VanBanGoc_16.2014.TTLT.BNNPTNT.627_628

Ký bởi: Cổng Thơng tin điện tử Chính phủ Email: thongtinchinhphu@chinhphu.vn Cơ quan: Văn phịng Chính phủ Thời gian ký: 04.07.2014 08:41:45 +07:00 CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 PHẦN VĂN BẢN QUY PHẠM PHÁP LUẬT BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NƠNG THƠN Thơng tư số 16/2014/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng năm 2014 ban hành Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia Kiểm dịch Bảo vệ thực vật (Tiếp theo Công báo số 625 + 626) CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM QCVN 01-173:2014/BNNPTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH KHÔ CÀNH CAM QUÝT Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Mal secco (Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili) - Plant quarantine pest of Vietnam HÀ NỘI - 2014 CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 Lời nói đầu QCVN 01-173:2014/BNNPTNT Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nơng nghiệp & PTNT ban hành Thông tư số 16/2014/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng năm 2014 CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH KHƠ CÀNH CAM QT Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Mal secco (Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili) - Plant quarantine pest of Vietnam I QUY ĐỊNH CHUNG 1.1 Phạm vi điều chỉnh Quy chuẩn quy định quy trình giám định bệnh khơ cành cam qt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I Việt Nam 1.2 Đối tượng áp dụng Quy chuẩn áp dụng tổ chức, cá nhân Việt Nam nước ngồi có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ kiểm dịch thực vật thực giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV Việt Nam 1.3 Giải thích từ ngữ Trong quy chuẩn này, từ ngữ hiểu sau: 1.3.1 Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest) Là lồi dịch hại có nguy gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật vùng mà loài sinh vật chưa xuất xuất có phân bố hẹp phải kiểm sốt thức 1.3.2 Thực vật (plant) Là phận sống, kể hạt giống sinh chất có khả làm giống 1.3.3 Mẫu (sample) Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật tàn dư sản phẩm thực vật lấy theo quy tắc định 1.3.4 Tiêu (specimen) Là mẫu vật điển hình tiêu biểu dịch hại xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật trưng bày thành sưu tập 1.3.5 Phản ứng chuỗi trùng hợp phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR) Là kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 II QUY ĐỊNH KỸ THUẬT 2.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu 2.1.1 Thu thập mẫu Đối với hàng xuất, nhập khẩu, cảnh vận chuyển, bảo quản nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:891 “Kiểm dịch thực vật phương pháp lấy mẫu”, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-22:2010/BNNPTNT1 “Phương pháp kiểm tra xuất nhập cảnh” Đối với trồng đồng ruộng: Lấy mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT1 “Phương pháp điều tra phát dịch hại trồng” 2.1.2 Bảo quản mẫu Các phận tươi có triệu chứng bệnh (cành, lá, thân) chứa túi ni-lông có lỗ thơng khí bảo quản tủ lạnh nhiệt độ - 5°C Các tiêu lam nấm dán nhãn, để hộp chuyên dụng đựng tiêu lam bảo quản nhiệt độ phòng 2.2 Thiết bị dụng cụ, hóa chất Kính lúp soi có độ phóng đại 10 - 40 lần, kính hiển vi có độ phóng đại 40 1.000 lần Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện, máy trộn dịch, máy PCR, máy điện di, buồng tối máy chụp ảnh Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, piptet, găng tay, đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong, ống ly tâm 1.5ml Cồn 70°, cồn tuyệt đối, parafin, lactophenol blue, acid acetic, nước cất vô trùng Nitơ lỏng, NaCl, phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), chloroform, isopropanol, Proteinase K, Tris-HCl, EDTA, SDS MgCl2 ,KCl, dNTP, mồi, Taq DNA polymerase, agarose 2.3 Phương pháp phát giám định bệnh 2.3.1 Phát thu thập mẫu bệnh Khi bị nhiễm bệnh gân trở