tcvn8736-2011

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8736:2011 THUỐC THÚ Y - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ BÀO TỬ BACILLUS Veterinary drugs - Method for enumeration spores of Bacillus Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp đếm tổng số bào tử Bacillus, bao gồm Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis loại chế phẩm sinh học dùng thú y Phương pháp khơng thể phân biệt với lồi Bacillus khác Bacillus cereus, Bacillus anthracis Để phân biệt Bacillus cereus, Bacillus anthracis phải tiến hành xác định riêng theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) phép thử tính di động bổ sung giúp để phân biệt nghi ngờ có mặt Bacillus cereus Bacillus anthracis Nguyên tắc Trên môi trường đặc, vi sinh vật bào tử đứng riêng phát triển thành khuẩn lạc Đếm số khuẩn lạc tính số lượng vi sinh vật đơn vị thể tích dịch nghiên cứu Ưu điểm phương pháp không phát nhầm vi sinh vật chết mảnh xác hữu Sử dụng phương pháp đếm thạch đĩa, đếm số khuẩn lạc mơi trường thạch sau ủ hiếu khí nhiệt độ 370C ± 10C 24 h Tổng số bào tử Bacillus g 1ml mẫu chế phẩm kiểm nghiệm tính từ số khuẩn lạc đếm từ đĩa nuôi cấy đậm độ pha lỗng Mơi trường thuốc thử 3.1 Mơi trường PCA, pH 7,0 ± 0,2 có thành phần sau: Pepton 5,0 g Chất chiết nấm men 2,5 g D(+)-Glucose 1,0 g Thạch 14,0 g Nước cất 000 ml 3.2 D(+)-Glucose 3.3 Thạch 3.4 Natri clorua (NaCl) 3.5 Cồn 3.6 Nước cất 3.7 Bộ thuốc nhuộm Gram 3.8 Natri hydroxit (NaOH) 3.9 Axit clohydric (HCl) 3.10 Hydro peroxit, % Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường cụ thể sau: 4.1 Tủ cấy vi sinh vật 4.2 Nồi hấp áp lực 4.3 Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 oC 4.4 Tủ lạnh 4.5 Máy lắc 4.6 Máy đếm khuẩn lạc Máy đo pH LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn 4.8 Cân phân tích, có khả cân xác đến 0,1 mg 4.9 Kính hiển vi quang học 4.10 Lị vi sóng 4.11 Bể điều nhiệt, trì nhiệt độ 45 0C ± 0C 80 oC 4.12 Bình định mức, dung tích 1000 ml (loại A) 4.13 Bình nón 4.14 Ống nghiệm 4.15 Pipet, dung tích ml 10 ml 4.16 Ống đong, dung tích 100 ml 250 ml 4.17 Micropipet, dung tích 1000 l 4.18 Bơng khơng thấm nước Lấy mẫu bảo quản mẫu 5.1 Yêu cầu chung Lấy mẫu theo nguyên tắc ngẫu nhiên Lượng thuốc mẫu phân tích mẫu lưu phải đủ cho ba lần phân tích phải đủ để thực phép thử đảm bảo thu kết xác tin cậy Lượng thuốc tính tốn sở tiêu chuẩn phương pháp thử sản phẩm Thông thường lô sản xuất lấy hai mẫu (một mẫu phân tích mẫu lưu) Trường hợp đặc biệt, số mẫu phân tích mẫu lưu nhiều hai để đủ gửi kiểm nghiệm lưu nhiều nơi xét thấy cần thiết 5.2 Lấy mẫu thành phẩm Mẫu lấy vị trí khác lơ sản xuất, khơng phá lẻ đơn vị đóng gói sản phẩm để lấy mẫu Từ đơn vị lấy mẫu tập hợp lại thành mẫu chung mẫu cuối Số lượng mẫu thành phẩm cần lấy theo quy định Bảng Bảng - Số lượng mẫu cần lấy theo quy cách đóng gói Quy cách đóng gói (g ml) Số lượng mẫu lấy (đơn vị bao gói) Đến 70 Từ đến 30 Từ đến 50 Từ 50 đến 100 Từ 100 trở lên Trong trường hợp đặc biệt tùy theo quy cách đóng gói tính chất thuốc lấy mẫu đủ để phân tích lưu 5.3 Bảo quản mẫu Xem tiêu chuẩn cụ thể sản phẩm liên quan theo hướng dẫn nhà sản xuất Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị dung dịch pha loãng Cân g natri clorua, hịa tan nước cất đựng bình định mức 1000 ml, chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 dung dịch HCl 0,1 N NaOH 0,1 N Dùng ống đong cho vào bình nón bình 90 ml dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm ống ml dung dịch Đậy nút bơng khơng thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng nhiệt độ 121 0C 15 Bảo quản tủ lạnh nhiệt độ đến 0C, sử dụng 15 ngày 6.2 Chuẩn bị môi trường LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Cân