Sản xuất Insulin từ Protein tái tổ hợp(1)

SẢN XUẤT INSULIN TỪ PROTEIN TÁI TỔ HỢP I Tìm hiểu về Insulin 1 Nguồn gốc Insulin là một loại hormon quan trọng, giúp cơ thể hấp thu glucose – một trong những thành phần chính cung cấp năng lượng cho con người Nguồn gốc của Insulin + Nguồn gốc động vật từ tụy của bò hay lợn Ngày nay, Insulin được tinh chế bằng phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa rất cao + Insulin người Được sản xuất từ Insulin động vật qua các phương pháp + Bán tổng hợp từ Insulin lợn + Tái tổ hợp gen là loại Insulin trung tính.

SẢN XUẤT INSULIN TỪ PROTEIN TÁI TỔ HỢP I Tìm hiểu Insulin Nguồn gốc - Insulin loại hormon quan trọng, giúp thể hấp thu glucose – thành phần cung cấp lượng cho người - Nguồn gốc Insulin: + Nguồn gốc động vật : từ tụy bò hay lợn Ngày nay, Insulin tinh chế phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa cao + Insulin người : - Được sản xuất từ Insulin động vật qua phương pháp: + Bán tổng hợp từ Insulin lợn + Tái tổ hợp gen: loại Insulin trung tính đơn thành phần, sản xuất kĩ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm thể sinh sản đến độ tinh khiết hóa chất lượng cao nhất, có cấu trưc giống hệt Insulin tự nhiên người, tạo kháng thể thời gian tác dụng ngắn Cấu tạo - Là protein gồm 51 acid amin tạo thành chuỗi polypeptid Ở hầu hết loài, chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi B gồm 30 acid amin nố cầu nối S-S (disulfua) - Trọng lượng phân tử khoảng 5800 – 6000 Dalton - Mặc dù trình tự acid amin khác lồi số đoạn định phân tử có tính bảo tồn cao, đoạn chứa cầu nối đisulfua , đầu chuỗi A nhánh bên đầu COOH chuỗi B Sự tương đồng trình tự acid amin dẫn đến cấu trúc chiều Insulin loài khác giống Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao lồi khác Phân loại Có loại Insulin : - Insulin Insulin Insulin Insulin có tác dụng nhanh tác dụng bán chậm ( trung bình) tác dụng chậm hỗn hợp Cơ chế - Thời gian bán hủy 3-5 phút - Bị phá hủy đường tiêu hóa enzyme proteinase dày - Hấp thu tốt đường tiêm Mức độ phụ thuộc vào nồng độ Insuin, vị trí tiêm, độ sâu mũi tiêm, vận động - Insulin bị chuyển hóa gan, thận, Trong 50% II gan - Đào thải qua thận Sản xuất Insulin từ DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp: Là DNA tạo từ nhiều vật liệu di truyền khác (nhờ kỹ thuật ghép nối đoạn DNA loại loại khác nhau) Là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo gen hệ gen ; cải biến cấu trúc gen, nhằm tạo gen chuyển chúng vào tế bào, thể chủ nhằm mục đích sản xuất sản phẩm ( protein, enzym,), tế bào, thể có tính trạng theo mong muốn Các bước kỹ thuật DNA tái tổ hợp: B1: Có tế bào chứa đoạn DNA mong muốn vec-tơ chuyển gen mong muốn B2:Tách chiết DNA theo mong muốn ( phân lập gen) Phân lập gen: • Tách chiết DNA: tùy theo nguồn acid nucleic,có kiểu tách chiết khác nhau: Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ protein enzim, kết tủa tinh DNA hóa chất, dung mơi, dịch chiết thích hợp Đối với mơ, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết DNA Tuy nhiên trực tiếp lấy mẫu sinh phẩm lơng, tóc, thịt, máu, nước bọt., mơ thân , rễ, • Tách chiết RNA: quy trình tương tự tách chiết RNA, dịch chiết sau làm protein, sử dụng enzim phân hủy RNA, kết tủa thu RNA • Định lượng DNA, RNA: sản phẩm sau tách chiết cần có độ tinh hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định số hấp phụ, tù đánh giá độ tinh hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di gel thạch xác định băng DNA, RNA, suy độ tinh hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu B3: Cắt DNA plasmid DNA có đoạn gen mong muốn ( enzym cắt giới hạn enzym nối) - DNA plasmid: DNA vịng khép kín, mạch vịng nằm tế bào( nấm men, vi