nên (gân gân phụ), cong biến vàng, chồi non bị biến vàng Sau rụng cịn lại cuống lá, cành bị héo bị chết (hình đến hình 4, phụ lục 1) Đôi rụng gân gân phụ biến thành màu đỏ Cành bị bệnh có màu nâu màu nâu nhạt bị nứt bệnh nặng đoạn thân cành khơ, có màu xám tro, mặt vết bệnh có hạt nhỏ màu đen (hình 5, phụ lục 1) Trên thân nhiễm bệnh, cắt ngang mô hóa màu hồng nâu với mơ già (hình 6, phụ lục 1) Trường hợp văn viện dẫn quy chuẩn sửa đổi, bổ sung thay thực theo quy định văn CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 2.3.2 Phương pháp giám định đặc điểm hình thái nấm gây bệnh 2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra trực tiếp Bào tử cành nấm P tracheiphila quan sát trực tiếp kính hiển vi quang học Để quan sát rõ cấu trúc bào tử cành nhuộm lactophenol blue Dùng kim khêu nấm khêu bào tử nấm cành trực tiếp từ phận bị phần nghi ngờ nhiễm bệnh có triệu chứng điển hình, đặt lên lam có 01 giọt lactophenol đậy lamen Đặt lam lên kính hiển vi quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm so sánh với đặc điểm bào tử nấm P tracheiphila (phụ lục 1) 2.3.2.2 Phương pháp để ẩm Các cành khơ, mẩu thân có triệu chứng bệnh (trên cành có vùng khơ màu xám chì xám tro, thân mà mạch dẫn hóa màu hồng) để ẩm 12 - 24 Sau dùng kim khêu nấm khêu bào tử trực tiếp từ phần nghi ngờ nhiễm bệnh, đặt lên lam có 01 giọt lactophenol Đặt lam lên kính hiển vi tìm, quan sát đặc điểm hình thái, đo kích thước bào tử nấm Quan sát kính hiển vi so sánh với đặc điểm bào tử nấm P tracheiphila (phụ lục 1) 2.3.2.3 Phương pháp phân lập nấm từ vật liệu nhiễm bệnh Cắt phần rìa vết bệnh đoạn thân, cành khoảng 20-100mm nhúng vào cồn tuyệt đối Sau đó, đốt đoạn thân đèn cồn Khi lửa tắt dùng dao khử trùng cắt ngang dọc đoạn thân, cành thành lát mỏng Nuôi cấy lát mỏng môi trường PDA CPA 22 - 240C Sau - ngày, kiểm tra sắc tố nấm tiết đĩa môi trường cách soi đĩa lên ánh sáng (hình 9, phụ lục 1) Tiếp theo, cấy truyền làm nấm Khêu mẫu nấm từ môi trường nuôi cấy đưa lên lam quan sát kính hiển vi Quan sát đặc điểm hình thái bào tử nấm thu So sánh với đặc điểm hình thái bào tử nấm P tracheiphila (phụ lục 1) 2.3.3 Phương pháp giám định PCR Sử dụng phương pháp PCR để giám định nấm P tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili gây bệnh khơ cành cam qt Quy trình chi tiết phụ lục III THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO Sau khẳng định kết giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili - dịch hại kiểm dịch thực vật Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết giám định (phụ lục 4) Tất đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ KDTV phải lưu giữ, quản lý khai thác liệu kết điều tra, báo cáo giám định bệnh khơ cành cam qt CƠNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 Đối với đơn vị lần giám định phát bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili phải gửi mẫu tiêu Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hành IV TỔ CHỨC THỰC HIỆN Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn kiểm tra việc thực Quy chuẩn hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ Kiểm dịch thực vật tổ chức, cá nhân khác có liên quan Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý bảo quản mẫu bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili Việt Nam phải tuân theo quy định quy chuẩn quy định pháp luật có liên quan hành CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 Phụ lục Thông tin dịch hại Phân bố ký chủ 1.1 Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có Việt Nam Trên giới: Châu Á (Armenia, Georgia, Iraq, Lebanon, Syria, Israel, Thổ Nhĩ Kì, Yemen), Châu Phi (Tunisia, Ai Cập, Libya, Algeria), Châu Âu (Hy Lạp, Albania, Hy Lạp, Italy, Liên Bang Nga, Cyprus, Pháp, Bỉ, Hà Lan) 1.2 Ký chủ: Hầu hết loài thuộc họ Citrus mẫn cảm với bệnh chanh (Citrus limon) loài bị hại nặng Các loài ký chủ khác Phật thủ (Citrus medica), Citrus bergamia, Quýt (Citrus reticulata), Cam chua (Citrus aurantium), Citrofortunella