh sản xong ta có thể nuôi vỗ tái thành thục khoảng 30 ngày thì cá có thể tham gia sinh sản trở lại

Phân biệt cá đực, cá cái:

Cá cái: Bụng to, mềm đều, lỗ sinh dục hình vành khuyên và phồng to thường có màu đỏ nhạt Lấy ngón tay vuốt nhẹ bụng cá từ trên xuống thấy

có trứng chảy ra, kích cở trứng đồng đều, căng tròn với màu sắc đặc trưng

Cá đực: Có gai sinh dục dài, hình tam giác, phía đầu gai sinh dục nhọn và hơi nhỏ, gai sinh dục màu hồng nhạt

2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá trê là loài ăn tạp thiên về động vật đáy, cá thích ăn xác động vật đang thối rữa

Cá trê có đặc tính ăn tạp, thức ăn chủ yếu là động vật Trong tự nhiên cá trê ăn côn trùng, giun ốc, tôm, cua, cá, ngoài ra trong điều kiện

ao nuôi cá trê còn có thể ăn các phụ phẩm từ trại chăn nuôi, nhà máy chế biến thủy sản, chất thải từ lò mổ (Dương Nhật Long, 2003) Khả năng sử dụng thức ăn chế biến của cá cũng rất cao (Nguyễn Văn Kiểm, 2004)

2.1.5 Điều kiện nuôi

Cá trê vàng là loài dễ nuôi, có thể sống và phát triển tốt trong môi trường

có hàm lượng hữu cơ cao Vùng nước ngọt không bị nhiễm phèn hay nhiễm phèn nhẹ, các yếu tố môi trường thích hợp cho sự phát triển của cá Nhiệt độ thích hợp

từ 26-32oC, chịu nhiệt độ thấp 15oC và trên 38-40oC pH thích hợp 6,5-7 và cũng

có thể sống ở những vùng nhiễm phèn trung bình với pH = 5,5 Oxy trên 3 ppm, đặc biệt cá có cơ quan hô hấp phụ nên có thể chịu đựng môi trường dưỡng khí thấp, trên 2 ppm là đã sống được N-NH3 0,2 - 2 ppm

2.1.6 Một số bệnh thường gặp

Trong quá trình ương nuôi cá thì có một số bệnh sau (Đào Hoàng Đẳng, 1992)

Bệnh lỡ loét:

Bệnh xuất hiện sau những cơn mưa kéo dài Cá bị xay xát do đánh bắt hay vận chuyển Môi trường nuôi quá bẩn

Triệu chứng: Trên cơ thể xuất hiện những vết loét lúc đầu nhỏ, dần dần to

ra và ăn sâu vào xương, bệnh nặng vết loét ăn sâu vào đầu, cá bỏ ăn và chết hàng loạt

Bệnh trắng da:

Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ môi trường thấp, cá bị đánh bắt, lọc, vận chuyển làm cá xay xát làm bệnh dễ dàng xâm nhập Bệnh thường xảy ra ở cá giống

Triệu chứng: Trên da cá xuất hiện vài điểm trắng lớn nhỏ khác nhau, hoặc

cả thân có màu trắng nhợt nhạt, gan có những đốm trắng nhỏ li ti, cá mất nhớt, râu quéo lại hoặc bị ăn cụt, cá treo mình ngày càng nhiều và sau đó chết hàng loạt trong thời gian ngắn

Ngoài ra còn một số bệnh khác như bệnh do nhiễm nấm thủy my, ký sinh trùng bám

2.2 Sơ lược về đa bội thể

Việc vận dụng kỷ thuật nhiễm sắc thể để sản xuất cá đa bội được tiến hành nghiên cứu từ giữa những năm 1970 (Thorgaard 1983, 1986)

2.2.1 Khái niệm đa bội thể

Đa bội thể được dùng để chỉ cá thể có thừa bộ nhiễm sắc thể Bình thường

bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh là lưỡng bội (2N) Và cá thể đa bội (3N) và tứ bội (4N) Đa bội ở cá thì có khả năng sống sót và thường bất thụ do tuyến sinh dục không phát triển (Phạm Thanh Liêm & ctv, 2006)

Đa bội thể là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể Sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể có nhiều kiểu gồm đa bội nguyên (euploidy), đa bội thể lai (alloploidy) và đa bội thể lệch (aneuploidy)

Đa bội thể nguyên: Sự tăng nguyên lần số nhiễm sắc thể đơn bội của một loài Các dạng này gồm thể đơn bội (monoploid), thể đa bội (triploid) và thể tứ bội (tetraploidy)

Đa bội thể lai: Là sự kết hợp của 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 loài khác nhau cùng đứng chung trong một tế bào

Đa bội thể lệch: Là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể của từng cặp (Phạm Thành Hổ, 2000)

2.2.2 Đặc điểm của cá thể đa bội

Theo Phạm Thanh Liêm & ctv (2006), thì cá đa bội thường tăng trưởng nhanh hơn so với cá lưỡng bội bình thường, sự gia tăng này có được là do có thể

là kết quả của việc tuyến sinh dục không phát triển, tốc độ tăng trưởng của các loài cá thường chậm lại khi chúng thành thục sinh dục hoặc là do sự gia tăng kích thước tế bào

2.2.3 Thuận lợi của việc nuôi cá đa bội

Tăng trưởng nhanh, gia tăng sản lượng, chất lượng thịt tăng Sự bất thụ là một tính trạng mong muốn đạt được, đồng thời ngăn cản sự tạp lai trở lại với loài

bố mẹ Hạn chế được quá trình xác định các loài ngoại nhập có thể nuôi được hay không, cũng như hạn chế sự phân bố của chúng ở các vùng địa lý khác nhau Nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn và thường áp dụng cho những loài lớn chậm (Jeff C Dillon, 1988)

2.2.4 Nguyên lý tạo ra cá thể đa bội

Phương pháp gây đa bội dựa trên nguyên lý kích thích mẫu sinh nhân tạo Tiến hành thụ tinh trứng bình thường, rồi xử lý trứng để lưỡng bội hóa bộ nhiễm sắc thể cái ở thời điểm giảm phân II, kết quả là hình thành phôi đa bội Ngoài ra,

đa bội thể còn được tạo ra bằng cách lai giữa thể tứ bội (4n) và thể lưỡng bội (2n) (Nguyễn Tường Anh, 1999)

Đa bội có thể tạo ra bằng một quá trình thụ tinh bình thường, sau đó là quá trình giữ lại thể cực thứ 2 Nếu con cái là đồng hợp XX , tất cả các thế hệ con sẽ nhận 2 nhiễm sắc thể X từ mẹ và hoặc là nhiễm sắc thể X hoặc Y từ bố Khi đó XXX sẽ là con cái, XXY là con đực Nếu con đực đồng hợp ZZ, thế hệ

con đa bội sẽ có 3 kiểu gen WWZ, WZZ và ZZZ, nhưng giới tính thì không xác định

Thể cực thứ 2 có thể giử lại bằng cách sốc nhiệt (lạnh hoặc nóng), áp suất thủy tỉnh, hoặc sốc hóa chất trong thời gian ngắn sau khi thụ tinh Thời gian gây sốc khác nhau tùy loài

Gây sốc bằng áp suất thủy tỉnh thường có tỷ lệ sống, và tỷ lệ đa bội cao hơn so với sốc nhiệt

2.3 Các phương pháp gây đa bội

Theo Phan Cự Nhân và ctv (2003), thì hiện nay người ta đã sử dụng 7

phương pháp chính để gây đa bội thể ở thực vật và động vật (thực vật là chủ yếu)

2.3.1 Phương pháp ly tâm

Người ta đặt cơ thể hoặc cơ quan có tế bào phân chia vào ly tâm, để ngăn cản sự hình thành sợi thoi vô sắc, hoặc ngăn cản các nhiễm sắc thể di chuyển về các cực của tế bào

2.3.2 Phương pháp sốc nhiệt

Nhiệt độ tăng hoặc giảm dần trong giới hạn ít ảnh hưởng tới tần số đột biến Sốc nhiệt hoặc làm thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn mức trung bình đột ngột có hiệu quả gây đột biến

