Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 19 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Cấu trúc
GII TRèNH T GEN
Các phương pháp giải trình tự gen
1. Phương pháp hoá học Maxam - Gilbert
Nguyên lý
Slide 5
Slide 6
Phá huỷ các nucleotide
Slide 8
Slide 9
Nhược điểm
2. Phương pháp enzyme Sanger
Slide 12
Slide 13
Dideoxy-Nucleotides
Slide 15
Phương pháp dideoxy cải tiến
Ưu điểm của phương pháp cải tiến
Slide 18
Slide 19
Nội dung
GI I TRÌNH T GENẢ Ự
Các phơng pháp giải trìnhtự gen
Có 2 phơng pháp chính:
Phơng pháp hoá học Maxam Gilbert: đây là
phơng pháp đợc sử dụng đầu tiên để xác định
trình tựgen nhng hiện nay không còn đựơc sử
dụng phổ biến nữa.
Phơng pháp Enzyme Sanger
1. Ph¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam - Gilbert
Walter Gilbert
Nguyên lý
Sử dụng các chất hoá học cắt đứt sợi DNA tại 1 loại
nucleotide đặc hiệu
Phân tử DNA kép đợc đánh dấu P
32
tại đầu 5
Tách rời 2 sợi đơn bằng nhiệt
Xử lý hoá học sao cho chỉ có 1 loại nucleotide bị phá
huỷ -> hàng loạt đoạn DNA có kích thớc khác nhau
đợc tạo thành (sử dụng các chất hoá học khác nhau
phá huỷ 4 loại nucleotide bằng 4 phản ứng riêng
biệt)
Tiến hành điện di các đoạn DNA thu đựơc trên gel
polyacrylamide, chỉ quan sát đựơc đoạn có gắn P
32
.
Đoạn DNA ngắn nhất có đánh dấu phóng xạ sẽ chạy
nhanh nhất dới tác dụng của điện trờng.
Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát đợc trên gel mà
xác định trìnhtự các nucleotide.
5’-
Treat with
chemicals that
specifically
cleave at a
certain base.
4 tubes
G-rxn
A>G
-rxn
T>C
-rxn
C-rxn
5’-
5’-
5’-
C
The reaction is done such that each
strand is cleaved only once
C T A G
ddNTP Reaction Mix
3’
G
C
A
T
T
C
C
A
T
A
G
G
5’
MAXAM-GILBERT CHEMICAL
SEQUENCING
Labeled strand (P32)
C
C
Sequence is read directly
autoradiograph of
dried sequencing gel
Phá huỷ các nucleotide
Trong phơng pháp này sử dụng 5 phản ứng cơ bản:
Dimethylsulfate ở pH 8.0 sẽ làm thay đổi Guanine
(G).
Piperidine formate ở pH 2.0 sẽ phá vỡ cầu nối
glycoside giữa deoxyribose với purine (G,A)
Hydrazine: mở các vòng pyrimidine (C , T)
Hydrazine khi có mặt1.5M NaCl chỉ có tác dụng đối
với C
1.2N NaOH ở 90
0
C sẽ phá huỷ A mạnh và C kém.
KÕt qu¶:
Dimethylsulfate at pH 8.0 > G
Piperidine formate at pH 2.0 > G and A
Hydrazine > C and T
Hydrazine in 1.5 M NaCl > C
1.2 N NaOH at 90
o
C > A and C
5’
GACGTACTTA
3’
G G+A T+C C A>C
G G+A T+C C A>C
1.2 N
NaOH at
90
o
C
A>C
Hydrazine
T+C
Piperidine
formate
pH 2
G+A
Dimethyl
sulfate pH
8
G
Hydrazine in
1.5 M NaCl
C
X
X
X
X
X
X
5’ to 3’
Nhîc ®iÓm
Ho¸ chÊt ®éc
CÇn mét lîng lín chÊt phãng x¹
ThiÕu sù tù ®éng
§«i khi kÕt qu¶ thu ®ù¬c trªn gel kh«ng chÝnh
x¸c
[...]... nghiệm Lúc này, các ddNTP sẽ được đánh dấu bằng các phân tử phát huỳnh quang màu khác nhau Ưu điểm của phương pháp cải tiến Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tự động hoá Giảm giá thành phản ứng Tăng tốc độ phản ứng => Nhiều trung tâm giải trìnhtựgen đã sử dụng phương pháp này và họ có thể đọc được hàng triệu bp mỗi ngày ... dATP dCTP dGTP dTTP ddCTP dATP dCTP dGTP dTTP ddGTP dATP dCTP dGTP dTTP ddATP ứng T dATP dCTP dGTP dTTP ddTTP C T A G Đoạn ADN cần giải trìnhtự Mồi Sequencing 3 5 .CCTATGGAATGC- ống phản ứng A * * ** * phản ứng C ống * ** ống phản ứng G * * ống phản ứng T ** Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng hợp trong mỗi ống phản ứng Phương pháp dideoxy cải tiến Phương pháp dideoxy có thể được cải tiến để thực . DIDEOXY SEQUENCING
Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng
hợp trong mỗi ống phản ứng.
Đoạn ADN cần giải trình tự
Đoạn ADN cần giải trình tự
3 CCTATGGAATGC-
3 CCTATGGAATGC-
5
5
.
.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ống. GI I TRÌNH T GEN Ự
Các phơng pháp giải trình tự gen
Có 2 phơng pháp chính:
Phơng pháp hoá học Maxam