(LUẬN văn THẠC sĩ) đánh giá đặc điểm sinh trưởng, năng suất và hàm lượng anthocyanin của một số dòng lúa đen mới chọn tạo

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐÀO THỊ NHƯ QUỲNH ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG, NĂNG SUẤT VÀ HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA ĐEN MỚI CHỌN TẠO Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Hữu Tơn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2018 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu trình bày khóa luận tốt nghiệp trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, Ngày 31 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đào Thị Như Quỳnh i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, nỗ lực phấn đấu thân, tơi cịn nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn tận tình cá nhân, tập thể đơn vị khác Nhân dịp hoàn thành luận văn cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Hữu Tôn (người hướng dẫn khoa học) thầy giáo ThS Nguyễn Quốc Trung dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban quản lý đào tạo, thầy giáo, cô giáo cán Bộ môn Sinh học phân tửvà CNSH ứng dụng-Khoa Công nghệ sinh học-Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu trồng Việt Nam-Nhật Bản tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình dạy bảo tơi suốt năm học qua Tôi xin chân thành cảm ơn bạn sinh viên (Tống Thị Khánh DươngK58CHSNB; Phan Thị Kiều Anh-K58CNSHE) nhóm nghiên cứu khoa học mơn sinh phân tửvà CNSH ứng dụngđã tham gia giúp đỡ nhiều trình thực đề tài Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới người thân gia đình tồn thể bạn bè ln bên, chăm sóc, động viên, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn Thạc sĩ Hà Nội, Ngày 31 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đào Thị Như Quỳnh ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục đồ thị, hình, sơ đồ, ảnh vii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Đặc điểm sinh trưởng phát triển lúa 2.1.1 Giới thiệu lúa 2.1.2 Cây lúa đen 2.1.3 Các giai đoạn phát triển 2.1.4 Năng suất yếu tố ảnh hưởng tới suất 2.2 Anthocyanin 11 2.2.1 Cấu tạo hạt lúa 11 2.2.2 Giới thiệu chung anthocyanin 12 2.2.3 Cấu trúc hóa học anthocyanin 13 2.2.4 Tính chất anthocyanin 14 2.2.5 Sự tổng hợp anthocyain gạo 16 2.2.6 Vai trò anthocyanin 19 2.2.7 Sự phân bố anthocyanin 22 2.3 Cơ sở di truyền trình tổng hợp anthocyanin 24 2.4 Công tác chọn tạo giống lúa đen 27 2.4.1 Tình hình chọn tạo giống lúa đen giới Việt Nam 27 iii download by : skknchat@gmail.com Phấn Vật liệu phương pháp 31 3.1 Vật liệu, hóa chất, trang thiết bị nghiên cứu 31 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 31 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 32 3.2.1 Thời gian 32 3.2.2 Địa điểm 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.4 Phương pháp nghiên cứu 32 3.4.1 Thí nghiệm đồng ruộng 32 3.4.