Nguyên nhân do mỗi cơ thể sinh vật có cơ chế nội cân bằng, giữ cho hoạt động sinh lý của tế bào không bị thay đổi khi nhiệt độ thay đổi Khi sốc nhiệt, khi nhiệt độ tăng hay giảm một cách bất bình thường thì cơ chế này bị phá vỡ, gây chấn thương bộ máy di truyền của tế bào Và cản trở sự dịch chuyển của các nhiễm sắc thể từ mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc và các cực của tế bào tạo nên đột biến

2.3.3 Phương pháp gây chấn thương

Phương pháp này hiệu quả nhất đối với cây họ cà Ở cây họ cà, chổ chấn thương do cắt hoặc ghép dễ hình thành mô sẹo Từ mô sẹo, từ nách lá cắt ngang

2.3.4 Phương pháp đa phôi

Sau khi thụ tinh, một số phôi đa bội có thể hình thành và từ đó có thể hình thành thể đa bội

2.3.5 Phương pháp phóng xạ

Khi tế bào sắp hoặc đang phân chia tiến hành chiếu xạ bằng bức xạ ion hóa sẽ ngăn cản hoặc làm đứt sợi thoi vô sắc Nhiễm sắc thể ở lại mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo nên tế bào đa bội

2.3.6 Phương pháp xử lý bằng các tác nhân hóa học

Một số chất như Acenafen, Monoclobenzen, Paradiclorbenzen,… có thể ngăn cản sự hình thành thoi vô sắc, gây đứt sợi thoi vô sắc hoặc cản trở sự hình thành màng ngăn trong tế bào khi đang phân cắt Kết quả tạo ra tế bào nhiều nhân, có số lượng nhiễm sắc thể tăng gấp bội Nguyên nhân, do các tác nhân gây đột biến có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và màng nhân, đồng thời gây thay đổi trạng thái của DNA và nhiễm sắc thể (Khuất Hữu Thanh, 2005)

2.3.7 Xử lý Colchicine

Đây là phương pháp cho hiệu quả cao nhất và đang được áp dụng phổ biến hiện nay Colchicine có công thức hóa học là C22H25NO6, là một loại kiềm thực vật, có độc tính cao được chiết xuất từ cây Colchicum autumnale mọc ở Địa Trung Hải, dễ tan trong nước, rượu và benzen Colchicine ngăn cản nhiễm sắc thể di chuyển từ mặt phẳng xích đạo về 2 cực của tế bào, làm tăng gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào Người ta còn sử dụng Colchicine ở nồng độ 0,1-0,2% để xử lý tế bào động vật nuôi cấy

2.4 Sơ lược về hồng cầu

2.4.1 Hồng cầu

Hồng cầu là một loại huyết cầu có số lượng nhiều nhất trong các tế bào máu Huyết cầu ở các tế bào trưởng thành phần lớn hình bầu dục Hồng cầu cá có nhân, hai bên lồi ra Do có nhân nên hồng cầu cá có mức độ tiêu hao oxy lớn

(Đỗ Thị Thanh Hương & ctv, 2000)

Kích thước: Biến động lớn tùy theo loại cá, to nhất là cá sụn, cá miệng tròn rồi đến cá xương Kích cở hồng cầu càng nhỏ thì số lượng hồng cầu trên một đơn vị thể tích càng nhiều, và mức độ tiến hóa của loài càng cao

Kích thước hồng cầu được biểu thị là a*b, đơn vị tính µm Trong đó, a: là đường kính lớn, b: đường kính nhỏ

2.4.2 Số lượng hồng cầu

Trong điều kiện bình thường thì số lượng hồng cầu của mỗi loài cá là ổn định, nó phản ánh tập tính sống của cá, cá sống tầng mặt thì có số lượng hồng cầu thấp do có đầy đủ oxy và càng xuống sâu thì số lượng hồng cầu càng nhiều (Đỗ Thị Thanh Hương & ctv, 2000)

2.4.3 Chức năng của hồng cầu

Hồng cầu là tế bào chuyên biệt có chức năng là vận chuyển oxy và CO2 Tham gia duy trì thành phần các ion của máu, điều hòa pH máu

2.5 Phương pháp xác định thể đa bội

Theo Đặng Hữu Lanh và ctv (1999), thì việc xác định thể đa bội có những phương pháp sau:

Những nghiên cứu cho thấy kích thước của nhân và tế bào là phương tiện đáng tin cậy để phân biệt thể đa bội và lưỡng bội Loại tế bào sử dụng phổ biến

là tế bào hồng cầu Việc xác định thể đa bội bằng tế bào hồng cầu thực sự thuận lợi với người nghiên cứu

