Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS Đinh Thị Thu Hằng

ĐẶT VẤN ĐỀ HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020 Thiết kế phản ứng TTSS1 real time loop mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS Đinh Thị[.]

HỌC VIỆN QUÂN Y HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020 Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS Đinh Thị Thu Hằng Hà Nội, T12 - 2020 ĐẶT VẤN ĐỀ Burkholderia pseudomallei melioidosis - Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe, tử vong 40% Phân bố: bùn đất, nước vùng nhiệt đới cận nhiệt đới A Whitmore (1911) Melioidosis: cấp mạn tính - triệu chứng khơng đặc hiệu, dễ nhầm lẫn chẩn đốn, bỏ sót ca bệnh (“bệnh lao Việt Nam”) “Bom hẹn Việt Nam” Wiersinga, W J., et al (2012) "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44 Chen, Y L., et al (2014) PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877 Áp-xe melioidosis White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722 Phân bố Melioidosis toàn cầu - Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến (Currie B J 2015)) Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/ AIDS lao) số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi (Limmathurotsakul D et al 2010, 2012) NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia (Limmathurotsakul D et al 2016), (Gohler A et al 2017) -> khó khăn xét nghiệm Wiersinga, W J., et al (2012) "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44 Rotz, L D., et al (2002) Emerg Infect Dis 8(2): 225-230 B pseudomallei gây bệnh Độc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit) Đường lây: • Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe phủ tạng, NKH Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bị), suy giảm MD • Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ (Perumal Samy R et al 2017) Phòng điều trị - Chưa có vắc xin, phịng khơng đặc hiệu - Điều trị: Phẫu thuật làm vết thương + Phối hợp thuốc • Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: tháng cơng, 3-6T trì (thể nặng 12T) • Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ ápxe phổi • Dễ tái phát, thời gian, kinh phí => Quân số, sức chiến đấu B pseudomallei vũ khí sinh học • B pseudomallei liệt kê danh mục tác nhân sinh học nhóm B, có tiềm sử dụng làm vũ khí sinh học (VKSH) • Hệ gen B pseudomallei giống đến 99% so với B mallei SD làm VKSH quân đội Đức, Nhật, Nga • Quân đội Mỹ nghiên cứu B pseudomallei để chế tạo VKSH Hệ gen B pseudomallei Gene TTSS1 AF074878 NST số 1: 3.460 CDS Trao đổi chất, tăng trưởng NST số 2: 2.395 CDS Thích ứng, tồn Holden et al (2004),10.1073/pnas.0403302101 Các phương pháp xác định Nuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngày Huyết học, miễn dịch: độ nhạy độ đặc hiệu không cao PCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực - chưa đáp ứng thực tế trường Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop mediated isothermal Amplification) - Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt, sản phẩm DNA mạch vòm 109-1010 lần, hiệu cao (Notomi T et al 2000) - Bst DNA polymerase & mồi thiết kế đặc biệt, sản phẩm đánh giá mắt thường độ đục, màu sắc 10 