Sản xuất Insulin từ Protein tái tổ hợp(1)

SẢN XUẤT INSULIN TỪ PROTEIN TÁI TỔ HỢP I Tìm hiểu về Insulin 1 Nguồn gốc Insulin là một loại hormon quan trọng, giúp cơ thể hấp thu glucose – một trong những thành phần chính cung cấp năng lượng cho con người Nguồn gốc của Insulin + Nguồn gốc động vật từ tụy của bò hay lợn Ngày nay, Insulin được tinh chế bằng phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa rất cao + Insulin người Được sản xuất từ Insulin động vật qua các phương pháp + Bán tổng hợp từ Insulin lợn + Tái tổ hợp gen là loại Insulin trung tính.

SẢN XUẤT INSULIN TỪ PROTEIN TÁI TỔ

HỢP

I Tìm hiểu về Insulin

1 Nguồn gốc

- Insulin là một loại hormon quan trọng, giúp cơ thể hấp thu glucose – một trong những thành phần chính cung cấp năng lượng cho con người

- Nguồn gốc của Insulin:

+ Nguồn gốc động vật : từ tụy của bò hay lợn Ngày nay, Insulin được tinh chế bằng phương pháp sắc kí

độ tinh khiết hóa rất cao + Insulin người :

- Được sản xuất từ Insulin động vật qua các phương pháp:

+ Bán tổng hợp từ Insulin lợn + Tái tổ hợp gen: là loại Insulin trung tính đơn thành phần, được sản xuất bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA,

sử dụng nấm men làm cơ thể sinh sản đến độ tinh khiết hóa và chất lượng cao nhất, có cấu trưc giống hệt Insulin tự nhiên của người, do vậy ít tạo kháng thể và thời gian tác dụng ngắn hơn

2 Cấu tạo

- Là một protein gồm 51 acid amin tạo thành 2 chuỗi polypeptid Ở hầu hết các loài, chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi B gồm 30 acid amin nố nhau bằng 2 cầu nối S-S (disulfua)

- Trọng lượng phân tử khoảng 5800 – 6000 Dalton

- Mặc dù trình tự các acid amin khác nhau giữa các loài nhưng 1 số đoạn nhất định của phân tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó chứa 3 cầu nối đisulfua , cả

2 đầu của chuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B Sự tương đồng trong trình tự acid amin dẫn đến cấu trúc 3 chiều của Insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau Insulin chiết rút từ động vật có

hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác

3 Phân loại

Có 4 loại Insulin :

- Insulin có tác dụng nhanh

- Insulin tác dụng bán chậm ( trung bình)

- Insulin tác dụng chậm

- Insulin hỗn hợp

4 Cơ chế

- Thời gian bán hủy 3-5 phút

- Bị phá hủy tại đường tiêu hóa bởi enzyme proteinase tại dạ dày

- Hấp thu tốt bằng đường tiêm Mức độ phụ thuộc vào nồng độ Insuin, vị trí tiêm, độ sâu của mũi tiêm, vận động

- Insulin bị chuyển hóa tại gan, thận, cơ Trong đó 50% tại gan

- Đào thải qua thận

II Sản xuất Insulin từ DNA tái tổ hợp

1 DNA tái tổ hợp:

Là DNA có thể tạo ra từ nhiều vật liệu di truyền khác nhau (nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA cùng một loại hoặc các loại khác nhau)

Là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốn

Các bước kỹ thuật DNA tái tổ hợp:

B1: Có tế bào chứa đoạn DNA mong muốn và vec-tơ chuyển gen mong muốn.

B2:Tách chiết DNA theo mong muốn ( phân lập gen)

Phân lập gen:

• Tách chiết DNA: tùy theo nguồn acid nucleic,có những kiểu tách chiết khác nhau:

Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ

màng, loại bỏ protein bằng enzim, kết tủa và tinh sạch DNA bằng hóa chất, dung môi, dịch chiết thích hợp

Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết DNA như trên Tuy nhiên chúng ta trực tiếp lấy các mẫu sinh phẩm như lông, tóc, thịt, máu, nước bọt., mô thân , rễ, lá

• Tách chiết RNA: quy trình tương tự tách chiết RNA, dịch chiết sau khi làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy RNA, kết tủa thu RNA

• Định lượng DNA, RNA: sản phẩm sau khi tách chiết cần có

độ tinh sạch và hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng

phương pháp đo quang phổ để xác định chỉ số hấp phụ, tù

đó đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di trên gel thạch xác định băng DNA, RNA, suy ra độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu

B3: Cắt DNA plasmid và DNA có đoạn gen mong muốn ( enzym cắt giới hạn và enzym nối)