Phương pháp đơn giản là nhuộm tiểu hạch (nucleoli), số lượng của chúng

tỷ lệ thuận phản ánh số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào

Phương pháp đơn giản hơn là so sánh giải phẩu hình thái giữa con lai đa bội và bố mẹ lưỡng bội bằng cách đếm số lượng sắc tố ấu trùng

Một cách trực tiếp là kiểm tra số lượng nhiễm sắc thể Phương pháp này chính xác, nhưng gặp khó khăn trong chuẩn bị tiêu bản

Ngoài ra, có thể dựa vào hàm lượng DNA, tuy phức tạp trong ứng dụng

2.6 Sơ lược về đa bội thể ở cá

Đa bội được thực hiện thành công ở cá bằng việc sử dụng hóa chất như colchicine (Smith and Leoine, 1979), cytochalasin B (Refstie et al, 1977), áp suất (Benfey and Sutterlin 1984b; Chourrout 1984), sốc lạnh (Swarup 1959a; Purdom 1972; Gervai et al 1980; Meriwether 1980; Wolters et al 1981a) và sốc nhiệt (Lincoln and Scott 1983; Scheerer and Thorgaard 1983)

Theo Wolter et al (1984) đã nghiên cứu thành công phương pháp cho

sinh sản nhân tạo cá nheo đa bội đạt 100% , bằng cách sốc nhiệt lạnh sau khi trứng đã thụ tinh trong 5 phút ở 5oC trong 1 giờ và tỷ lệ nở đạt 79%

Ueno Koichi (1984), tiến hành nghiên cứu đa bội thể cá chép bằng cách sốc nhiệt ở 0-0,3oC sau 5 và 10 phút thụ tinh trong 30 phút và 60 phút Kết quả là

ở thời điểm sau thụ tinh 5 phút và sốc trong 30 phút cho kết quả tốt nhất

Tại Thailand, Uthairat Na-Nakorn (1995) tiến hành so sánh sốc nhiệt cá trê vàng ở 41-42oC trong 1 phút và sốc lạnh ở 7oC trong 14 phút Kết quả cho thấy tiến hành sốc lạnh ở 7oC cho kết quả tốt nhất Và nhiệt độ tốt nhất để sốc nóng trứng đã thụ tinh là 42oC (U Na-Nakorn et al, 1993)

Linhart et al (1991), thì các loài cá vùng nước ấm nói chung và cá trê

vàng nói riêng thì sốc lạnh thì đạt hiệu quả cao về tăng trưởng và tỷ lệ đa bội cũng cao

Ngoài ra thì việc thực hiện đa bội cá trê vàng được thực hiện, với kết quả khả quan cho tỷ lệ sinh trưởng nhanh và thịt có chất lượng cao (Arlo W Fast, 1998)

2.6.2 Việt Nam

Ở việt nam thì cá trê vàng đa bội được tiến hành nghiên cứu trong 2 năm

1997 và 1998 ở Chi nhánh phía nam trung tâm nhiệt đới Việt Nga và viện Nghiên

cứu nuôi trồng thủy sản 2 (Nga và ctv., 1998)

Chương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ trong phòng thí nghiệm: Cân 2 số lẻ, kính hiển vi, thước đo cá, đĩa

pêtri, lame và lamel, cối nghiền thuốc và ống kim tiêm

Dụng cụ kiểm tra môi trường: Máy đo pH, bộ test kiểm tra các yếu tố (NO2-,

NO3-, NH4+/NH3, Oxy hòa tan)

Dụng cụ kiểm tra đa bội: Kính hiển vi, lame và lamel, buồng đếm hồng cầu, cốc thủy tinh

Kích dục tố: Não thùy cá chép, HCG (Human chorionic gonadotropin) Hóa chất pha dung dịch Natt-Herrick

NaCl: 3,88g

Na2SO4: 2,50g

Na2HPO4:12H2O: 2,91g

KH2PO4: 0,25g Formalin (37%): 7,50 mL Methyl Violet 2B: 0,10g Nước cất: 1000 mL

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện trong khoảng 3 tháng

lạnh trứng đã thụ tinh sau 15 phút ở 4oC trong 10 phút (NTI), 20 phút (NTII) và 30 phút (NTIII)