khuẩn) tính chép độc lập, nhiều trình tự nhận biết enzym giới hạn Có gen kháng chất kháng sinh Ngồi ra, Phage (phagơ Lamda), có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài gen khác nhau, giúp gen dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả có khả chép nhanh - Enzym cắt giới hạn: enzym có khả cắt gen từ hệ gen đó, cắt vector tách dịng vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn đoạn gen cần thiết - Enzym nối Ligase: sửa chữa liên kết photphodieste ( nối phân tử DNA từ nguồn khác nhau) B4: Chộn chung DNA plasmid đoạn gene mong muốn ( biến nạp) Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ: Biến nạp tế bào khả biến: Tự nhiên, cảm ứng hóa học, biến nạp xung điện Những tế bào chủ thường dùng: Vi khuẩn E.Coli, tế bào nấm men, tế bào động vật, thường dùng vào mục đích cụ thể; nghiên cứu điều hòa hoạt động gen, đột biến gen, B5: Bổ xung enzym nối ligase để tạoDNA tái tổ hợp hoàn chỉnh B6: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen B7: Sàng lọc theo dõi hoạt động gen chuyển vào tế bào chủ 2, Ý nghĩa sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất insulin: Sản xuất Insulin công nghệ tái tổ hợp bước nhảy vọt việc chữa trị bệnh tiểu đường Ngoài ra, ý nghĩa quan sử dụng công nghệ để sản xuất Insulin, hiệu kinh tế, sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ nhiều mà chất lượng sản phẩm bảo đảm, nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao tế bào nhân tham gia quy trình nghệ DNA tái tổ hợp 3, Quy trình sản xuất Insulin công nghệ DNA tái tổ hợp: Ngày nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đời với mục đích phát phương pháp sản xuất isnulin có suất cao hiệu sản xuất phải ngang vượt trội so với hệ thống sản xuất insulin có từ trước đến Hầu hết phương pháp sản xuất insulin thương mại dựa chủng nấm men (saccharomyces cerevisiae) vi khuẩn (E.coli) kết hợp với gene để sản xuất insulin Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp miniproinsulin(MPI): - \ • Hướng nghiên cứu mới: - Sử dụng chủng vi sinh vật Pichia pastoris thay E.coli Uư P.pastoris: +) Vi sinh vật đơn bào, dễ dàng ni cấy, dễ thao tác an tồn với người +) Có promoter mạnh, sử dụng chất cảm ứng methanol +) Phát triển pH 3÷ điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động protase protein tiết +) Phát triển mật độ tế bào cao nhiều lần so với S cerevisiae +) Thành phần môi trường đơn giản ,chi phí lên men thấp -Sự dụng Vector nhân dòng pCR2.1 -Vector biểu pIC9K (Introgen) Thiết kế tổng hợp gen mã hóa cho MPI - Trong nghiên cứu này,trình tư gen mã hóa insulin thay đổi so với cấu trúc MPI, bao gồm 53 amino acid: chuỗi B 29 amino acid, mini C amino acid ( Asp-Gly-Lys), chuỗi A 21 amino acid Sau trình gáp cuộn, amino acid nối với chuỗi A B sau amino acid cắt bỏ tryipsin để có insulin trưởng thành Thr (b30) thêm vào sau sử lý trispin Pro(b28) thay Asp(b28) His(b10) thay Asp (b10)  Do có nhiều trình tự bị thay chuỗi amino acid sử dụng phương pháp hóa học để tổng hợp gen với khn mẫu mRNA người với cặp mồi đặc chưng cho gen mã hóa insulin - chuỗi olinucleotide mã hóa cho MPI sau tổng hợp hóa học Tiếp tục Phân tích PCR để kéo dài đoạn oligonucleotide thành trình tư DNA mạch đơi hồn chỉnh Nhân dịng E.coi DH5- alpha - PMI pCR2.1 dịng hóa TA cloning kit ( tỉ lệ sản phẩm PCR: Plasmid 3:1) nhiệt độ 16 để qua đêm với enzym nối ligase Qúa trình nối tạo plasmid pCR2.1 có chứa MPI - Plasmid pCR2.1 chứa MPI biến nạp vào E.coli DH5alpha Trong môi trường LB chứa Amp Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mọc lên có màu trắng tiếp tục phân tích PCR với cặp mồi m13F - Khuẩn lạc cho kết dương tính tách triết plasmid cắt enzym giới hạn EcoRI NotI Tạo dòng tế bào E.coli