Nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá basa

Collagen của da cá basa được tách chiết bằng phương pháp hóa học thông qua các giai đoạn khử protein phi collagen, lipit bằng dung dịch NaOH loãng, khử khoáng bằng citric acid loãng, khử màu, mùi bằng dung dịch H2O2 loãng. Cuối cùng, tiến hành chiết collagen bằng acetic acid và làm sạch bằng phương pháp thẩm tích với dung dịch Na2HPO4.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ BASA TRƯƠNG THỊ ĐƠN*, NGUYỄN THỊ THU HÀ HỒ THỊ MỸ DIỆU, BẠCH THỊ THU HIỀN, ĐỖ MAI NGUYỄN Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế * Email: hyekyo11@gmail.com Tóm tắt: Collagen da cá basa tách chiết phương pháp hóa học thơng qua giai đoạn khử protein phi collagen, lipit dung dịch NaOH lỗng, khử khống citric acid lỗng, khử màu, mùi dung dịch H2O2 loãng Cuối cùng, tiến hành chiết collagen acetic acid làm phương pháp thẩm tích với dung dịch Na2HPO4 Collagen thu có độ tinh khiết cao, có khối lượng phân tử thuộc loại collagen loại I, có cấu trúc xoắn, có thành phần nhóm chức, liên kết hóa học đặc trưng xác định phù hợp tương ứng Dung dịch collagen có hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn E coli vi khuẩn Samonella sp Từ khóa: Collagen, tách chiết collagen, da cá basa ĐẶT VẤN ĐỀ Cơng nghệ hóa dược, hóa mỹ phẩm ngày phát triển, đáp ứng nhu cầu sức khỏe sắc đẹp người cơng nghiệp hóa, đại hóa nước ta Một ưa chuộng hàng đầu sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm có nguồn gốc tự nhiên Theo đó, nhiều công thức mỹ phẩm với collagen thành phần lợi ích đáng kể mà collagen đem lại khả giữ ẩm làm đẹp da tự nhiên Ngành cơng nghiệp liên tục tìm kiếm sản phẩm sáng tạo, bền vững thực hiệu Vì nghiên cứu nguồn collagen quan tâm xem giải pháp thay đầy hứa hẹn Collagen cá gồm peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, dễ tiêu hóa, hấp thu phân tán thể người Nghiên cứu công bố vào năm 2015 tạp chí Open Nutraceuticals Journal cho thấy có nhiều thử nghiệm lâm sàng thực nhằm chứng minh hiệu lợi ích collagen đặc tính da, bao gồm hydrat hóa, tăng độ co dãn giảm nếp nhăn Các nhà nghiên cứu kết luận collagen cá vũ khí thơng minh chiến chống lại dấu hiệu lão hóa không mong muốn Ở Việt Nam năm gần nghề nuôi trồng, khai thác chế biến thủy sản phát triển đặc biệt tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Hai đối tượng thủy sản nước chủ yếu cá tra cá basa Việt Nam mở rộng thị trường xuất sang 24 quốc gia mới, nâng tổng số thị trường nhập cá tra, cá basa Việt Nam lên 110 quốc gia vùng lãnh thổ Cá tra basa đa phần xuất hình thức fillet, mà phế liệu thải trình chế biến da cá, xương,… nhiều (chiếm 50 - 60%) Các phế phẩm công nghiệp chủ yếu sử dụng để làm phân bón làm thức ăn cho gia súc nên hiệu kinh tế thấp Collagen protein thành phần thể, đảm nhận nhiều nhiều chức thể người ứng dụng rộng rãi ngành y dược, mỹ phẩm, thực phẩm Chẳng hạn, việc nghiên cứu ứng dụng collagen vào mỹ phẩm tiến hành Đức, tách chiết collagen từ xương da trâu, bò, lợn vào năm 1930 Tuy nhiên đến 1990 nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Gdansk Ba Lan tách chiết collagen từ da cá gây tiếng vang tồn cầu Từ thành cơng này, năm gần nhiều quốc gia Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ba Lan đầu tư vào việc tách chiết collagen để làm nguyên liệu sản xuất da [8] 178 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 Hiện nước ta có số nghiên cứu để dùng da cá làm nguyên liệu sản xuất collagen da cá tra cá basa chứa hàm lượng collagen cao, chất lượng khơng thua loại ngun liệu khác Chúng ta có nguồn phế liệu