thành phần môi trường PCA theo 4.1 lấy 22,5 g môi trường tổng hợp, chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 dung dịch HCl 0,1 N NaOH 0,1 N Lắc đun cách thủy lò vi sóng đến sơi (mơi trường trong) Rót vào bình 250 ml lượng môi trường 100 ml Tiệt khuẩn nồi hấp nhiệt độ 121 0C 15 Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 0C ± 0C bể điều nhiệt, chưa sử dụng cần bảo quản tủ lạnh nhiệt độ từ đến 0C không 30 ngày 6.3 Chuẩn bị mẫu thử Cân vô trùng khoảng 10 g (10 ml), xác đến 0,1 mg, mẫu thử cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha loãng tiệt trùng độ pha loãng 10-1 Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 Đặt bể điều nhiệt 80 0C 10 6.4 Các bước tiến hành 6.4.1 Pha loãng mẫu Dùng micropipet lấy ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng tiệt trùng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng cần thiết để đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đĩa theo dự kiến Đối với mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy đậm độ pha lỗng liên tiếp, đậm độ dùng đĩa petri vô trùng Lấy ml mẫu dung dịch pha loãng đậm độ khác cho vào đĩa petri Mơi trường PCA đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 0C Rót vào đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo dung dịch mẫu với môi trường cách lắc lần sang phải lần sang trái Để đĩa thạch đông tự nhiên mặt phẳng mát, nằm ngang Thời gian bắt đầu pha lỗng đến rót mơi trường vào đĩa không 30 6.5 Ủ ấm Khi thạch đông, lật úp đĩa cho vào tủ ấm 37 0C thời gian từ 18 h đến 24 h 6.6 Đọc kết Sau 24 h, đếm kết quả, đếm tổng số khuẩn lạc mọc đĩa Vi khuẩn Bacillus môi trường thạch tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi Để khẳng định Bacillus bao gồm: Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, tiến hành kiểm tra khuẩn lạc điển hình theo cách sau: - Nhuộm Gram: Bacillus trực khuẩn Gram (+) tạo thành chuỗi - Thử phản ứng Catalase: Bacillus cho catalase (+) - Nhuộm Glycogen: hạt glycogen vi khuẩn bắt màu đỏ nâu - Nếu 80 % trường hợp, tức không khuẩn lạc khuẩn lạc khẳng định thuộc chủng Bacillus tất khuẩn lạc đặc trưng phát triển đĩa coi thuộc nhóm - Trong trường hợp cịn lại số vi khuẩn chủng Bacillus xác định từ tỉ lệ phần trăm khuẩn lạc khẳng định tổng số khuẩn lạc đặc trưng lấy để kiểm tra Tính biểu thị kết 7.1 Tính kết Chọn đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đậm độ pha lỗng liên tiếp để tính kết Nếu chênh lệch giá trị đậm độ nhỏ lần, tính số N bào tử cho g ml sản phẩm cách tính trung bình cộng tống số khuẩn lạc đếm đĩa theo công thức sau: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Trong đó: C tổng khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại từ đậm độ pha loãng tiếp theo; V thể tích mẫu cấy đĩa, tính mililit (ml); n1 số đĩa có đậm độ pha loãng thứ giữ lại; n2 số đĩa có đậm độ pha lỗng thứ hai giữ lại; d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha lỗng thứ Làm trịn số kết có được, giữ lại số có nghĩa 7.2 Biểu thị kết Biểu thị kết dạng thập phân số 1,0 9,9 nhân với 10n (n số mũ thích hợp 10) Nếu chênh lệch giá trị đậm độ lớn lần, lấy giá trị đậm độ pha lỗng thấp để tính kết Nếu đĩa sản phẩm lỏng nguyên chất đậm độ pha lỗng ban đầu có 15 khuẩn lạc tính kết trung bình cộng khuẩn lạc đếm đĩa tính cho g ml sản phẩm Nếu tất đĩa khơng có khuẩn lạc mọc, đánh giá kết sau: - Ít khuẩn lạc Bacillus ml sản phẩm - Ít 1/d khuẩn lạc Bacillus g sản phẩm d hệ số pha loãng đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) nhiệt độ ủ; e) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tuỳ ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; f) kết thử nghiệm thu LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162