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu chủng B p PCR, cloning  B pseudomallei, B cepacia, P aeruginosa Giải trình tự Thiết kế mồi gen TTSS1 Primer PrimerExplorer V.5 GenBank  PCR, real-time PCR Thiết lập LAMP PP: Thực nghiệm mơ tả, phân tích PTN Đánh giá  real-time LAMP • Độ nhạy, độ đặc hiệu • So sánh 15 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Gene TTSS1 AF074878 PCR: primer BpF/R, sản phẩm: 723 bp BpF qBpF qBpR BpR Real-time PCR: primer qBpF/R, probe qBp-Pr, sp: 105 bp LAMP Real-time LAMP: set primer LAMP gồm 2-3 cặp FIP/ BIP, F3/ B3, LB/LF vùng gene TTSS1 (The type III secretion system) TTSS1 16 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nhân dòng thiết lập chứng dương gen TTSS1 723 bp PCR TTSS1-orf11 gel agarose 1,2% M: Marker 100bp (Thermo Scientific); 1: ĐC âm; 2- 6: Mẫu B pseudomallei Bp1-Bp5 17 Thiết kế phản ứng TTSS1 real-time PCR Phản ứng real-time 20 µl PCR tối ưu : QuantiTect probe PCR 1X; qBp (F1+R1) 0,2 µM; probe qBp 0,05 µM; mồi IC (F+R) 0,2 µM; probe IC 0,05 µM; µl DNA Chu trình: (50oC/ phút) (95oC/ 15m) (94oC/ 15s; 60oC/ 60s; 70oC/ 30s)x 45 chu kỳ Real-time PCR LOD95%=14,6 copy/rxn, độ tin cậy 95% PCR LOD: 500 copy/rxn 18 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thiết kế mồi LAMP TT Tên mồi   Bộ mồi F3 B3 58,01 57,88 Bp-F3 Bp-B3 60,01 59,48 Bp-FIP Bp-BIP Bp-BIP-4T To gắn mồi (Ta: oC) TCCTGCTCCCACACCG CCGCTTGCGCGTCAT CCACAGCAACGGAAAGAGCAGAFIP GCTTGCGGCCGAGATC GCCTCGATTGCGCGATCGCCBIP TGTTGCTAGCGGATTGTCA Bộ mồi 2, mồi Bp-FIP-4T Trình tự (5’-3’) Bp-LF Bp-LB CAATCTCACCAGCGTTCCA CCGGCCTCAATTCATC GCGCAGATGCCTGTCGATCACCGCCAACCTTTCCACA GCGCAGATTGCCTGTCGATCATTTTCCGCAACCTTCCAACA CGGCACAACCTGACAATCGCTTCCGCGAACCTGGACT CGGCACAACCTGACAATCGCTTTTTTCCGCGAACCTGGAACT TCGGTAACTCAGCGGATCC CCTTTCCCTGGTTTGCTCG     Kích thước (bp) Nguồn 215 Chantratita N cs, 2008 [13]     242                 61,16 60,98     Tự kế thiết 19 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thiết kế phản ứng LAMP Quan sát mắt thường Điện di UV 20 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định ngưỡng phát Sự thay đổi màu bổ sung SYBR Green I Sự phát quang sau chiếu tia UV LOD: copy/µl ĐTT Hằng, CD Hưng, BT Huyền, cs NC phát triển kỹ thuật LAMP đa mục tiêu phát VK B.21 pseudomallei mẫu lâm sàng CNSH toàn quốc 2020: 730-736 Thiết kế, thử nghiệm phản ứng real-time LAMP Bộ mồi Hệ thống Genie III (OptiGene, Anh), (45oC/3m), (65oC/30m), (98oC-> 80oC)/ramp rate 0,05oC/s), Hệ thống RotorGene-Q (65oC/ 1m)/30 chu kỳ; (80oC->98oC)/ 0,5oC/s Đồ thị tín hiệu huỳnh quang phản ứng real-time LAMP xác định B pseudomallei 22 NC Đối chứng âm nước khử ion Bộ mồi mồi (oligo 4T) Hệ thống Genie III Điện di sản phẩm real-time LAMP gel agarose 2,0% Mẫu Bp1; 2, 4, Mẫu Bc1, Bc2, Pa1 (Bộ mồi 2); 3, 5, Mẫu Bc1-4T, Bc2-4T, Pa1-4T (Bộ mồi 3) 23 Tối ưu đánh giá phản ứng real-time LAMP Tối ưu nồng độ mồi phản ứng real-time LAMP (bộ 2, máy Genie III) Nồng độ mồi Peak value (Mean, phút) 0,2X 0,4X 0,6X 0,8X 1X NA 24,45 22,37 21,38 20,15 Chú thích: Mean Giá trị trung bình, NA Khơng xác định Giá trị mồi tối ưu 1X với nồng độ cụ thể cặp mồi Bp-FIP/BIP, Bp-F3/B3, Bp-LB/LF 1,6; 0,2; 0,4 µM LOD: copy/ µl (6/6 lần lặp lại), CV