tieu-chuan-viet-nam-tcvn-8400-19-2014-bo-khoa-hoc-va-cong-nghe

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-19:2014 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN - PHẦN 19: BỆNH PHĨ THƯƠNG HÀN LỢN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 19: Salmonellosis in pig Lời nói đầu TCVN 8400-19:2014 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN - PHẦN 19: BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN LỢN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 19: Salmonellosis in pig CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh phó thương hàn vi khuẩn Salmonella gây lợn Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: Bệnh phó thương hàn lợn (Salmonellosis in pig) Là bệnh truyền nhiễm vi khuẩn Salmonella gây với thể bệnh chủ yếu bại huyết Salmonella choleraesuis (S choleraesuis) chủng Kunzendorf viêm ruột Salmonella typhimurium (S typhimurium) Ngoài ra, Salmonella typhisuis (S typhisuis), Salmonella enteritidis (S enteritidis), Salmonella dublin (S dublin), Salmonella derby (S derby), Salmonella heidelberg (S heidelberg) gây bệnh bệnh thường biểu thoáng qua dạng nhiễm khuẩn cục viêm phổi, viêm màng não, ỉa chảy, viêm hạch lâm ba Đặc biệt chủng S typhimurium, S enteritidis có khả gây bệnh người Vi khuẩn Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn gram âm, có khả di động, hiếu khí yếm khí tùy tiện khơng hình thành nha bào Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu kháng nguyên thân O (kháng nguyên O), kháng nguyên lông H (kháng nguyên H) Vi khuẩn Salmonella chia thành nhóm typ huyết Hiện phát 2400 typ huyết Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước khử khống, trừ có quy định khác 3.1 Mơi trường thạch máu: Thạch máu bổ sung từ % đến % máu cừu, máu bê, máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn nhà sản xuất) 3.2 Môi trường nước thịt 3.3 Thạch MacConkey hay thạch Brilliant green (BG) môi trường thạch XLD (xyloselysine-deoxycholate agar) 3.4 Nước peptone (peptone water) 3.5 Bộ kháng huyết chuẩn đơn giá đa giá định typ kháng nguyên vi khuẩn Salmonella 3.6 Nguyên liệu hóa chất cho phản ứng sinh hóa (Phụ lục A) 3.7 Nguyên liệu cho PCR (Phụ lục B) 3.8 Môi trường tetrathionate Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm sinh học số thiết bị, dụng cụ cụ thể sau: 4.1 Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 °C 4.2 Tủ ấm, trì nhiệt độ 42 °C 4.3 Nồi hấp, trì nhiệt độ 115°C, 121 °C 4.4 Phiến kính, 4.5 Que cấy, vơ trùng 4.6 Ống nghiệm, sạch, vơ trùng 4.7 Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 μm 4.8 Que cấy chích sâu, vơ trùng Cách tiến hành 5.1 Chẩn đốn lâm sàng 5.1.1 Đặc điểm dịch tễ - Bệnh xảy chủ yếu lợn sau cai sữa - Lợn khỏe mang mầm bệnh vi khuẩn thường cư trú hạch amidan tổ chức lâm ba - Nguồn lây nhiễm chủ yếu qua phân lợn bệnh lợn mang mầm bệnh - Bệnh có tính chất lây lan cục địa phương 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng Thể bại huyết - Thể bệnh thường gặp lợn cai sữa tháng tuổi - Dấu hiệu bệnh lợn ủ rũ, bỏ ăn, nằm rúc đầu vào góc chuồng, vài lợn chết có biểu tím tái bốn chân vùng bụng - Lợn sốt cao từ 40,5 °C đến 41,5 °C - Ho nhẹ, khó thở - Tỷ lệ chết cao - Lợn trưởng thành mắc thể bệnh thường chết đột ngột sảy thai Thể viêm ruột - Thể bệnh thường gặp lợn từ cai sữa đến tháng tuổi - Lợn ỉa chảy phân lỗng màu vàng có dính máu, màng nhày fibrin, bị bị lại vài lần kéo dài đến vài tuần - Lợn nước, gầy, sốt - Tỉ lệ chết thấp xảy sau ỉa chảy vài tuần, phần lớn lợn hồi phục trở thành vật mang trùng 5.1.3 Bệnh tích đại thể Thể bại huyết - Tím tái tai, chân, đuôi, bụng - Lách, hạch màng treo ruột sưng to - Gan có điểm hoại tử nhỏ - Phổi xung huyết, xuất huyết - Có có xuất huyết điểm miền vỏ thận, hoại tử ruột non Thể viêm ruột - Tổn thương chủ yếu hoại tử điểm hay tràn lan ruột già (kết tràng manh tràng) Hoại tử có có dạng loét cúc áo - Niêm mạc ruột dày lên phủ dịch nhày màu đỏ có mảnh màu vàng xám - Hạch màng treo ruột đặc biệt hạch hồi mang tràng sưng to 5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 5.2.1 Lấy mẫu Lợn chết nghi mắc bệnh thể bại huyết lấy bệnh phẩm là: máu, lách, gan, phổi Mỗi loại bệnh phẩm lấy vô trùng từ 50 g đến 100 g Lợn chết nghi mắc bệnh thể viêm ruột lấy bệnh phẩm ruột chất chứa ruột vùng hồi tràng, hạch lympho vùng hồi manh tràng Lợn sống: lấy mẫu phân trực tràng (lấy khoảng 10 g), dịch ngoáy họng vùng amidan Cho loại bệnh phẩm vào lọ hay túi ni lon vơ trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản điều kiện lạnh từ °C đến °C gửi phịng thí nghiệm chậm 24 h sau lấy mẫu Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích đặc điểm dịch tễ 5.2.2 Phân lập vi khuẩn Bệnh phẩm cấy vào môi trường: môi trường nước thịt (xem 3.2), môi trường thạch máu (xem 3.1), môi trường chọn lọc (thạch MacConkey, thạch Brillian green, thạch XLD (xem 3.3)), ni cấy hiếu khí tủ ấm 37 °C (xem 4.1) 24 h Với bệnh phẩm phân, dịch ruột, dịch ngoáy họng bệnh phẩm phủ tạng nghi bị nhiễm tạp khuẩn, cấy vào môi trường tăng sinh môi trường tetrathionate (xem 3.8), ni cấy hiếu khí tủ ấm 42 °C (xem 4.2) từ 36 h đến 48 h Sau cấy chuyển vào mơi trường thơng thường môi trường chọn Iọc Sau 24 h nuôi cấy, hình thái khuẩn lạc Salmonella mơi trường phân lập sau: Trên môi trường thạch máu (xem 3.1): khuẩn lạc có hình trịn, trơn, mặt vồng màu trắng đục Trên môi trường thạch MacConkey (xem 3.3): khuẩn lạc có hình trịn, trơn, hình vịm màu trắng đục Trên môi trường thạch Brillian green (xem 3.3): khuẩn lạc có hình trịn, trơn, màu hồng đậm Trên mơi trường thạch XLD (xem 3.3): khuẩn lạc có hình trịn, trơn, màu đỏ có nhân đen Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch máu (xem 3.1), nước peptone (xem 3.4) môi trường nước thịt (xem 3.2), nuôi tủ ấm (xem 4.1) từ 18 h đến 24 h để kiểm tra đặc tính sinh hóa hay giám định vi khuẩn phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) (xem Phụ lục B) 5.2.3 Xác định vi chuẩn 5.2.3.1 Kiểm tra đặc tính sinh hóa Bảng 1- Một số đặc tính sinh hóa đặc trưng vi khuẩn Salmonella Tính chất Salmonella Sp S choleraesuis chủng Kunzendorf S choleraesuis S typhisuis Indol - - - - Lactose - - - - H2S (TSI) + + - ± Glucose + + + + Citrate + + + - Lysine + + + - Mannitol + + + - Chú thích : Dương tính: + ; Âm tính: -; Phản ứng thay đổi: (± ) Kiểm tra đặc tính sinh hóa theo quy định Phụ lục A Có thể sử dụng kit