Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 theo tháng
- Xác định clade của các chủng virus cúm A/H5N1 thu được thông qua giải trình tự gen HA
- Xác định độc lực của các chủng virus cúm A/H5N1 thu được thông qua xác định trình tự axit amin của chuỗi nối protein HA
- Địa điểm lấy mẫu: Các chợ buôn bán gia cầm sống tại tỉnh Vĩnh Long
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương
Trong năm 2016, mẫu swab hầu họng của gà và vịt được thu thập từ các chợ buôn bán gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long Mỗi tháng, 90 mẫu swab (bao gồm 30 mẫu từ gà và 60 mẫu từ vịt) đã được lấy tại 3 chợ thuộc 3 huyện đã ghi nhận dịch cúm vào năm 2015.
+ Đầu type cú lọc 30àl, 200àl, 1000 àl;
+ Kít tách chiết ARN: Bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep;
+ Mastermix: Sử dụng kít Realtime RT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR;
+ PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen);
+ Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1
3.4.1 Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARNbằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106
250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5ml cùng với 600l Qiagen buffer RLT có 1% -ME, lắc đều bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ
- Thêm 500 l etanol 70% vào ống, lắc đều bằng máy trộn rồi ly tâm nhẹ
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc
- Nhỏ 500l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu
Để chuẩn bị cột lọc cho ống thu ARN, đầu tiên hãy đặt cột lọc vào ống thu ARN và thêm 50 l nước sạch nuclease vào cột Sau đó, ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó loại bỏ cột lọc và giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
Để bảo quản mẫu ARN trước khi thực hiện RT-PCR, cần giữ mẫu ở nhiệt độ 4 độ C trong thời gian ngắn Nếu thời gian giữa các lần phản ứng vượt quá 24 giờ, nên chuyển mẫu sang bảo quản ở âm 20 độ C hoặc nhiệt độ thấp hơn để đảm bảo chất lượng.
3.4.1.2 Phương pháp Realtime RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1
Phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) được thực hiện với các cặp mồi và probe được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, theo quy trình chẩn đoán TCVN 8400-26:2014.
Bảng 3.1 Các primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1 Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT
Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T
Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
+ Các primer M để xác định virus cúm A
+ Các primer H5 để xác định gen H5
+ Các primer N1 để xác định gen N1
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng Realtime RT-PCR
Hỗn hợp phản ứng Lượng dựng cho 1 phản ứng (àl)
- Chu trình nhiệt của phản ứng:
+ Chu trình 40 vòng: 95 o C trong 10 giây + 58 o C trong 50 giây
3.4.2 Phương pháp giải trình tự gen
3.4.2.1 Phương pháp nhân gen HA
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3) (Hoffmann et al., 2001)
Bảng 3.3 Trình tự primer để nhân gen HA Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat
No 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4)
Để thực hiện quy trình nhiệt độ, có thể áp dụng các vòng như sau: Vòng đầu tiên gồm 95 °C trong 10 giây, sau đó 61 °C trong 30 giây và 68 °C trong 1 phút Vòng thứ hai tương tự với 95 °C trong 10 giây, nhưng ở giai đoạn 30 giây chỉ cần 59 °C và 68 °C trong 1 phút Vòng thứ ba giảm thêm với 95 °C trong 10 giây, 57 °C trong 30 giây và 68 °C trong 1 phút Cuối cùng, quy trình 35 vòng thực hiện với 95 °C trong 10 giây, 55 °C trong 30 giây và giữ ở 68 °C trong 1 phút.
Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dựng cho 1 phản ứng (àl)
3.4.2.2 Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment)
Sử dụng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis), chúng tôi đã dựng cây phả hệ cho virus cúm dựa trên chuỗi gen HA bằng phương pháp Neighbor-joining (NJ) Cây phả hệ này được so sánh với các virus cúm A/H5N1 thuộc các clade khác nhau, với gốc là virus clade 0 (A/goose/Guangdong/1/96) Phương pháp phân tích và xử lý số liệu được thực hiện để đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả.