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học đo suất 33 3.4.3 Phương pháp đo anthocyanin 35 3.4.4 Phương pháp xác định gen Rc Rd 35 3.4.5 Phương pháp đo mức độ chống oxy hóa 37 Phần Kết thảo luận 40 4.1 Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học 40 4.2 Kết đánh giá suất 43 4.3 Kết xác định hàm lượng anthocyanin 48 4.3.1 Màu sắc thân, lá, vỏ, hạt lúa 48 4.3.2 Kết đánh giá hàm lượng anthocyanin 51 4.4 Kết xác định gen Rc gen Rd 58 4.4.1 Kết xác định gen Rc 58 4.4.2 Kết xác định gen Rd 59 4.5 Kết xác định khả chống oxi hóa 64 4.6 Thảo luận 68 Phần Kết luận kiến nghị 69 5.1 Kết luận 70 5.2 Kiến nghị 70 Tài liệu tham khảo 71 Phụ lục 75 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AC Anthocyanin bHLH Basic helix-loop-helix CT Công thức DFR Dihydroflavonol-4-reductase DNA Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2 -diphenyl -1-picrylhydrazyl MAS Marker Assisted-Selection PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative trait loci RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SD Standard Deviation- Độ lệch chuẩn SSR Simple Sequence Repeat v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Màu sắc anthocyanin môi trường pH khác 15 Bảng 2.2 Các anthocyanin số nguồn thực vật 23 Bảng 2.3 Các gen lúa tham gia vào tổng hợp flavonoid 24 Bảng 3.1 Danh sách 36 dòng/giống lúa nghiên cứu 31 Bảng 3.2 Trình tự primer PCR 37 Bảng 3.3 Điều kiện nhiệt độ chu kỳ PCR 37 Bảng 4.1 Các đặc điểm nông sinh học dòng 40 Bảng 4.2 Các yếu tố cấu thành nên suất 43 Bảng 4.3 Năng suất dòng 47 Bảng 4.4 Các nhóm dòng phân theo màu sắc vỏ lụa 51 Bảng 4.5 Kết xác định hàm lượng anthocyanin 36 dòng lúa đen 52 Bảng 4.6 Nhóm mẫu giống phân theo hàm lượng anthocyanin (%) 54 Bảng 4.7 Hàm lượng anthocyanin màu sắc vỏ lụa 36 dòng lúa đen 56 Bảng 4.8 Bảng so sánh tương quan có mặt gen Rc với hàm lượng anthocyanin 60 Bảng 4.9 Phần trăm loại bỏ DPPH 10 dòng lúa đen 65 Bảng 4.10 Giá trị IC50 10 mẫu AC lúa đen 66 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH, SƠ ĐỒ, ẢNH Hình 2.1 Mơ hình lúa Hình 2.2 Hình dạng hạt thóc Hình 2.3 Cánh đồng lúa nếp than Yên Bái - Hà Giang Hình 2.4 Sơ đồ phát triển lúa Hình 2.5 Cấu tạo hạt lúa 11 Hình 2.6 Hình Cấu tạo vỏ trấu 12 Hình 2.7 Cấu trúc anthocyanidin anthocyanin 13 Hình 2.8 Thay đổi cấu trúc, màu sắc anthocyanin môi trường pH khác 15 Hình 2.9 Con đường sinh tổng hợp anthocyanin 17 Hình 2.10 Sự tạo phức cyanidin DNA 20 Hình 2.11 Kiểu hình đồ chi tiết Rc 25 Hình 2.12 Sơ đồ mơ tả vị trí tương đối marker DNA locus Rc nhiễm sắc thể số 26 Hình 2.13 Gạo đen Trung Quốc 27 Hình 2.14 Kết phép lai giống Koshihikari với giống Hong Xie Nuo 28 Hình 2.15 Giống Nếp cẩm ĐH6 30 Hình 3.1 Phản ứng trung hòa DPHH 38 Hình 4.1 Biểu đồ thể ngày trỗ dòng 41 Hình 4.2 Biểu đồ thể chiều cao cuối dòng 41 Hình 4.3 Biểu đồ thể chiều dài địng dịng 42 Hình 4.4 Biểu đồ thể chiều rộng đòng dịng 42 Hình 4.5 Biểu đồ thể tổng số hạt/bơng dịng 44 Hình 4.6 Biểu đồ thể chiều dài bơng lúa dịng 45 Hình 4.7 Biểu đồ thể tỉ lệ hạt chắc/bơng (%) dịng 45 Hình 4.8 Biều đồ thể khối lượng 1000 hạt (g) dòng 45 Hình 4.9 Biểu đồ thể suất dịng 48 Hình 4.10 Cây lúa đen có gốc tím đen, thân màu xanh 49 vii download by : skknchat@gmail.com Hình 4.11 Sự khác biệt màu sắc hạt lúa dòng khác 49 Hình 4.12 Màu sắc vỏ trấu 36 dòng lúa đen 49 Hình 4.13 Màu sắc vỏ lụa 36 dòng lúa đen 50 Hình 4.14 Hàm lượng anthocyanin 36 dịng lúa đen 53 Hình 4.15 Hình ảnh dịng có hàm lượng athocyanin cao 54 Hình 4.16 Hình ảnh dịng có hàm lượng anthocyanin thấp 54 Hình 4.17 Hình ảnh dịng khơng đo hàm lượng anthocyanin 55 Hình 4.18 Mẫu phân tích BR14, BR17, BR11, BR15, BR26, BR29, BR27, BR3 BR4 để đo quang phổ 55 Hình 4.19 Kết điện di sản phẩm PCR 36 mẫu dòng với mồi qPC7 58 Hình 4.20 Sơ đồ biểu diễn locus tổng hợp pro-anthocyanidin hạt gạo 59 Hình 4.21 Kết điện di sản phẩm PCR 36 mẫu dòng với mồi RM11292 60 Hình 4.22 Hình ảnh dịch chiết AC thu từ 10 dòng 65 Hình 4.23 DPPH sau ủ 30 phút bóng tối 65 Hình 4.24 Biểu đồ thể khả loại bỏ gốc tự 10 mẫu AC 66 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đào Thị Như Quỳnh Tên Luận văn: Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, suất hàm lượng anthocyanin số dòng lúa đen chọn tạo Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm chọn lọc dịng lúa đen có suất hàm lượng anthocyanin cao từ 36 dòng lúa đen chọn tạo Trung tâm nghiên cứu trồng Việt Nam Nhật Bản (CIPR); nhằm phát triển sản xuất giống lúa có giá trị dược liệu Gạo đen loại gạo có hàm lượng dinh dưỡng cao: protein, chất béo, caroten, axit amin, anthocyanin nguyên tố vi lượng cần thiết cho thể Anthocyanin chất có khả kháng oxy hóa cao có hàm lượng cao lúa đen, ngồi có lợi cho sức khỏe người ngăn ngừa số bệnh nguy hiểm Phương pháp nghiên cứu Để tiến hành đề tài ta thực thí nghiệm sử dụng phương pháp bố trí thí nghiệm để đánh giá suất tiêu nông sinh học thu Tiếp tục xác định hàm lượng anthocyanin 36 mẫu gạo đen dựa theo Yang et al (2009) Đồng thời thực nghiên cứu di truyền phân tử để phân tích di truyền gen tham gia trình tổng hợp anthocyanin Kết kết luận Kết thu dịng lúa đen có hàm lượng anthocyanin cao nhất: BR14, BR17, BR30, BR6, BR35, BR8, BR1, BR5, suất thực thu dòng cao: BR6 (6,05 tấn/ha), BR8 (8,67 tấn/ha), BR1 (4,43 tấn/ha), BR17 (4,51 tấn/ha) Kết xác định gen thị phân tử xác định 14 dòng mang gen Rc, 14 dòng mang gen Rd 17 dịng khơng mang gen Rc Rd Kết hợp việc thực đánh giá khả chống oxi hóa DPPH 10 dịng điển hình kết cuối thu dịng BR6 BR8 có suất, hàm lượng anthocyanin hoạt tính chống oxi hóa cao ứng dụng vào sản xuất Các số liệu thu nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho việc chọn lọc giống lúa dược liệu đặc sản chất lượng áp dụng vào sản xuất Từ khóa: lúa đen, hàm lượng anthocyanin, chống oxi hóa, suất, nơng sinh học ix download by : skknchat@gmail.com IC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế mạnh yếu mẫu khảo sát IC50 định nghĩa nồng độ mẫu mà ức chế 50 % gốc tự do, tế bào, enzyme, mẫu có hoạt tính cao giá trị IC50 thấp Dựa vào bảng kết 4.10 ta thấy mẫu BR9, BR11 BR15 có giá trị IC50 cao nhất, cịn mẫu cịn lại có giá trị IC50 thấp Suy mẫu có hoạt tính thấp mẫu: BR9, BR11 BR15, ngược lại mẫu cịn lại thuộc nhóm có hoạt tính cao: BR14, BR17, BR30, BR6, BR35, BR8 BR1 Mặt khác nhóm có hoạt tính cao lại thuộc nhóm có hàm lượng anthocyanin cao nhất, nhóm có hoạt tính thấp thuộc nhóm có hàm lượng anthocyanin thấp Theo nghiên cứu Ngô Trần Hữu Nghĩa cs.(2014), đưa kết số IC50 anthocyanin mùng tơi 1,8 µg /ml thấp hẳn so với acid galic 2,6 µg /ml chứng tỏ khả chống oxy hóa anthocyanin cao So sánh với kết khả chống oxi hóa anthocyanin 10 dịnglúa đen nghiên cứu ta thấy giá trị IC50 dịng có hàm lượng anthocyanin cao cịn thấp giá trị IC50 anthocyanin mùng tơi, dịng có khả chống oxi hóa cao Ngồi dịng cịn lại có giá trị IC50 tương đương với acid galic nên có khả chống oxi hóa thấp Nghiên cứu Nguyễn Xuân Duy Hồ Bá Vương (2013) “Hoạt tính chống oxi hóa ức chế enzyme polyphenoloxidase số loại thực vật ăn Việt Nam” cho kết lực khử thể qua giá trị IC50 trà xanh (TX), trầu không (TK) ổi (LO) thấp đáng kể so với ba loại lại, điều có nghĩa dịch chiết từ ba loại có hoạt tính chống oxi hóa cao đáng kể so với ba loại lại Giá trị IC50 chúng 1,94; 1,40 2,28µg /ml Lá lốt (LL, IC50 = 16,45µg /ml) có hoạt tính chống oxi hóa cao nhàu (LN, IC50 = 43,84µg /ml) khoai lang (KL, IC50 = 112,99µg /ml) có lực khử thấp So sánh với kết giá trị IC50 anthocyanin 10 dịng lúa đen điển hình kết luận anthocyanin lúa đen có khả chống oxi hóa cao Yuzhi Jiao et al.(2012)đã nghiên cứu khả chống oxi hóa chiết xuất anthocyanin từ khoai lang tím (Ipomoea batatas L.) cho kết giá trị IC50khi sử dụng DPPH để đánh giá khả chống oxi hóa anthocyanin 67 download by : skknchat@gmail.com khoai lang tím 6,94 µg /ml,IC50của mẫu khác Lascorbic acid (L-AA) butylated hydroxytoluene (BHT) có giá trị 6,10 µg /ml 123,46 µg /ml Kết luận anthocyanin khoai lang tím có khả chống oxi hóa cao L-AA BHT Dựa vào bảng kết bảng 4.10 giá trị IC50 anthocyanin 10 dòng lúa đen, suy anthocyanin lúa đen có khả chống oxi hóa cao anthocyanin khoai lang tím Qua việc đánh giá suất, hàm lượng anthocyanin khả chống oxi hóa ta đưa dịng BR6 BR8 có suất cao, hàm lượng anthocyanin cao đồng thời hoạt tính chống oxi hóa cao đưa phục vụ cho sản xuất 4.6 THẢO LUẬN Kết hợp với hình 4.14 hàm lượng anthocyanin 36 dịng xếp từ cao đến thấp bảng 4.4 nhóm dịng phân theo màu sắc vỏ lụa, nhìn chung thấy mẫu có vỏ lụa đậm có hàm lượng anthocyanin cao Một số mẫu có hàm lượng anthocyanin cao tiêu biểu BR14, BR17, BR30, BR8, BR5 thuộc nhóm vỏ lụa đậm vỏ lụa đen hồn tồn Hàm lượng anthocyanin dịng BR14 cao chiếm 0,4996% tương đương với 499,6 mg 100 g bột gạo, dòng BR15 thấp chiếm 0.0072% tương đương với 7,2 mg 100 g bột gạo.Hàm lượng anthocyanin dòng BR3, BR27, BR29, BR26, BR4 không Chưa kết luận gạo tẻ gạo nếp dịng có hàm lượng anthocyanin cao Một số trường hợp đặc biệt mẫu BR13 có màu nâu đỏ cho hàm lượng anthocyanin nhóm cao (nhóm I), cao mẫu BR34 BR12 có màu vỏ lụa đen hồn tồn Có thể lý giải hai mẫu BR34 BR12 có vỏ lụa đen hồn tồn, cịn có chất khác tạo màu khơng phải anthocyanin.