sinh hóa thương mại để định danh vi khuẩn Salmonella spp theo hướng dẫn nhà sản xuất 5.2.3.2 Xác định vi khuẩn Salmonella phương pháp PCR Có thể sử dụng phương pháp PCR để xác định vi khuẩn Salmonella với cặp mồi đặc hiệu chu trình nhiệt trình bày Bảng Bảng - Các cặp mồi chu trình nhiệt cho PCR Gen đích Kí hiệu Trình tự mồi (5’-3’) Kích cỡ sản phẩm (bp) Chu trình nhiệt 139 (mồi xuôi) GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA 94 °C, min; 30 chu trình: invA 141 (mồi ngược) 284 TCATCGCACCGTCAAAGGAACC (94 °C, min; 55 °C, min; 72 °C, min) 72 °C Giữ °C Tiến hành phản ứng PCR theo quy định Phụ lục B 5.2.3.3 Định typ huyết Cấy vi khuẩn xác định Salmonella xác định sinh hóa hay phương pháp PCR vào môi trường thạch máu (xem 3.1), nuôi tủ ấm (xem 4.1) Sau từ 18h đến 24h tiến hành định typ huyết Định typ kháng nguyên theo nhóm kháng nguyên O phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính (xem 4.4) với kháng huyết chuẩn đa giá đơn giá (xem 3.5) Các bước tiến hành phản ứng đọc kết theo dẫn nhà sản xuất kháng huyết Định typ kháng nguyên H thường sử dụng phản ứng ngưng kết chậm ống nghiệm (xem 4.6) Các bước tiến hành phản ứng đọc kết theo dẫn nhà sản xuất Bảng - Tính kháng nguyên số typ huyết Salmonella Typ huyết Salmonella Nhóm Kháng nguyên thân O Kháng nguyên lỏng H Pha (Phase1) (Pha 2) Phase2 S typhimurium B 1, 4, (5), 12 i 1,2 S choleraesuis C1 6, c 1,5 S choleraesuis chủng Kunzendorf C1 6, (c) 1,5 S typhisuis C1 6, c 1,5 S dublin D1 1, 9, 12 g.p S heidelberg B 1, 4, (5), 12 r 1,2 S enteritidis D1 1, 9, 12 g,m (1,7) Kết luận Lợn xác định mắc bệnh phó thương hàn có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình bệnh phân lập vi khuẩn Salmonella phịng thí nghiệm thuộc typ huyết có khả gây bệnh cho lợn Bảng PHỤ LỤC A (Quy định) Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa A.1 Phản ứng sinh lndol A.1.1 Thuốc thử Kovac’s Thành phần Paradimetylaminobenzaldehyde 5g Cồn amylic 75 ml HCl đậm đặc 25 ml Cách pha: Hòa dung dịch paradimetylaminobenzaldehyde vào cồn amylic cho tan hết để tủ tạnh °C Thêm từ từ 5ml đến 10 ml HCl hịa để tủ lạnh, sau lại tiếp tục đổ HCl cho đủ lượng Bảo quản thuốc thử lọ tối màu, °C A.1.2 Cách tiến hành Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường nước peptone (xem 3.4) mơi trường nước peptone (xem 3.4) có bổ sung tryptophan, nuôi tủ ấm (xem 4.1) Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ Đọc kết sau: - Phản ứng dương tính: có vịng màu đỏ xuất nơi tiếp giáp thuốc thử môi trường (sinh Indol) - Phản ứng âm tính: khơng có vịng màu đỏ xuất nơi tiếp giáp thuốc thử môi trường A.2 Sử dụng Citrate Pha chế môi trường (thạch simon citrate) theo quy định nhà sản xuất Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào thạch simon citrate, nuôi tủ ấm (xem 4.1) từ 18 h đến 24 h Vi khuẩn sử dụng citrate (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu xanh nước biển Âm tính mơi trường giữ ngun màu xanh A.3 Đặc tính lên men đường glucose, lactose, sinh H2S Chuẩn bị môi trường TSI Kligler (theo hướng dẫn nhà sản xuất) Dùng que cấy chích sâu (xem 4.8) lấy chuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm chứa môi trường TSI