microcarpa , Citrus aurantiifolia, Citrus jambhiri, Citrus latifolia, Citrus limonia, Citrus macrophylla, Citrus sinensis, Citrus unshiu, Citrus x paradisi, Quất (Fortunella) , Poncirus trifoliata Tên khoa học vị trí phân loại Tên tiếng Việt: Bệnh khô cành cam quýt Tên khoa học: Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili Tên khác: Bakerophoma tracheiphila (Petri) Cif Deuterophoma tracheiphila Petri Vị trí phân loại: Lớp: Dothideomycetes Bộ: Pleosporales Họ: Pleosporaceae Triệu chứng bệnh khơ cành cam qt Hình Triệu chứng bệnh khô cành cam quýt P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) Hình Lá rụng cịn lại cuống bệnh khơ cành cam qt P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) CƠNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 Hình Cành héo bệnh khô cành cam quýt P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) Hình Vết bệnh có chứa cành nấm P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) Hình Chết bệnh khô cành cam quýt P tracheiphila (Nguồn: PaDIL, 2012) Hình Triệu chứng bó mạch hóa hồng bệnh khô cành cam quýt (Nguồn: PaDIL, 2012) Đặc điểm hình thái bào tử nấm P tracheiphila Quả cành hình cầu, kéo dài thành cổ ngắn có miệng nhỏ, màu đen đường kính 60-165 x 45-150μm (hình 7, phụ lục 1) Các bào tử phân sinh nằm cành dạng đơn bào, kích thước 0,5-1,5 x 2-4μm Bào tử phân sinh sinh từ tế bào sinh bào tử Bào tử phân sinh (phialoconidia) đơn bào thường có đến giọt dầu màu suốt, dạng thẳng cong, đầu bào tử tròn kích thước 1,5-3 x 3-8μm thường sản sinh tế bào sinh bào tử sợi nấm tự phát triển vùng gỗ thân lộ ngồi, phần mơ bị thương mạch dẫn (hình 8, phụ lục 1) Bào tử đính dạng chồi (blastoconidia) có dạng trứng dạng lê sinh từ mạch dẫn ký chủ mơi trường ni cấy nhân tạo lỏng 10 CƠNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 Hình Quả cành nấm P tracheiphila (Nguồn: S Grasso, 1992) Hình Bào tử (phialoconidia) P tracheiphila (Nguồn: EPPO, 2004) Hình Sắc tố đỏ đĩa đặt lát cành nhiễm bệnh khô cành môi trường PDA (Nguồn: PaDIL, 2009) CÔNG BÁO/Số 627 + 628/Ngày 28-6-2014 11 Phụ lục (quy định) Quy trình giám định bệnh khơ cành cam quýt PCR Tách chiết DNA tổng số 1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mô (mô gỗ, cành, lá) Nghiền 500mg mô chày cối sứ nitơ lỏng Chuyển 100mg mô nghiền vào ống eppendorf chứa 450μl dịch chiết Trộn máy trộn dịch Ủ 65oC giờ.Thêm vào ống 300μl NaCl 6M trộn máy trộn dịch Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu dịch vào ống Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) vào ống với thể tích tương đương trộn máy trộn dịch Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu dịch Thêm chloroform vào ống với thể tích tương đương trộn máy trộn dịch Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu dịch Thêm isopropanol vào ống thể tích tương đương Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch Thêm vào ống 100μl Ethanol 70% để rửa tủa DNA Loại bỏ Ethanol để tủa DNA khô tự nhiên 10 phút Hòa tan tủa DNA 100μl TE pH8 bảo quản 4oC 1.2 Tách chiết DNA tổng số từ sợi nấm nuôi cấy môi trường Dùng kim khêu nấm vô trùng chuyển sợi nấm từ đĩa nuôi cấy vào ống eppendorf Nghiền nhỏ nấm chày nhựa vô trùng nitơ lỏng Chuyển hỗn hợp nghiền vào ống eppendorf chứa 400μl dịch chiết nấm Trộn máy trộn dịch Thêm vào ống 8μl Proteinase K 20mg/ml lắc nhẹ Ủ 65 oC qua đêm.Thêm vào 300μl NaCl 6M trộn máy trộn dịch 30 giây Ly tâm 13.000 vịng/phút 30 phút thu dịch phía Thêm isopropanol vào ống với thể tích tương đương lắc nhẹ Ủ -20oC lâu Ly tâm 13.000 vòng/phút 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch Thêm vào 100μl Ethanol 70% để rửa tủa DNA Loại bỏ ethanol, để tủa DNA khô tự nhiên 10 phút Hòa tan tủa DNA 100μl TE pH8 bảo quản 4oC Nhân gen máy PCR Đoạn mồi sử dụng Pt-FOR2 (5′-GGATGGGCGCCAGCCTTC-3′) Pt-REV2 (5′-GCACAAGGGCAGTGGACAAA-3′) Master mix: 25μl phản ứng 1.5mM MgCl2, 50mM KCl; 200μM loại dATP, dCTP, dGTP dTTP 1.0μM mồi 10ng DNA tách chiết 0.8μl Taq DNA polymerase