DH5-alpha mang Plasmid pPIC9k chứa MPI - Plasmid pCR2.1 có chứa MPI Plasmid pPIC9k cắt enzym giới hạn Nối đoạn cắt pCR2.1 có chứa MPI vào Plasmid pPIC9k enzym nối tạo plasmid tổ hợp plasmid pPIC9k chứa MPI - Tiếp tục, cấy vào E.coli DH5-alpha nuôi cấy môi trường LB lần chứa Amp ủ 37 Sau khuẩn lạc kiểm tra phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F AOX1-R Chuyển Plasmid có chứa gen mong muốn vào P pichiapastoris - plasmid pPIC9k chứa MPI sử dụng enzym giới hạn cắt vị trí HIS4 điện biến nạp vào tế bào nấm men Sau biến nạp tái tổ hợp tương đồng diễn plasmid pPIC9k genome nấm men sàng lọc môi trường MD - plasmid pPIC9k chứa MPI có chứa gen HIS4 có khả tổng hợp histidine Do tái tổ hợp tương đồng diễn plasmid pPIC9k genome nấm men mọc mơi trường - Các khuẩn lạc mọc MD tách triết genomic DNA để kiểm tra diệc MPI PCR vời cặp mồi AOXI-F/R Sàng lọc tế bào có MPI cao - Khuẩn lạc cho kết dương tính tiếp tục ni cấy mơi trường YPD với nồng độ kháng sinh G418 tăng dần nhằm sàng lọc chủng P pastoris có nhiều mã hóa cho MPI Màng nitocelluse áp lên màng nấm men tiếp tục nuôi cấy qua đêm MPI nấm men tiết bám màng Kháng thể đặc hiệu Abcam đậm hay nhạt biểu khả sinh MPI cao hay thấp Nuôi cấy a Biểu quy mô nuôi lắc b Biểu quy mơ fermentor Chuyển hóa MPI thành Insulin - MPI sau tinh cắt trispsin để loại bỏ C- pepdide, đồng thời gắn thêm Thr(b30) để tạo thành insulin hoàn chỉnh III Ưu điểm, nhược điểm insulin tái tổ hợp Ưu điểm: - Insulin tái tổ hợp điều chế quy mô lớn mà không cần lo lắng nguồn động vật - Có thể trì tính qn mẻ chất lượng trì - Giúp ngăn chặn tàn ác động vật - Các hội phản ứng dị ứng giảm thiểu - Các hội lây truyền bệnh từ nguồn động vật bị vơ hiệu hóa - Insulin tái tổ hợp gần thay insulin có nguồn gốc từ động vật khắp giới Nhược điểm: - Một số bệnh nhân tiểu đường phàn nàn gia tăng đợt biến chứng hạ đường huyết - Chi phí sản xuất có xu hướng cao IV Ứng dụng insulin: - Điều trị bệnh đái tháo đường Link tham khảo: https://%3A%2F%2Fluanvan.net.vn%2Fluan-van%2Fsan-xuat-insulin-taito-hop-70163%2F%3Ffbclid%3DIwAR19W8Rj8e0D3bnEpOMt- JWqMSYiorOu7ZDU5G74Sg6znH4MKO2tjly2Uf8&h=AT2Mxi5w5VaFS6Hs4p u8vvN7rsgGdmHqpcQEbCvTYpKy6TDzJ8qnJUFga8p00WlIiYrFfHjWrg2dJ5kA8wYnY2taIb 14L9E3iYJkeDe3k87Sm8FPGQiBp_qTotzbcwIQbC_fd8Oar_kYCs https://www.scribd.com/presentation/60795806/Cong-ngh%E1%BB%87-s %E1%BA%A3n-xu%E1%BA%A5t-insulin-tai-t%E1%BB%95-h%E1%BB %A3p?fbclid=IwAR3yJuJsoLKjRnQTn6u9dRAQwOuVcFx3di8agFCEklS4fnbUtiuuoN0b9g http://bvdkquangnam.vn/index.php/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-vacong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hphttp://khoasinhhoc.vinhuni.edu.vn/nghien-cuu-khoa-hoc/seo/insulin-vacong-nghe-san-xuat-insulin-tren-the-gioi-48864 https://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin https://www.toppr.com/ask/question/list-the-advantages-of-recombinantinsulin/? fbclid=IwAR01UdgzFR0jbrg2GdNYamgtFmdd25HSu6lwMXdNyiOXt7P68CF APNI6VIo https://www.thuocbietduoc.com.vn/tin-tuc-27760-1-23/cac-loai-insulintrong-dieu-tri-dai-thao-duong.aspx ... nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đời với mục đích phát phương pháp sản xuất isnulin có suất cao hiệu sản xuất phải ngang vượt trội so với hệ thống sản xuất insulin có từ trước đến Hầu... thành sản phẩm hạ nhiều mà chất lượng sản phẩm bảo đảm, nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao tế bào nhân tham gia quy trình nghệ DNA tái tổ hợp 3, Quy trình sản xuất Insulin cơng nghệ DNA tái tổ hợp:... pháp sản xuất insulin thương mại dựa chủng nấm men (saccharomyces cerevisiae) vi khuẩn (E.coli) kết hợp với gene để sản xuất insulin Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp miniproinsulin(MPI):