Kligler, rút dần que cấy lên tiếp tục cấy bề mặt nghiêng, nuôi tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h kiểm tra Lên men đường lactoza: - Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng - Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng Lên men đường glucose: - Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng - Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng Khả sinh H2S: - Dương tính: Đáy ống nghiệm có màu đen - Âm tính: Đáy ống nghiệm khơng có màu đen A.4 Đặc tính phân hủy lysine Sử dụng mơi trường có lysine mơi trường lysine decarboxylase broth lysine- iron agar Sử dụng môi trường lysine- iron agar: - Pha chế thạch nghiêng chế từ môi trường Lysine- iron agar theo hướng dẫn nhà sản xuất - Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường pha chế, nuôi tủ ấm (xem 4.1), sau từ 18 đến 24 h kiểm tra - Đọc kết quả: theo dẫn nhà sản xuất Sử dụng môi trường canh thang lysine decarboxylase: - Pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất - Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường pha chế, nuôi tủ ấm (xem 4.1), sau từ 18 đến 24 h kiểm tra - Đọc kết quả: theo dẫn nhà sản xuất A.5 Lên men đường Manitol Chuẩn bị môi trường Pha nước peptone theo dẫn nhà sản xuất Chuẩn bị thị màu andrade: - Thành phần: Axit fucsin 0, g Nước cất 100 ml NaOH 1N 16 ml - Cách pha chế: Nghiền fucsin, hòa vào nước cất cho tan hết Cho từ từ lượng NaOH 1N, vừa cho vừa lắc đến chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm dừng (thường từ 12 đến 17 ml) Để lắng từ đến h, lọc qua giấy lọc Hấp tiệt trùng nồi hấp (xem 4.3) 120 °C 15 Cho ml thị màu Andrade vào 100 ml nước peptone (xem 3.4), chia ml vào ống nghiệm (xem 4.6) Hấp tiệt trùng nồi hấp (xem 4.3) 120 °C 30 Chuẩn bị đường: pha đường thành dung dịch 10% (trong nước cất vô trùng), hấp tiệt trùng nồi hấp (xem 4.3) 110 °C từ 15 đến 20 hấp cách quảng lần 100 °C 30 lọc qua màng lọc (xem 4.7) Pha môi trường nước pepton-đường: cho 0,3 ml dung dịch đường 10% vào ống nghiệm chứa 4ml nước pepton hấp tiệt trùng Cách tiến hành Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào ống môi trường nước peptone-đường, nuôi tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h đọc kết Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển màu đỏ - Phản ứng âm tính: mơi trường khơng đổi màu PHỤ LỤC B (Quy định) Phát vi khuẩn Salmonella phương pháp PCR B.1 Nguyên liệu PCR B.1.1 Taq PCR Master Mix Kit (kit thương mại) B.1.2 Cập mồi (primers): mồi xuôi mồi ngược (Bảng 2) B.1.3 Nước tinh khiết khơng có nuclease B1.4 Dung dịch đệm TAE TBE B.1.5 Ethidi bromua chất nhuộm màu SYBR green B.1.6 Loading dye B.1.7 DNA chuẩn (Ladder, marker) B.2 Chuẩn bị mẫu Mẫu kiểm tra vi khuẩn nghi Salmonella nuôi cấy khiết thạch máu nuôi tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h Đối chứng dương: chủng vi khuẩn giám định Salmonella sử dụng chủng Salmonella chuẩn B.3 Tách chiết DNA Các vi chuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm mẫu đối chứng dương tách chiết DNA kit thương mại hay phương pháp sốc nhiệt Nếu sử dụng kit bước tiến hành theo dẫn nhà sản xuất Tách chiết phương pháp shock nhiệt: Lấy từ khuẩn lạc đến khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water) Đun sôi cách thủy 10 làm lạnh nhanh huyễn dịch đá Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g Thu hoạch phần nước phía để thực phản ứng PCR B.4 Phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi Bảng chuẩn bị mồi nồng độ 20 μM Hỗn hợp phản ứng chuẩn bị ống 0,2 ml Thành phần cho phản ứng (theo hướng dẫn Kit Taq PCR master mix KitQiagen) sau: - Taq PCR Master Mix Kit 12,5 μl - Mồi xuôi 20 μM μl - Mồi ngược 20 μM μl - Nước khơng có nuclease 8,5 μl - Mẫu DNA Tổng thể tích μl 25 μl Chu trình nhiệt Bảng Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Salmonella (xem B.2) Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần phản ứng PCR, khơng có DNA vi khuẩn B.5 Chạy điện di Sản phẩm PCR chạy điện di thạch agarose từ 1,5 % đến % dung dịch đệm TAE TBE Cho μl dung dịch loading dye vào μl sản phẩm PCR, trộn cho vào giếng thạch Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào giếng Bản thạch điện di môi trường dung dịch đệm TAE TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng pha thạch), thời gian từ 30 đến 40 min, 100 V, sau nhuộm thạch (sản phẩm PCR) dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml Có thể dùng chất nhuộm màu khác SYBR green để nhuộm thạch (sản phẩm PCR) sử dụng theo quy định nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain Invitrogen) B.6 Đọc kết Phản ứng dương tính khi: - Mẫu đối chứng dương: Có vạch kích cỡ sản phẩm - Mẫu đối chứng âm: Không xuất vạch - Mẫu kiểm tra: Có vạch giống mẫu đối chứng dương Phản ứng âm tính khi: - Mẫu đối chứng dương: Có vạch kích cỡ sản phẩm - Mẫu đối chứng âm: Không xuất vạch - Mẫu kiểm tra: Không xuất vạch THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] P.J.Quin, M.E.Cater, B Markey, G.R.Cater, 1994 Clinical veterinary microbiology [2] JICA- Third edition, 2003 Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand [3] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy 2012 Bệnh phó thương hàn lợn - Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc Trang 299 - 305 [4] Sổ tay bệnh dịch động vật Copyright text Archie Hunter, 1994, 1996 Text Archie Hunter and SVSV project, 2000 [5] Schwartz, K.J., 1999 Salmonellosis In: Straw, B.E., D'Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J Diseases of Swine, Ames, USA: lowa State University Press, pp 535-552 [6] Leigh A.Corner, Trevor J Bagust, 1993 Australian Standard Diagnostic Technique for animal diseases Standing committee agriculture and resource management [7] SALMONELLOSIS Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2010 [8] Rahn K, De Grandis SA, Clarke RC, McEwen SA, Galán JE, Ginocchio C, Curtiss R 3rd, Gyles CL 1992 Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella Mol Cell Probes 6(4):271-9 [9] Oliveira SD, Rodenbusch CR, Cé MC, Rocha SL, Canal CW 2003 Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection Lett Appl Microbiol 36(4):217-21 [10] Akiba M, Kusumoto M, lwata T 2011 Rapid identification of Salmonella entericaserovars, Typhimurium, Choleraesuis, Infantis, Hadar, Enteritidis, Dublin and Gallinarum, by multiplex PCR J Microbiol Methods 85(1):9-15