da cá phong phú giàu collagen Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá basa sau loại hoàn toàn phần protein phi collagen màu, mùi, chất béo nhiều phương pháp nhằm thu hàm lượng collagen cao có chất lượng tốt nội dung nghiên cứu cần quan tâm Mục đích nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận collagen hiệu suất cao từ da cá basa phương pháp hoá học Nghiên cứu đề xuất quy trình tách chiết collagen xác định số tính chất đặc trưng sản phẩm collagen THỰC NGHIỆM 2.1 Chuẩn bị nguyên liệu Da cá rửa nước để loại bỏ bớt mỡ, thịt vụn cịn bám da Sau cắt da cá thành nhiều mảnh nhỏ diện tích khoảng 2x2 cm Da cá bảo quản đông lạnh nhiệt độ khoảng – 20 °C sử dụng làm thí nghiệm Trước đem sử dụng, tiến hành rã đông, rửa nước Cân 20 gam da cá cho mẫu thí nghiệm 2.2 Tách chiết collagen từ da cá basa Collagen da cá basa tách chiết phương pháp hóa học với dung mơi chiết acetic acid theo quy trình tách chiết xây dựng (Hình 1) Da cá basa Khử béo Khử khống Tẩy màu, tẩy mùi Chiết collagen Tinh collagen Collagen Hình Quy trình tách chiết collagen từ da cá basa Trước tiên da cá basa nguyên liệu xử lý dung dịch kiềm loãng NaOH 0,1 M để loại bỏ tạp chất phi collagen 24 Các khống chất canxi có da loại bỏ cách ngâm tiếp mẫu dung dịch axit citric 0,05 M nhiệt độ phòng 24 179 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 Hai trình lặp lại lần nhiệt độ phòng để việc tách tạp chất hiệu mà giữ toàn vẹn cấu trúc collagen tự nhiên Mẫu da thu sau xử lý dung dịch tẩy trắng 200 ml H2O2 10% nhiệt độ phòng để loại bỏ sắc tố màu da Mẫu thu sau ngâm butanol nhiệt độ phòng 24 để hòa tan chất béo lại Tiếp theo mẫu rửa etanol sau ngâm 500 ml dung dịch citric acid 0,05 M nhiệt độ phòng để khử tiếp khống da, sau rửa nhiều lần nước cất thu mẫu da trắng, mềm cịn giữ hình dạng ban đầu mẫu nguyên liệu Quá trình chiết collagen thực với acetic acid 0,5 M nhiệt độ phịng 48 Cơng đoạn làm thực phương pháp thẩm tích với dung mơi Na2HPO4 0,02 M KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sản phẩm collagen chiết xuất từ da cá basa Collagen chiết từ da cá basa gồm sản phẩm: Collagen (dạng dung dịch): không màu, suốt, dạng gel (Hình 2b) Collagen đơng khơ (dạng rắn): màu trắng, xốp dạng sợi sợi bơng tự nhiên (Hình 2c) (a) (b) (c) Hình (a) Da cá ban đầu (b) Dung dịch collagen (c) Sản phẩm collagen sau đông khô 3.2 Kết phân tích số tính chất đặc trưng collagen 3.2.1 Quang phổ phân tử UV-Vis Độ suốt quang học dung dịch collagen xác định quang phổ UVVis (Hình 3) Kết cho thấy dung dịch collagen chiết xuất có độ tinh khiết cao, phù hợp với nghiên cứu gần cấu trúc nano collagen [3] Quang phổ UV-Vis collagen chiết từ da cá basa có độ truyền ∼80% 800 nm ∼76% 400 nm Hình Quang phổ UV-Vis collagen 180 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 3.2.2 Phổ điện di SDS-PAGE Kỹ thuật điện di SDS-PAGE phân tách đại phân tử nucleic acid protein theo trọng lượng kích thước phân tử chúng Theo kết phân tích điện di, người ta xác định khối lượng phân tử collagen loại I vào khoảng 200-300 kDa cao so với gelatin (dưới 200-300kDa) cao nhiều so với sản phẩm thủy phân collagen (dưới 50kDa) Kết điện di mẫu collagen chiết xuất từ da cá basa thể hình bên với thang chuẩn từ 10kDa đến 130kDa từ Bioline Kết cho thấy: Tất mẫu cho kết có băng protein xuất với mức độ đậm nhạt khác Trong mẫu sau thẩm tích 48 thể rõ Điều giải thích SDS tác nhân làm biến tính protein tích điện âm cho phân tử protein Anion SDS kết hợp với phân tử protein dây hữu kỵ nước phá vỡ cấu trúc ba chiều protein làm chúng duỗi ra, đồng thời làm cho