- DNA plasmid: là DNA vòng khép kín, mạch vòng nằm trong tế bào( nấm men, vi khuẩn) tính sao chép độc lập, nhiều trình tự nhận biết của enzym giới hạn Có gen kháng chất kháng sinh Ngoài ra, Phage (phagơ Lamda),

có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài các gen khác nhau, giúp các gen này dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn

có khả năng và có khả năng sao chép nhanh

- Enzym cắt giới hạn: là enzym có khả năng cắt gen từ hệ gen nào đó, cắt vector tách dòng hoặc vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn các đoạn gen cần thiết

- Enzym nối Ligase: sửa chữa liên kết photphodieste ( nối phân tử DNA từ các nguồn khác nhau)

B4: Chộn chung DNA plasmid và đoạn gene mong muốn ( biến nạp)

Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ: Biến nạp các tế

bào khả biến: Tự nhiên, cảm ứng hóa học, biến nạp xung điện

Những tế bào chủ thường dùng: Vi khuẩn E.Coli, tế bào nấm men, tế bào động vật, thường dùng vào mục đích cụ thể; như nghiên cứu điều hòa hoạt động của gen, đột biến gen,

B5: Bổ xung enzym nối ligase để tạoDNA tái tổ hợp hoàn chỉnh B6: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen B7: Sàng lọc và theo dõi sự hoạt động của gen được chuyển vào trong tế bào chủ.

2, Ý nghĩa của sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất insulin:

Sản xuất Insulin bằng công nghệ tái tổ hợp là một bước nhảy vọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường

Ngoài ra, một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụng công nghệ này để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh tế, khi sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ khá nhiều mà chất

lượng sản phẩm vẫn bảo đảm, chính là nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao của tế bào nhân tham gia quy trình con nghệ DNA tái tổ hợp

3, Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp: Ngày nay, có rất nhiều các phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp được ra đời với mục đích phát hiện ra phương pháp sản xuất isnulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang bằng hoặc vượt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin

đã có từ trước đến nay Hầu hết các phương pháp sản xuất

insulin thương mại đều dựa trên chủng nấm men

(saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E.coli) kết hợp với gene để sản xuất ra insulin

Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp

miniproinsulin(MPI):

- \

• Hướng nghiên cứu mới:

- Sử dụng chủng vi sinh vật Pichia pastoris thay thế E.coli

Uư thế của P.pastoris:

+) Vi sinh vật đơn bào, dễ dàng nuôi cấy, dễ thao tác an toàn với con người

+) Có một promoter mạnh, sử dụng chất cảm ứng là methanol

+) Phát triển ở pH 3÷ 7 do đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động protase đối với protein tiết ra

+) Phát triển mật độ tế bào cao hơn nhiều lần so với S

cerevisiae

+) Thành phần môi trường đơn giản ,chi phí lên men thấp

-Sự dụng Vector nhân dòng pCR2.1

-Vector biểu hiện pIC9K (Introgen)

1 Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa cho MPI

- Trong nghiên cứu này,trình tư gen mã hóa insulin đã được thay đổi so với cấu trúc của MPI, trong đó bao gồm 53 amino acid: chuỗi B 29 amino acid, mini C 3 amino acid ( Asp-Gly-Lys), chuỗi A 21 amino acid Sau quá trình gáp cuộn, 3 amino acid nối với chuỗi A và B

sau đó 3 amino acid được cắt bỏ bằng tryipsin để có được 1 insulin trưởng thành Thr (b30) được thêm vào sau khi sử lý trispin Pro(b28) thay bằng Asp(b28)

His(b10) được thay thế bằng Asp (b10)

 Do có nhiều trình tự bị thay thế trong chuỗi amino acid sử dụng phương pháp hóa học để tổng hợp gen với khuôn mẫu mRNA người với cặp mồi đặc chưng cho gen mã hóa insulin

- 2 chuỗi olinucleotide mã hóa cho MPI sau khi được tổng hợp hóa học Tiếp tục Phân tích PCR để kéo dài 2 đoạn oligonucleotide thành trình tư DNA mạch đôi hoàn

chỉnh

2 Nhân dòng trong E.coi DH5- alpha

- PMI và pCR2.1 được dòng hóa trong TA cloning kit ( tỉ lệ sản phẩm PCR: Plasmid là 3:1) ở nhiệt độ 16 để qua đêm với enzym nối ligase Qúa trình nối này sẽ tạo ra plasmid pCR2.1 có chứa MPI

- Plasmid pCR2.1 chứa MPI được biến nạp vào E.coli DH5-alpha Trong môi trường LB chứa Amp Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mọc lên có màu trắng và tiếp tục đi phân tích PCR với cặp mồi m13F

- Khuẩn lạc cho kết quả dương tính được tách triết

plasmid được cắt bởi các enzym giới hạn EcoRI và NotI

3 Tạo dòng tế bào E.coli DH5-alpha mang Plasmid pPIC9k chứa MPI

- Plasmid pCR2.1 có chứa MPI và Plasmid pPIC9k được cắt bởi enzym giới hạn Nối đoạn cắt pCR2.1 có chứa MPI vào Plasmid pPIC9k bằng enzym nối tạo ra plasmid tổ hợp mới plasmid pPIC9k chứa MPI

