Tài liệu GIẢI TRÌNH TỰ GEN doc

Các phương pháp giải trình tự gen Có 2 phương pháp chính: – Phương pháp hoá học Maxam Gilbert: đây là – phương pháp được sử dụng đầu tiên để xác định trình tự gen nhưng hiện nay không c

GI I TRÌNH T GEN Ả Ự

Các phương pháp giải trình tự gen

 Có 2 phương pháp chính:

– Phương pháp hoá học Maxam Gilbert: đây là – phương pháp được sử dụng đầu tiên để xác định trình tự gen nhưng hiện nay không còn đựơc sử dụng phổ biến nữa

– Phương pháp Enzyme Sanger

1 Phương pháp hoá học Maxam - Gilbert

Walter Gilbert

Nguyên lý

 Sử dụng các chất hoá học cắt đứt sợi DNA tại 1 loại nucleotide đặc hiệu

 Phân tử DNA kép được đánh dấu P32 tại đầu 5’

 Tách rời 2 sợi đơn bằng nhiệt

 Xử lý hoá học sao cho chỉ có 1 loại nucleotide bị phá huỷ -> hàng loạt đoạn DNA có kích thước khác nhau

được tạo thành (sử dụng các chất hoá học khác nhau phá huỷ 4 loại nucleotide bằng 4 phản ứng riêng

biệt)

 Tiến hành điện di các đoạn DNA thu đựơc trên gel polyacrylamide, chỉ quan sát đựơc đoạn có gắn P32

 Đoạn DNA ngắn nhất có đánh dấu phóng xạ sẽ chạy nhanh nhất dưới tác dụng của điện trường

 Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên gel mà xác định trình tự các nucleotide

5’-Treat with chemicals that

specifically cleave at a certain base

4 tubes

G-rxn A>G

-rxn C-rxn T>C-rxn

5’-C

The reaction is done such that each

strand is cleaved only once

C T A G

ddNTP Reaction Mix

3’

G C A T T C C A T A G G 5’

MAXAM-GILBERT CHEMICAL

SEQUENCING

Labeled strand (P32)

C

C

Sequence is read directly

autoradiograph of dried sequencing gel

Phá huỷ các nucleotide

Trong phương pháp này sử dụng 5 phản ứng cơ bản:

 Dimethylsulfate ở pH 8.0 sẽ làm thay đổi Guanine (G)

 Piperidine formate ở pH 2.0 sẽ phá vỡ cầu nối

glycoside giữa deoxyribose với purine (G,A)

 Hydrazine: mở các vòng pyrimidine (C , T)

 Hydrazine khi có mặt1.5M NaCl chỉ có tác dụng đối với C

 1.2N NaOH ở 900C sẽ phá huỷ A mạnh và C kém

KÕt qu¶:

Hydrazine in 1.5 M NaCl -> C

1.2 N NaOH at 90 oC -> A and C

G G+A T+C C A>C

1.2 N NaOH at

90 o C

A>C

Hydrazine

T+C

Piperidine formate

pH 2

G+A

Dimethyl sulfate pH 8

G

Hydrazine in 1.5 M NaCl

C

Nhược điểm

 Hoá chất độc

 Cần một lượng lớn chất phóng xạ

 Thiếu sự tự động

 Đôi khi kết quả thu đựơc trên gel không chính xác

2 Phương pháp enzyme Sanger

Fred Sanger

Nguyên lý

 Sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm

OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp DNA

=> phương pháp dideoxy

 Phân tử DNA kép được đánh dấu P32 tại đầu 5

’

 Sợi đôi DNA bị biến tính thành hai sợi đơn và

đựơc lai với mồi (dài vài chục nu, liện kết

đựơc với 1 trong 2 mạch đơn)

 Tiến hành đồng thời 4 phản ứng riêng lẽ với 4 loại dideoxynucleotide khác nhau -> các sợi đơn DNA được tổng hợp có độ dài ngắn khác nhau

 Diện di 4 sản phẩm cùng lúc trên gel

polyacrylamide

 Đọc kết quả.

O

(P)-(P)-(P)-H

Base

O

Base

If a ddNTP is added

to a growing DNA chain, the sequence

is terminated, because another base can not be added

OH

ống phản

ứng A

ống phản ứng C

ống phản ứng G

ống phản ứng T

ddATP

dCTP

dTTP

dGTP

dATP

ddCTP

dCTP dTTP dGTP dATP

ddGTP

dCTP dTTP dGTP dATP

ddTTP

dCTP dTTP dGTP dATP C T A G

ddNTP Reaction Mix

SANGER DIDEOXY SEQUENCING

Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng hợp trong mỗi ống phản ứng.

Đoạn ADN cần giải trình tự

3’ CCTATGGAATGC-5’ ……….

*

*

*

*

*

*

* ống phản ứng A

ống phản ứng C

*

* ống phản ứng G

ống phản ứng T

Mồi Sequencing

Phương pháp dideoxy cải tiến

 Phương pháp dideoxy có thể được cải tiến để thực hiện các phản ứng trong cùng một ống nghiệm.

 Lúc này, các ddNTP sẽ được đánh dấu bằng các phân tử phát huỳnh quang màu khác

nhau

Ưu điểm của phương pháp cải tiến

 Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tự động hoá.

 Giảm giá thành phản ứng

 Tăng tốc độ phản ứng

=> Nhiều trung tâm giải trình tự gen đã sử dụng phương pháp này và họ có thể đọc được

hàng triệu bp mỗi ngày.