Tiến hành sốc nhiệt trứng sau thụ tinh 15 phút

Chuẩn bị:

Cá bố mẹ được thu mua từ chợ 12 cặp

Tiêu chuẩn cá bố mẹ:

Cá ít hay không bị xay xát, khỏe mạnh

Con đực thon dài, gai sinh dục dài và hơi ửng hồng

Con cái bụng to, mềm đều, lổ sinh dục hơi xung huyết Khi để nhẹ xuống đất thì thấy rỏ 2 buồng trứng

Cá mua xong được vận chuyển nhanh về trại và trữ trong thau lớn, thêm nước vào qua khỏi phần lưng cá và được đậy kín

Hình 1: Cá trê vàng đực (M) và cá trê vàng cái (F)

Kích thích sinh sản nhân tạo

Cá cái được tiêm 2 liều: Liều sơ bộ 4 não thùy/kg và liều quyết định 4000

UI HCG/kg, liều quyết định sau liều sơ bộ là 8h

Cá đực liều bằng ½ cá cái (2000 UI HCG/kg) và được chích cùng thời điểm với liều quyết định

Vị trí tiêm: Tiêm ở cơ vi lưng cách đầu 2-3 cm, mỗi con tiêm 0,5 mL thuốc

F

M

Vuốt trứng, thụ tinh và sốc nhiệt:

Trước khi vuốt trứng cần chuẩn bị sẵn thau để ấp trứng sau khi sốc nhiệt và

có gắn sục khí

Sau khi chích liều quyết định khỏang 14h là cá bắt đầu rụng trứng, chờ khoảng 30 phút sau thì ta lựa chọn ra những con cái khi nâng cá lên (phần đầu hướng lên) và dùng tay ấn nhẹ vào bụng cá thấy trứng chảy ra là có thể vuốt được, những con còn lại sau khi vuốt lần đầu xong thì vuốt các con còn lại

Trứng cá tốt khi trứng được vuốt nhẹ nhàng và chảy ra thành dòng và không

Hình 2: Tinh sào cá sau khi mổ cá đực (A) và cá đực sau khi mổ (B)

Cá cái được lấy ra khỏi nước và cho vào một thao khác không có nước, dùng một khăn khô để bắt cá, thao tác phải nhẹ nhàng và tiến hành vuốt trứng cá Khi vuốt xong thì thụ tinh cho trứng

Tinh sào cắt nhỏ ra, và nghiền mịn, sau đó rắc vào trứng và dùng lông gà quậy đều, tiếp theo cho một ít dung dịch muối urea vào và quậy nhanh tay hơn Tiếp theo trứng được rắc lên vĩ ấp trứng để chờ sốc nhiệt

3.2.4 Ương cá từ bột lên giống

Bể ương: Gồm có 4 bể có thể tích 2,5 m3 (Bể được vệ sinh trước khi sử

dụng)

Hình 5: Hệ thống bể ương Khi ấp khoảng 12h và quan sát phôi ta thấy phôi nằm ở giai đoạn cuối phôi

vị thì tính tỷ lệ thụ tinh cho từng nghiệm thức, sau 26h tính tỷ lệ nở

Trứng sẽ nở sau khi ấp khoảng 24-26h, thu cá bột ở từng nghiệm thức sang thau chứa nước khác sạch hơn nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cá bột

3.2.5 Bố trí cá bột

Khi cá nở được 1 ngày thì ta bố trí cá bột vào bể ương được chuẩn bị sẵn, mật độ bố trí ban đầu 1300 cá bột/bể Cá được bố trí vào sáng sớm

3.2.6 Cho ăn và chăm sóc

Trong 2 ngày đầu cho ăn trứng nước với mật độ vừa phải (bổ sung thêm trứng nước nếu cần) Những ngày còn lại cho ăn trùng chỉ, mỗi ngày cho cá ăn 4 lần, và thả thêm giá thể (chùm dây nilon) vào bể làm nơi trú ẩn cho cá vào ban ngày Sau khi ương được 25 ngày thì bắt đầu tập cho cá ăn thức ăn chế biến với hàm lượng đạm 30%