Đặc biệt ta có mẫu BR9 thuộc nhóm vỏ lụa (màu xanh) có hàm lượng anthocyanin cao nhiều mẫu có vỏ lụa màu đậm Do tính chất thành phần hóa học anthocyanin bị thay đổi (ví dụ thay đổi pH) làm cho màu vỏ lụa thay đổi màu xanh khơng phải màu đen, tím, nâu bình thường.Chính cần phải nghiên cứu thêm để khẳng định xác nguyên nhân gây trường hợp đặc biệt Qua đánh giá đặc điểm nông sinh học,các yếu tố cấu thành suất ta thấy dịng BR8, BR36, BR15, BR21, BR6 dịng có suất cao, có triển vọng lớn sản xuất Dựa thông tin từ nhiều công bố xác định lập đồ gen, xác 68 download by : skknchat@gmail.com định locus gen Rc nằm NST số 7, gen Rd nằm NST số Nguyễn Quốc Trung cs.(2015) phát marker qPC7 thích hợp để xác định gen Rc Chúng tiến hành khảo sát lại marker qPC7 36 mẫu lúa đen nghiên cứu cho thấy có 14 mẫu mang gen Rc: có mẫu có hàm lượng anthocyanin cao,có mẫu có hàm lượng anthocyanin thấp Khảo sát marker RM11292 36 dòng lúa đen ta thu 14dòng mang gen Rd Tổng hợp kết điện di hình 4.19 hình 4.21 bảng so sánh tương quan có mặt gen Rc, gen Rd với hàm lượng anthocyanin ta thấy có mẫu mang gen Rc; mẫu mang gen Rd Có mẫu mang đồng thời gen Rcvà Rd Tôi nhận thấy mẫu mang đồng thời gen Rc gen Rd có màu vỏ lụa xếp nhóm nhóm (2 nhóm cao nhất) Điển hình mẫu mang gen mà có hàm lượng anthocyanin cao nhóm I gồm mẫu BR6 (0,2826%) BR35 (0,2702%), ngược lại mẫu BR3 BR27 lại có hàm lượng anthocyanin nhóm thấp (0%) Các mẫu dịng cịn lại khơng mang gen mang gen khác gen ta nghiên cứu, hoạt động yếu tương tác với gen khác (không phải gen Rc Rd) (cần nghiên cứu thêm) Dựa phương pháp đánh giá khả chống oxi hóa DPPH từ 10 dòng lúa đen kết hợp với việcso sánh với nghiên cứu khác: giá trị IC50 10 dòng lúa đen nghiên cứu thấp, có nghĩa khả chống oxi hóa chúng cao Trong 10 dịng có dịng BR6 BR8 có suất, hàm lượng anthocyanin cao, đồng thời khả chống oxi hóa chúng cao; điều kết luận qua đề tài chọn dòng BR8 BR6 đáp ứng đủ mục tiêu đưa 69 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, suất thấy dòng BR8 (8,67 tấn/ha), BR36 (6,93 tấn/ha), BR15 (6,64 tấn/ha), BR21 (6,24 tấn/ha), BR6 (6,05 tấn/ha)là dịng thuộc nhóm suất cao Trong có dịngBR8 BR6 có hàm lượng anthocyanin cao tương ứng 282,6 mg 265,5 mg 100g bột gạo, có triển vọng lớn sản xuất Dựa nghiên cứu Yang et al (2009) đánh giá hàm lượng anthocyanin 36 mẫu gạo đen Chúng chia 36 mẫu gạo đen làm nhóm : nhóm I > 0.1%, gồm 13 dịng Nhóm II 0,05%-0,1% gồm 11 dịng Nhóm III 0.001%-0.05% gồm dịng Nhóm IV