Sử dụng phần mềm Exel và Minitab để thống kê, phân tích, xử lý các số liệu.
Vật liệu nghiên cứu
Trong năm 2016, mẫu swab hầu họng của gà và vịt được thu thập tại các chợ gia cầm ở tỉnh Vĩnh Long Mỗi tháng, 90 mẫu (bao gồm 30 mẫu từ gà và 60 mẫu từ vịt) được lấy từ 3 chợ thuộc 3 huyện đã ghi nhận dịch cúm vào năm 2015.
+ Đầu type cú lọc 30àl, 200àl, 1000 àl;
+ Kít tách chiết ARN: Bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep;
+ Mastermix: Sử dụng kít Realtime RT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR;
+ PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen);
+ Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARNbằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106
250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5ml cùng với 600l Qiagen buffer RLT có 1% -ME, lắc đều bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ
- Thêm 500 l etanol 70% vào ống, lắc đều bằng máy trộn rồi ly tâm nhẹ
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc
- Nhỏ 500l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu
Để chuẩn bị ống thu ARN, trước tiên đặt cột lọc vào ống và thêm 50 µl nước sạch nuclease vào cột Sau đó, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút Cuối cùng, loại bỏ cột lọc và giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
Để đảm bảo chất lượng mẫu ARN trước khi thực hiện RT-PCR, cần bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4 độ C trong thời gian ngắn Nếu thời gian bảo quản vượt quá 24 giờ, nên chuyển mẫu sang bảo quản ở âm 20 độ C hoặc nhiệt độ thấp hơn.
3.4.1.2 Phương pháp Realtime RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1
Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) với các cặp mồi và probe được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, theo quy trình chẩn đoán TCVN 8400-26:2014.
Bảng 3.1 Các primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1 Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT
Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T
Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
+ Các primer M để xác định virus cúm A
+ Các primer H5 để xác định gen H5
+ Các primer N1 để xác định gen N1
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng Realtime RT-PCR
Hỗn hợp phản ứng Lượng dựng cho 1 phản ứng (àl)
- Chu trình nhiệt của phản ứng:
+ Chu trình 40 vòng: 95 o C trong 10 giây + 58 o C trong 50 giây
3.4.2 Phương pháp giải trình tự gen
3.4.2.1 Phương pháp nhân gen HA
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3) (Hoffmann et al., 2001)
Bảng 3.3 Trình tự primer để nhân gen HA Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat
No 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4)
Trong quy trình nhiệt độ, có các bước cụ thể như sau: 1 vòng đầu tiên bao gồm 95 °C trong 10 giây, tiếp theo là 61 °C trong 30 giây và 68 °C trong 1 phút Vòng thứ hai tương tự với 95 °C trong 10 giây, nhưng giảm xuống 59 °C trong 30 giây và giữ 68 °C trong 1 phút Vòng thứ ba cũng bắt đầu với 95 °C trong 10 giây, tiếp theo là 57 °C trong 30 giây và 68 °C trong 1 phút Cuối cùng, trong chu trình 35 vòng, nhiệt độ được duy trì ở 95 °C trong 10 giây, giảm xuống 55 °C trong 30 giây và giữ ở 68 °C trong 1 phút.
Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dựng cho 1 phản ứng (àl)
3.4.2.2 Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment)
Sử dụng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis), chúng tôi đã dựng cây phả hệ cho virus cúm bằng chuỗi gen HA, áp dụng phương pháp Neighbor-joining (NJ) Cây phả hệ này được so sánh với các virus cúm A/H5N1 từ các clade khác nhau, với gốc là virus clade 0 (A/goose/Guangdong/1/96) Phương pháp phân tích và xử lý số liệu được thực hiện để đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả.
Sử dụng phần mềm Exel và Minitab để thống kê, phân tích, xử lý các số liệu.