Trong quá trình ương cơ bản không thay nước, khi thấy đáy bể dơ thì tiến hành syphon và cấp thêm nước vào

3.2.7 Các chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi các chỉ tiêu môi trường, phương pháp phân tích được thể hiện ở Bảng 1

Bảng 1: Chu kỳ và phép phân tích các yếu tố môi trường

và chiều dài ban đầu, xác định được tốc độ tăng trưởng theo thời gian

Áp dụng các công thức sau:

Trong đó:

Wt1, Lt1: Khối lượng và chiều dài cá tại thời điểm t1

Wt2, Lt2: Khối lượng và chiều dài cá tại thời điểm t2

Tốc độ tăng trưởng chiều dài tuyệt đối (mm/ngày) = Lt2-Lt1

t2-t1

3.2.8 Xác định tỷ lệ đa bội

Liên hệ với sự gia tăng mức độ đa bội của sinh vật là sự gia cân đối của kích thước tế bào máu (Swarup (1959b); Purdom (1972), về số lượng nhiễm sắc thể và DNA, tất cả các đặc điểm này thường được sử dụng để phân biệt cơ thể cá đa bội hay lưỡng bội Thể tích nhân hồng cầu được dùng để đánh giá lên mức độ đa bội ở

cá (Allen and Stanley (1978, 1979); Thorgaard and Gall (1979); Wolters et al

(1982b); Beck and Biggers, (1983) Bên cạnh đó thì mật độ tế bào máu cũng được

sử dụng để nhận dạng cá thể đa bội (Johnstone, 1985).Trong nghiên cứu ở đây, ta dựa vào kích cỡ và mật độ tế bào hồng cầu để xác định tỷ lệ cá thể đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức sốc nhiệt

Phương pháp kiểm tra đa bội

Do cá thể đa bội lớn nhanh hơn cá thể lưỡng bội, nên một cách đơn giản là so sánh tốc độ tăng trưởng giữa cá thể lưỡng bội và cá thể đa bội

từ đó ta có thể xác định được tỷ lệ đa bội xuất hiện trong từng nghiệm thức sốc nhiệt (Thorgaard, 1983)

Nhuộm tế bào máu bằng dung dịch Natt & Herrick , để quan sát và

đo kích thước tế bào hồng cầu cá Dựa vào sự khác biệt về kích thước và số lượng của tế bào hồng cầu trong mẩu quan sát và xác định được tỷ lệ cá thể

đa bội xuất hiện trong các nghiệm thức có sốc nhiệt (Purdom, 1972)

Phương pháp thực hiện

Pha dung dịch Natt & Herrick gồm NaCl (3,88g), Na2SO4 (2,5g),

Na2HPO4.12H2O (2,91g), KH2PO4 (0,25g), Meth yl violet 2B (0,1g), Formalin solution (7,5mL)

Tất cả các hóa chất trên được cân bằng cân 2 số lẻ và cho vào bình tam giác thủy tinh 1L, sau đó cho vào 1L nước cất, lắc đều để yên trong bóng tối Sau 24h lấy ra lọc qua lọc giấy có mắc 125 µm, bảo quản ở 6oC

và được che tối trong túi n ylon đen Trước khi tiến hành lấy mẫu máu cá, dùng bơm tiêm 1mL lấy 1990 µL dung dịch thuốc nhuộm cho vào lọ thủy tinh (3mL) và lấy 10 µL máu cá cho vào, vị trí lấy máu là nằm ở tỉnh mạch đuôi của cá Mỗi nghiệm thức lấy 30 con cá, khi lấy máu cá cho vào lọ chứa thuốc nhuộm lắc đều, trên nắp mỗi lọ đựng mẫu đều được đánh số thứ

tự phân biệt cho từng nghiệm thức Mỗi cá thể khi lấy máu đều được cân,

đo chiều dài

Hình 6: Chuẩn bị mẫu thuốc (A) và lấy máu cá (B)

