Tài liệu GIẢI TRÌNH TỰ GEN doc

GI I TRÌNH T GENẢ Ự Các phơng pháp giải trình tự gen Có 2 phơng pháp chính: Phơng pháp hoá học Maxam Gilbert: đây là phơng pháp đợc sử dụng đầu tiên để xác định trình tự gen nhng hiện nay không còn đựơc sử dụng phổ biến nữa. Phơng pháp Enzyme Sanger 1. Ph¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam - Gilbert Walter Gilbert Nguyên lý Sử dụng các chất hoá học cắt đứt sợi DNA tại 1 loại nucleotide đặc hiệu Phân tử DNA kép đợc đánh dấu P 32 tại đầu 5 Tách rời 2 sợi đơn bằng nhiệt Xử lý hoá học sao cho chỉ có 1 loại nucleotide bị phá huỷ -> hàng loạt đoạn DNA có kích thớc khác nhau đợc tạo thành (sử dụng các chất hoá học khác nhau phá huỷ 4 loại nucleotide bằng 4 phản ứng riêng biệt) Tiến hành điện di các đoạn DNA thu đựơc trên gel polyacrylamide, chỉ quan sát đựơc đoạn có gắn P 32 . Đoạn DNA ngắn nhất có đánh dấu phóng xạ sẽ chạy nhanh nhất dới tác dụng của điện trờng. Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát đợc trên gel mà xác định trình tự các nucleotide. 5’- Treat with chemicals that specifically cleave at a certain base. 4 tubes G-rxn A>G -rxn T>C -rxn C-rxn 5’- 5’- 5’- C The reaction is done such that each strand is cleaved only once C T A G ddNTP Reaction Mix 3’ G C A T T C C A T A G G 5’ MAXAM-GILBERT CHEMICAL SEQUENCING Labeled strand (P32) C C Sequence is read directly autoradiograph of dried sequencing gel Phá huỷ các nucleotide Trong phơng pháp này sử dụng 5 phản ứng cơ bản: Dimethylsulfate ở pH 8.0 sẽ làm thay đổi Guanine (G). Piperidine formate ở pH 2.0 sẽ phá vỡ cầu nối glycoside giữa deoxyribose với purine (G,A) Hydrazine: mở các vòng pyrimidine (C , T) Hydrazine khi có mặt1.5M NaCl chỉ có tác dụng đối với C 1.2N NaOH ở 90 0 C sẽ phá huỷ A mạnh và C kém. KÕt qu¶: Dimethylsulfate at pH 8.0 > G Piperidine formate at pH 2.0 > G and A Hydrazine > C and T Hydrazine in 1.5 M NaCl > C 1.2 N NaOH at 90 o C > A and C 5’ GACGTACTTA 3’ G G+A T+C C A>C G G+A T+C C A>C 1.2 N NaOH at 90 o C A>C Hydrazine T+C Piperidine formate pH 2 G+A Dimethyl sulfate pH 8 G Hydrazine in 1.5 M NaCl C X X X X X X 5’ to 3’ Nhîc ®iÓm  Ho¸ chÊt ®éc  CÇn mét lîng lín chÊt phãng x¹  ThiÕu sù tù ®éng  §«i khi kÕt qu¶ thu ®ù¬c trªn gel kh«ng chÝnh x¸c [...]... nghiệm Lúc này, các ddNTP sẽ được đánh dấu bằng các phân tử phát huỳnh quang màu khác nhau Ưu điểm của phương pháp cải tiến Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tự động hoá Giảm giá thành phản ứng Tăng tốc độ phản ứng => Nhiều trung tâm giải trình tự gen đã sử dụng phương pháp này và họ có thể đọc được hàng triệu bp mỗi ngày ... dATP dCTP dGTP dTTP ddCTP dATP dCTP dGTP dTTP ddGTP dATP dCTP dGTP dTTP ddATP ứng T dATP dCTP dGTP dTTP ddTTP C T A G Đoạn ADN cần giải trình tự Mồi Sequencing 3 5 .CCTATGGAATGC- ống phản ứng A * * ** * phản ứng C ống * ** ống phản ứng G * * ống phản ứng T ** Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng hợp trong mỗi ống phản ứng Phương pháp dideoxy cải tiến Phương pháp dideoxy có thể được cải tiến để thực . DIDEOXY SEQUENCING Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng hợp trong mỗi ống phản ứng. Đoạn ADN cần giải trình tự Đoạn ADN cần giải trình tự 3 CCTATGGAATGC- 3 CCTATGGAATGC- 5 5 . . * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ống. GI I TRÌNH T GEN Ự Các phơng pháp giải trình tự gen Có 2 phơng pháp chính: Phơng pháp hoá học Maxam