- Tiếp tục, được cấy vào E.coli DH5-alpha và được nuôi cấy trên môi trường LB lần 2 chứa Amp ủ ở 37 Sau đó các khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F và AOX1-R

4 Chuyển Plasmid có chứa gen mong muốn vào P pichiapastoris

- plasmid pPIC9k chứa MPI sử dụng enzym giới hạn cắt tại vị trí HIS4 và điện biến nạp vào tế bào của nấm men Sau khi biến nạp tái tổ hợp tương đồng diễn ra giữa plasmid pPIC9k và genome nấm men và sàng lọc trên môi trường MD

- plasmid pPIC9k chứa MPI có chứa gen HIS4 có khả năng tổng hợp histidine Do đó tái tổ hợp tương đồng diễn ra giữa plasmid pPIC9k và genome nấm men mới có thể mọc trên môi trường này

- Các khuẩn lạc mọc trên MD được tách triết genomic DNA để kiểm tra sự hiện diệc của MPI bằng PCR vời cặp mồi AOXI-F/R

5 Sàng lọc tế bào có MPI cao

- Khuẩn lạc cho kết quả dương tính tiếp tục được nuôi cấy môi trường YPD với nồng độ kháng sinh G418 tăng dần nhằm sàng lọc chủng P pastoris có nhiều bản sao mã hóa cho MPI Màng nitocelluse được áp lên màng nấm men tiếp tục nuôi cấy qua đêm MPI được nấm men tiết

ra sẽ bám trên màng Kháng thể đặc hiệu Abcam đậm hay nhạt sẽ là biểu hiện khả năng sinh MPI cao hay thấp

6 Nuôi cấy

a Biểu hiện ở quy mô nuôi lắc

b Biểu hiện ở quy mô fermentor

7 Chuyển hóa MPI thành Insulin

- MPI sau khi tinh sạch được cắt bằng trispsin để loại bỏ C- pepdide, đồng thời gắn thêm Thr(b30) để tạo thành insulin hoàn chỉnh

III Ưu điểm, nhược điểm của insulin tái tổ hợp

1 Ưu điểm:

- Insulin tái tổ hợp có thể được điều chế trên quy mô lớn

mà không cần lo lắng về nguồn động vật

- Có thể duy trì tính nhất quán của từng mẻ và chất lượng cũng có thể được duy trì

- Giúp ngăn chặn sự tàn ác đối với động vật

- Các cơ hội phản ứng dị ứng đã được giảm thiểu

- Các cơ hội lây truyền bệnh từ nguồn động vật đã bị vô hiệu hóa

- Insulin tái tổ hợp gần như đã thay thế được insulin có nguồn gốc từ động vật trên khắp thế giới

2 Nhược điểm:

- Một số bệnh nhân tiểu đường phàn nàn về sự gia tăng các đợt biến chứng hạ đường huyết

- Chi phí sản xuất có xu hướng cao

IV Ứng dụng của insulin:

- Điều trị bệnh đái tháo đường

Link tham khảo:

https://%3A%2F%2Fluanvan.net.vn%2Fluan-van%2Fsan-xuat-insulin-tai-

to-hop-70163%2F%3Ffbclid%3DIwAR19W8Rj8e0D3bnEpOMt-JWqMSYiorOu7ZDU5G74Sg6znH4MKO2tjly2Uf8&h=AT2Mxi5w5VaFS6Hs4p

u8vvN7rsgG-dmHqpcQEbCvTYpKy6TDzJ8qnJUFga8p00WlIiYrFfHjWrg2dJ5kA8wYnY2taIb 14L9E3iYJkeDe3k87Sm8FPGQiBp_qTotzbcwIQbC_fd8Oar_kYCs

https://www.scribd.com/presentation/60795806/Cong-ngh%E1%BB%87-s

%E1%BA%A3n-xu%E1%BA%A5t-insulin-tai-t%E1%BB%95-h%E1%BB

%A3p?fbclid=IwAR3yJuJsoLKjRnQTn6u-9dRAQwOuVcFx3di8agFCEklS4fnbUtiuuoN0b9g

http://bvdkquangnam.vn/index.php/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-

cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp- http://khoasinhhoc.vinhuni.edu.vn/nghien-cuu-khoa-hoc/seo/insulin-va-cong-nghe-san-xuat-insulin-tren-the-gioi-48864

https://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin

https://www.toppr.com/ask/question/list-the-advantages-of-recombinant-insulin/?

fbclid=IwAR01UdgzFR0jbrg2GdNYamgtFmdd25HSu6lwMXdNyiOXt7P68CF APNI6VIo

https://www.thuocbietduoc.com.vn/tin-tuc-27760-1-23/cac-loai-insulin-trong-dieu-tri-dai-thao-duong.aspx