Nghiên cứu kích thước tế bào hồng cầu cá bằng cách đo đường kính lớn và đường kính nhỏ của hồng cầu Lấy 1 giọt mẫu máu cho lên lame, đậy lamel lại sau cho không có bọt khí, quan sát và đo bằng kính hiển vi có trắc vi thị kính ở độ phóng đại 40X Sau đó ta đặt trắc vi vật kính vào đo để xác định chiều dài mỗi vạch của trắc vi vật kính, từ đó xác định được chiều dài của đường kính lớn và đường kính nhỏ của tế bào hồng cầu Tương tự cho việc xác định số lượng tế bào hồng cầu cá có trong một đơn vị thể tích, cho một ít mẫu máu lên vùng đếm của buồng đếm hồng cầu và quan sát ở vật kính 40X, ta đếm số lượng tế bào hồng cầu có được trong 4 ô ở 4 gốc

và một ô ở trung tâm

Công thức tính mật độ hồng cầu

H=(A*200)/80*0,00025 mm3 hay H=A*104 tế bào/mL

Với A: tổng số hồng cầu đếm được trong 5 ô

Công thức tính diện tích hồng cầu

S=a*b*/ 4

a: đường kính lớn (µm)

b: đường kính nhỏ (µm)

Công thức tính tỷ lệ cá đa bội

3.3 Xử lý số liệu

Số liệu về kích thích sinh sản, biến động môi trường và đa bội được

xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và SPSS để kiểm định sự khác biệt về tăng trưởng và tỷ lệ sống giữa cá trê vàng đa bội (3n) và cá trê vàng bình thường (2n)

Tỷ lệ đa bội (%) = Số cá thể đa bội

Số cá thể quan sát * 100

Chương IV KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 4.1 Các yếu tố môi trường

4.1.1 Biến động của nhiệt độ, pH và oxy hòa tan

Nhiệt độ (°C) môi trường nước

Bảng 2: Biến động nhiệt độ sáng chiều ở các nghiệm thức

Nhiệt độ sáng (OC) 27,8±1,2 27,6±1,3 27,5±1,3 27,8±1,2 Nhiệt độ chiều (OC) 28,8±1,2 28,5±1,1 28,4±1,1 28,8±1,2 Biến động của nhiệt độ không có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức Trung bình nhiệt độ sáng (27,5 -27,8°C) và nhiệt độ chiều (28,4-28,8°C) có khoảng biến động không vượt quá 1°C Trung bình nhiệt độ của NTĐC và NTIII tương đối cao hơn NTI và NTII (Bảng 2)

Sự chênh lệch nhiệt độ sáng và chiều không lớn lắm và nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của các đối tượng thủy sản Các đối tượng thủy sản nói chung sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-30oC (Boyd, 1998)

và nhiệt độ tối ưu từ 26-29oC nhưng không thay đổi quá 5oC trong ngày

(Boyd et al., 2002)

pH môi trường nước

Bảng 3 Biến động pH theo thời gian

Hình 7: Biến động pH theo thời gian

Từ kết quả trên cho thấy pH biến động không lớn trong suốt quá trình thí nghiệm từ (7,5-8,4) (Hình 7) pH là một trong những yếu tố môi trường ảnh hưởng đến đời sống thủy sinh vật, pH quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến quá trình trao thẩm thấu của màng tế bào, làm cho quá trình trao đổi muối giữa cơ thể sinh vật với môi trường nước bị rối loạn (Trương

Quốc Phú, 2006) Theo Chanratchakool et al (1995) cho rằng pH của ao

rất quan trọng ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến cá nuôi và dao động không quá 0,5 đơn vị trong ngày pH thích hợp cho cá nuôi là 7-9, tối ưu 7,5-8,5 ( Boyd, 2002) Theo Boyd (1995) thì pH thích hợp cho cá phát triển

từ 7,5-8,5

Oxy hòa tan

Bảng 4: Biến động oxy theo thời gian

tục và đều nhau nên hàm lượng oxy ở các nghiệm thức là không không khác biệt (Bảng 4) Nhìn chung hàm lượng oxy hòa tan trong 4 nghiệm