phần tử protein tích điện âm vơ số điện tích âm SDS Khi nồng độ acetic acid giảm xuống theo thời gian thẩm tích SDS chiết tách protein dễ, hàm lượng protein tăng lên, thể băng protein rõ nét dần Từ băng protein thể rõ nét sau thời gian 48 cho thấy trọng lượng phân tử collagen nghiên cứu thể chuỗi polipeptid α chủ yếu có trọng lượng mức 100kDa, 70kDa, diện số chuỗi polipeptid nhỏ 55kDa Với kết hợp chuỗi polipeptid α tạo thành collagen có trọng lượng phân tử phù hợp kiểu collagen loại I da cá [3] kDa 100 70 55 40 35 25 15 10 Hình Ảnh điện di đồ SDS M: khối lượng thang chuẩn protein (10-130kDa, Bioline); KTT: mẫu khơng thẩm tích; 12, 24, 36 48 mẫu qua thời gian thẩm tích khác Kết điện di thu tương đồng với nghiên cứu Ogawa M cộng (2004) [5] collagen từ vây xương cá gõ biển cá đầu cừu với trọng lượng phân tử chuỗi α1 α2 130 kDa 110 kDa Trong nghiên cứu Muyonga J.H cộng (2004) [4] collagen type I chiết xuất từ da cá rô sông Nile cho trọng lượng phân tử chuỗi α tương đồng 120 kDa cho α1 115 kDa cho α2 Trong nghiên cứu gần Ana L Alves cộng (2017) thành phần collagen da cá biển, mẫu SDSPAGE cho collagen chiết xuất từ cá hồi cá tuyết cho thấy dải đặc trưng collagen, cụ thể chuỗi α β Đối với hai lồi, phân tích điện di cá hồi (a) cá tuyết (b) chứng minh có mặt chuỗi α1 α2, tương ứng với collagen loại I [7] 3.2.3 Ảnh SEM Cấu trúc collagen quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) độ phóng đại khác Ảnh SEM collagen rắn trình bày hình Ảnh SEM cho thấy cấu trúc collagen gồm nhiều sợi nano collagen (nanofibril) liên kết với tạo nên mạng lưới cấu trúc bền vững Hình 5a cho thấy sợi collagen xoắn liên kết thành cấu trúc lớn Hình 5b 181 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 cho thấy sợi collagen xếp theo chiều dọc tạo thành bó sợi lớn Hình 5c cho thấy rõ xếp có trật tự sợi collagen Ở độ phóng đại thấp, quan sát liên kết sợi collagen cuộn trịn thành mạng với macropores có khoảng cách có kích thước từ 1–10 μm Các sợi cuộn trịn có phạm vi kích thước rộng từ ∼300 nm đến ∼2 μm đường kính Phóng to vào mạng, sợi cong quan sát rõ ràng bó xoắn ốc cụm nanofibril Sự xếp xoắn ốc sợi nano collagen xảy vùng, kích cỡ mức độ khác dọc theo bó Việc tự tổng hợp sợi nano collagen địa vào bó xoắn ốc quan sát SEM với độ phóng đại cao Phóng to bó xoắn ốc, chúng tơi quan sát sợi nano riêng biệt đơn vị tạo nên kết hợp phân cấp sợi xoắn ốc lớn (Hình 5c) Các đơn vị sợi nano collagen có đường kính trung bình ∼50 nm Chính xếp trật tự liên kết chặt chẽ với mà collagen từ da cá basa bền vững phù hợp với cấu trúc collagen nghiên cứu cấu trúc collagen gần [2] a c b Hình Ảnh SEM collagen thu từ da cá basa độ phân giải khác 3.2.4 Phổ hồng ngoại Phổ FT-IR collagen chiết xuất từ da cá basa thể hình Các dải hấp thụ tương ứng với liên kết amide chính: amide A, amide B, amide I, amide II, amide III Nhóm amide A collagen phát peak có số sóng 3375 cm, phù hợp với dải có peak N– H, đồng thời cho thấy có mặt liên kết hydro (Barth, 2007) [6] Nhóm amide B tìm thấy peak có cường độ 2958 cm-1 tương ứng với dao động nhóm –CH2 (asymetrical –CH2 stretch) [2] Đỉnh collagen amide I đo 1655 cm-1, khoảng 1600 –1700 cm-1 vị trí dải amide I nói chung Đỉnh collagen amide II đo 1545 cm-1, phù hợp với khoảng 1540–1600 cm-1 amide II Dải amide III collagen phát 1240 cm-1, qua biểu hình dạng xếp kiểu xoắn ốc tồn collagen từ da cá basa Amide B Amide III Amide II Amide A Amide I Hình Phổ FT-IR collagen 182 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 Kết đo phổ FT-IR cho thấy xuất peak nhóm chức phân tử collagen –N–H, –C=O