thức dao động từ 4,5-5,75 mg/L trong suốt quá trình thí nghiệm

0 1 2 3 4 5 6 7

NTDC NTI NTII NTIII

Hình 8: Biến động oxy theo thời gian

Từ Hình 8, oxy ở các nghiệm thức thấp nhất là 4mg/L và cao nhất là 6mg/L Hàm lượng oxy trung bình của các nghiệm thức 4,5mg/L-5,754mg/L Oxy thích hợp cho cá là 2-5 ml/L, lý tưởng >5mg/L (Trương Quốc Phú , 2006)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Hình 9: Biến động NH4+ theo thời gian Hàm lượng NH4+ có sự gia tăng trong quá trình nuôi, và cao nhất là sau 30 ngày nuôi, nguyên nhân là do thức ăn tích tụ nhiều, tuy nhiên vào cuối thí nghiệm thì có xu hướng giảm dần do quá trình thay nước (Hình 9) Theo Boyd (1998) và Chanratchakool (2003) thì hàm lượng NH4+ thích hợp cho cá là 0,2-2,0 mg/l Từ nhận định này cho thấy hàm lượng NH4+ trong bể nuôi nằm trong khoảng an toàn cho cá

Hàm lượng NO2

-Hàm lượng NO2- trong các bể thí nghiệm dao động từ 0,68-1,75mg/L, và

có xu hướng tăng cao vào cuối thí nghiệm, do vào cuối thí nghiệm lượng thức ăn tăng cao và chất thải tích tụ nhiều (Bảng 6)

Bảng 6: Biến động NO2- theo thời gian

Hình 10: Biến động NO2- theo thời gian Hàm lượng NO2

dễ bị loại thải ra môi trường nước do quạt nước và trong môi trường giàu oxy, NO2- rất dễ bị oxy hóa thành dạng NO3- (Vũ Thế Trụ, 2003) Theo Chen và Chin (1998) hàm lượng NO2- an toàn cho cá là 4,5 mg/L, hàm lượng NO2- an toàn cho cá là 3-4 mg/L (Lê Văn Cát và ctv, 2006) Từ nhận định này cho thấy hàm lượng NO2- trong bể nuôi nằm trong khoảng an toàn cho

Hình 11: Biến động NO3- theo thời gian Hàm lượng NO3- trong các bể thí nghiệm, nhìn chung dao động từ 5,75-6,25 mg/L (Bảng 7) và theo Boyd (1998) thì hàm lượng NO3- thích hợp cho ao nuôi cá từ 0,2-10 mg/L và theo Nguyễn Văn Bé (1994) hàm lượng NO3- thích hợp cho các ao nuôi thủy sản 2-3 mg/L Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng

NO3- trong bể nuôi đều nằm trong khoảng thích hợp

10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

NTDC NTI NTII NTIII

Hình 12: Tỷ lệ thụ tinh giữa các nghiệm thức

Hình 12 cho thấy tỷ lệ thụ tinh của trứng trung bình ở nghiệm thức đối chứng (NTDC) là cao nhất (62%), nguyên nhân là do trứng sau khi thụ tinh được phát triển trong môi trường bình thường nên có tỷ lệ thụ tinh cao Còn ở nghiệm thức sốc lạnh ở 4oC trong 30 phút (NTIII) có tỷ lệ thụ tinh là thấp nhất (2,7%), tỷ

lệ thụ tinh ở nghiệm thức NTI (11,3%) và NTII (11,7%) cũng thấp hơn so với nghiệm thức NTDC Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh ở các nghiệm thức sốc nhiệt thấp

là do trứng sau khi thụ tinh bị tác động mạnh bởi sự chênh lệch nhiệt độ, làm cho quá trình phát triển phôi bị ngừng trệ hay phôi bị chết trong quá trình ấp trứng

Tỷ lệ thụ tinh ở các nghiệm thức sốc nhiệt rất thấp và thấp nhất là NTIII,

do trứng sau khi thụ tinh bị sốc nhiệt độ trong khoảng thời gian dài làm cho quá trình phát triển phôi không được bình thường So với các nghiệm thức sốc nhiệt, thì có sự khác biệt thống kê giữa nghiệm thức NTDC với các nghiệm thức còn lại

ở mức ý nghĩa (p<0,05) (Bảng 8)

Tỷ lệ nở

Kết quả (Bảng 8) trong 4 nghiệm thức cho thấy, tỷ lệ nở ở nghiệm thức NTDC là cao nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa (p<0,05) giữa nghiệm thức NTDC so với các nghiệm thức còn lại (NTI, NTII, NTIII)

Tỷ lệ nở

54.7

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0

NTDC NTI NTII NTIII

NTDC NTI NTII NTIII