amit…đều tìm thấy phổ IR collagen Một số dao động phổ FT-IR collagen trình bày bảng Các dải IR đặc trưng collagen tự nhiên, phù hợp với kết nghiên cứu báo cáo [2], [3] 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn collagen Theo Hudzicki (2009), giấy tẩm chất nghiên cứu có kháng khuẩn không cho vi khuẩn mọc thể vòng kháng khuẩn [1] Ngược lại vi khuẩn mọc xung quanh khoanh giấy khơng có tính kháng khuẩn Đường kính vịng kháng khuẩn lớn, tính kháng khuẩn mạnh Kết kiểm chứng hoạt tính kháng khuẩn collagen hai chủng khuẩn: khuẩn E coli với vòng kháng khuẩn lớn có đường kính 28 mm; khuẩn Samonella với vịng kháng khuẩn có đường kính 11 mm Như collagen đánh giá có hoạt tính kháng khuẩn tốt hai loại hai khuẩn Bảng Hoạt tính kháng khuẩn collagen thu Vi khuẩn Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) E coli 28 Samonella sp 11 (a) (b) Hình Vịng trịn kháng khuẩn (a) E coli (b) Samonella sp KẾT LUẬN Collagen chiết xuất từ da cá basa với hiệu suất cao phương pháp hóa học xử lý kiềm để khử protein xà phịng hóa lipit, xử lý citric acid để khử bớt khoáng cho nguyên liệu, chiết acetic acid làm phương pháp thẩm tích Na2HPO4 Sản phẩm collagen thu có thành phần hóa học số tính chất đặc trưng phù hợp với tính chất đặc trưng collagen thu nhận từ thủy sản TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] Nguyễn Tấn Đạt Nguyễn Bá Tiếp (2016), Đánh giá hiệu suất chiết tác dụng cao chiết từ gỗ Tô mộc (Caesalpinia sappan L.) dung môi Ethanol với vi khuẩn Escherichia coli, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 14(9), tr.1368-1376 Lương Nguyễn Công Hào (2018), “Sử dụng phương pháp khác xác định khối lượng phân tử collagen chiết xuất từ da cá basa (Pangasius bocourti)” Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang Hau Van Duong, Trang The Lieu Chau, Nhan Thi Thanh Dang, Duc Van Nguyen, Son Lam Le, Thang Sy Ho, Tuyen Phi Vu, Thi Thi Van Tran and Thanh-Dinh Nguyen (2018), Selfaggregation of water-dispersible nanocollagen helices, Biomaterial Sciences, 6, 651 183 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ [4] [5] [6] [7] [8] | HNKH 2019 Muyonga J H., Cole C.G B., Duodu K.G (2004), Characterization of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus) Food Chem, 85(1):81-89 Ogawa M., Portier R.J., Moody M.W., Bell J., Schexnayder M A., Losso J.N (2005) Biochemical properties of bone and scale collagens isolated from the subtropical fish black drum (Pogonia cromis) and sheepshead seabream (Archosargus probatocepahlus), Food Chemistry, 88(4), 495-450 Barth A (2007) Infrared spectroscopy of proteins John Wiley & Sons Ltd, 9, 1073-1101 Ana L.Alves, An L P Marques, Eva Martins, Tiago H Silva and Rui L Reis Cosmetic Potential of Marine Fish Skin Collagen, Cosmetics, 2017, 4, 39 Doi: 10.3390 Lịch sử nghiên cứu collagen Colly collagen Việt Nam Cập nhật ngày 31/07/2018 http://collagen6500.com/tin-tuc/lich-su-nghien-cuu-collagen/, truy cập ngày 21/10/2019 184 ... gam da cá cho mẫu thí nghiệm 2.2 Tách chiết collagen từ da cá basa Collagen da cá basa tách chiết phương pháp hóa học với dung môi chiết acetic acid theo quy trình tách chiết xây dựng (Hình 1) Da. .. xây dựng (Hình 1) Da cá basa Khử béo Khử khoáng Tẩy màu, tẩy mùi Chiết collagen Tinh collagen Collagen Hình Quy trình tách chiết collagen từ da cá basa Trước tiên da cá basa nguyên liệu xử lý... tốt nội dung nghiên cứu cần quan tâm Mục đích nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận collagen hiệu suất cao từ da cá basa phương pháp hoá học Nghiên cứu đề xuất quy trình tách chiết collagen xác