(LUẬN văn THẠC sĩ) góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 173 113

TỔNG QUAN

Đại cương về kháng sinh …

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh

Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh

Penicillin, được sử dụng lần đầu tiên trong điều trị và thử nghiệm vào những năm 1940, nhanh chóng trở thành một trong những kháng sinh nổi tiếng nhất Nhờ vào khả năng cứu sống nhiều chiến binh trong Chiến tranh thế giới thứ II, penicillin đã khẳng định vai trò quan trọng của mình trong y học.

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được phát hiện chủ yếu từ các xạ khuẩn, đánh dấu một thời kỳ “vàng son” của hóa liệu pháp kháng sinh.

Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007)

Việc phát hiện và phát triển kháng sinh trong thế kỷ 20 đã giúp giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn Tuy nhiên, từ những năm 1980, số lượng kháng sinh mới được đưa vào điều trị đã giảm do chi phí phát triển và thử nghiệm thuốc ngày càng cao Hơn nữa, tình trạng gia tăng vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có đang trở thành một mối lo ngại lớn Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn cần được giải quyết thông qua việc phát hiện các loại thuốc mới.

Công nghệ lên men sản xuất kháng sinh ngày càng hoàn thiện bên cạnh việc nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh tự nhiên mới Đồng thời, sự tổng hợp và bán tổng hợp kháng sinh từ các khung hóa học hiện có đã mang lại nhiều thành tựu đáng kể, nổi bật với sự xuất hiện của cloramphenicol và cephalosporin.

1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh

Kháng sinh là các sản phẩm đặc biệt được chiết xuất từ vi sinh vật (VSV) hoặc nguồn tự nhiên khác, có khả năng sinh học cao, giúp kìm hãm hoặc tiêu diệt chọn lọc các loại VSV như vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, và tế bào ung thư ở nồng độ thấp.

Kháng sinh có thể được phân loại theo nhiều tiêu chí như nguồn gốc và cơ chế tác dụng Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, giúp các nhà nghiên cứu nhanh chóng nhận diện các đặc điểm của kháng sinh mới khi nắm rõ cấu trúc hóa học của chúng.

 Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm cấu trúc được trình bày trong bảng 1

Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [11, 18]

NHÓM KS KS cụ thể β-lactam Penicillin, Cephalexin…

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó (Hình 1.2)

Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh

Kháng sinh hoạt động chủ yếu bằng cách ức chế các phản ứng tổng hợp của tế bào vi sinh vật gây bệnh, thông qua việc gắn vào các receptor trên bề mặt tế bào này Điều này dẫn đến sự biến đổi trong các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào vi sinh vật Mỗi nhóm kháng sinh có tác dụng lên các đích cụ thể khác nhau.

- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào

- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất

- Tác dụng lên sự tổng hợp AND

- Tác dụng lên sự tổng hợp protein

- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp

- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh

Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh trong hình 1.3 [11]

Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh

Bình nhân giống quy mô phòng thí nghiệm

Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống

Bình lên men tạo kháng sinh

Sản phẩm đã kiểm nghiệm

Sản phẩm được đóng gói Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh

Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau [11]:

Kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong y học, được sử dụng để điều trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Hiện nay, một số loại kháng sinh cũng được áp dụng trong điều trị bệnh ung thư.

 Ngoài lĩnh vực y học: kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác

Trong chăn nuôi, bác sĩ thú y sử dụng kháng sinh như Griseoviridin để điều trị các bệnh như viêm phổi cấp và viêm vú ở trâu bò Ngoài ra, kháng sinh còn được áp dụng như một chất kích thích tăng trọng cho đàn gia súc và gia cầm, giúp giảm chi phí thức ăn và tăng sản lượng trứng ở gà, vịt.

Trong lĩnh vực trồng trọt, kháng sinh được sử dụng để tiêu diệt các bệnh do vi khuẩn, virus và nấm gây ra cho cây trồng Một ví dụ điển hình là Vandamycin, được áp dụng để tiêu diệt nấm, giúp bảo vệ sức khỏe cây trồng và nâng cao năng suất mùa màng.

Rhidoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả [11].…

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, KS được sử dụng để bảo quản thực phẩm đóng hộp, giúp giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt Việc giảm nhiệt độ khử trùng không chỉ cải thiện chất lượng sản phẩm mà còn bảo vệ các vitamin, giữ nguyên hương vị của thực phẩm Một ví dụ điển hình là kháng sinh subtilin.

Bacillus subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis) [11].

Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phổ biến trong tự nhiên, có mặt ở nhiều môi trường như đất, nước, phân chuồng và bùn Chúng thậm chí còn tồn tại trong những chất mà vi khuẩn và nấm mốc không thể phát triển.

Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh có G + C > 55% [4, 18]

Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như

KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều [7, 19]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn thật phát triển dưới dạng sợi, được chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạ khuẩn có đặc điểm khác biệt so với vi khuẩn và nấm men, thường có bề mặt thô ráp, dạng phấn và không trong suốt, với các nếp gấp tỏa ra giống hình phóng xạ Đường kính của khuẩn ty xạ khuẩn dao động từ 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm, và phần lớn khuẩn ty này không có vách ngăn Màu sắc của khuẩn ty xạ khuẩn rất đa dạng, bao gồm vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu và trắng.

Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces nổi bật với khả năng sản xuất nhiều loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp Đáng chú ý, hơn 55% tổng số kháng sinh được phát hiện từ xạ khuẩn là do Streptomyces tổng hợp.

VSV giống xạ khuẩn Actinomycetales

Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những đặc điểm riêng:

Khuẩn lạc xạ khuẩn là một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng lẻ, thường có hình dạng chắc chắn và xù xì Chúng có thể xuất hiện dưới nhiều dạng như da, vôi, nhung tơ hoặc màng dẻo, với các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.

Hệ sợi khuẩn lạc bao gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất phát triển sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong quá trình phát triển, với bề mặt có thể nhẵn hoặc sần sùi Ngược lại, khuẩn ty khí sinh hình thành khi khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí, dẫn đến sự xuất hiện của các chuỗi bào tử trên đỉnh Chuỗi bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như thẳng, sóng, móc câu và xoắn, và khi phân cắt, chúng tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bề mặt bào tử có thể trơn, nhẵn, xù xì như da cóc, có gai hoặc có tóc.

Streptomyces là một sinh vật dị dưỡng với khả năng oxi hóa mạnh mẽ Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein và tinh bột, cũng như khử nitrat thành nitrit.

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối thích của chúng là 25- 30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[7, 12]

 Khả năng tạo sắc tố:

Sắc tố được tạo ra từ Streptomyces được phân loại thành bốn loại chính: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh và sắc tố melanoid.

 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Có khá nhiều khóa phân loại Streptomyces: Khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Gauze,…Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình

Hệ thống phân loại Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất vào năm 1970 đã trở thành công cụ phổ biến để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Khóa phân loại này dựa trên các đặc điểm đặc trưng của từng loài.

- Màu của khuẩn ty cơ chất

- Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan

- Hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử

- Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon.

Tuy ển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

Các vi sinh vật thuần chủng được lấy từ nguồn tự nhiên như bùn, đất, nước và mô thực vật thường có hàm lượng tổng hợp kháng sinh thấp và hiệu suất không cao Để thu được các chủng có hàm lượng và hiệu suất sinh tổng hợp cao, cần phải tiến hành cải tạo và chọn lọc giống thông qua nhiều phương pháp khác nhau, đồng thời nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và bảo quản phù hợp.

1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật (VSV) có khả năng đột biến tự nhiên với tần suất khoảng 10^-10 đến 10^-5 trong ống giống thuần khiết, dẫn đến sự hình thành các biến chủng khác nhau Một số biến chủng có khả năng thích nghi (HTKS) mạnh hơn từ 20-30% so với các cá thể khác Do đó, việc lựa chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống là cần thiết để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.

1.3.3 Đột biến cải tạo giống

Việc sàng lọc ngẫu nhiên các cá thể có khả năng tổng hợp kháng sinh cao thường chỉ phục vụ cho nghiên cứu ban đầu và không có giá trị ứng dụng trong sản xuất Để phát triển các chủng vi sinh vật có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, các phương pháp đột biến nhân tạo được áp dụng.

 Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:

• Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat…

- Ánh sáng UV, tia X, tia hay electron

Ánh sáng tử ngoại (UV) là tác nhân vật lý phổ biến nhất, có khả năng xuyên thấu kém Tuy nhiên, với các tế bào vi sinh vật (VSV) có kích thước nhỏ, ánh sáng UV có thể xuyên qua màng nhân của chúng.

- Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

Tia UV gây ra hiện tượng quang phục hoạt (photoreactivation), cho phép các tế bào phục hồi phần lớn tổn thương khi được tiếp xúc với ánh sáng thường sau khi chiếu tia UV.

• Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu

Sau khi tiếp xúc với các tác nhân đột biến, phần lớn vi sinh vật (VSV) sẽ chết Tuy nhiên, trong số các biến chủng sống sót, có những biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (KS) tăng (đột biến dương) và những biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm) Do đó, cần tiến hành chọn lọc những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Bảo quản giống vi sinh vật (VSV) là rất quan trọng để ngăn chặn tình trạng thoái hóa, nhầm lẫn và mất mát Mục tiêu chính là duy trì tỷ lệ sống sót cao cho giống VSV, bảo đảm các đặc tính di truyền không bị biến đổi và tránh tạp nhiễm từ các VSV lạ.

Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:

- Cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới),

- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)

- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh)

Đông lạnh là phương pháp bảo quản huyền dịch tế bào trong chất bảo quản bằng cách đông lạnh nhanh và duy trì ở nhiệt độ thấp Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng phù hợp, sau đó cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh ở 2°C và thực hiện cấy lại định kỳ mỗi 3 - 6 tháng.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học do vi sinh vật thực hiện, nhờ vào sự xúc tác của các enzyme, nhằm cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng.

Nuôi cấy vi sinh vật (VSV) trong môi trường dịch thể, bao gồm cả tĩnh và lắc sinh học, diễn ra trong các bình lên men, đảm bảo sự phát triển của VSV qua bốn pha đặc trưng: pha lag (tiềm tang), pha log (lũy thừa), pha cân bằng và pha suy tàn Kháng sinh, một sản phẩm bậc hai, được tạo ra vào cuối quá trình sinh trưởng, trong pha cân bằng.

Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

1.4.2 Các phương pháp lên men

 Lên men bề mặt : Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng

 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi thiết bị phức tạp

 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa , tự động hóa , khó vô trùng , tốn diện tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp

 Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí ) được nuôi cấy trong môi trường lỏng

Hệ thống này mang lại nhiều ưu điểm nổi bật như khả năng dễ dàng cơ giới hóa và tự động hóa, giúp kiểm soát toàn bộ quy trình một cách hiệu quả Ngoài ra, nó tiết kiệm diện tích và giảm thiểu chi phí nhân lực, đồng thời nâng cao hiệu suất quá trình lên men.

 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn

 Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

Lên men mẻ, hay còn gọi là lên men chu kỳ, là quá trình trong đó vi sinh vật (VSV) được nuôi cố định trong bình lên men với một thể tích môi trường (MT) xác định Trong quá trình này, VSV phát triển theo các giai đoạn khác nhau và tạo ra sản phẩm Khi kết thúc quá trình lên men, sản phẩm sẽ được thu hoạch để sử dụng.

Lên men có bổ sung là quá trình nuôi cấy trong đó môi trường dinh dưỡng được thêm vào để tăng mật độ tế bào trong bình, từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng của bình lên men.

Lên men liên tục là quá trình trong đó thiết bị được thiết kế đặc biệt để khi vi sinh vật (VSV) phát triển đến giai đoạn tối ưu, một phần dịch lên men sẽ được lấy ra và môi trường mới sẽ được bổ sung vào bình.

Trong quá trình lên men bán liên tục, việc bổ sung môi trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men cần được thực hiện định kỳ, không phải liên tục, sau những khoảng thời gian nhất định.

1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H + hay OH - đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp.[14,8] Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: Trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt [14, 8]

Nhiệt độ: Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 – 30 0 C, nhưng nhiệt độ tối ưu cho tổng hợp KS chỉ nằm trong khoảng 22 – 28 0 C [14,8]

Tuổi giống là yếu tố quan trọng trong việc tổng hợp kháng sinh (KS), không chỉ chịu ảnh hưởng bởi điều kiện lên men mà còn bởi chất lượng bào tử và giống sinh dưỡng Để đạt được hiệu suất sinh kháng sinh cao nhất, tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men nên nằm trong khoảng 36 – 72 giờ, với lượng giống cấy truyền khoảng 2 – 10%.

Trong sản xuất, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men là rất quan trọng Điều này giúp tối ưu hóa quy trình lên men, từ đó tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việc tổng hợp các chất mong muốn.

Chi ết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

Kháng sinh là sản phẩm của quá trình trao đổi chất thứ cấp, được tiết ra vào môi trường nuôi cấy hoặc giữ lại trong tế bào tùy thuộc vào đặc tính của từng loài Để thu được các chất kháng sinh có độ tinh khiết cao, cần áp dụng các phương pháp chiết tách phù hợp.

 Một số phương pháp chiết tách thường dùng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

- Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên cột…)

- Phương pháp tạo phức kết tủa

Chiết xuất là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp, diễn ra qua quá trình phân bố giữa hai pha không trộn lẫn, bao gồm pha lỏng và pha rắn (cân bằng lỏng-rắn) hoặc giữa hai pha lỏng, thường có một pha là nước (cân bằng lỏng-lỏng).

Phương pháp sắc ký là một nhóm các kỹ thuật hóa lý dùng để tách các chất riêng biệt từ hỗn hợp đa thành phần Nguyên lý tách dựa trên việc mẫu phân tích được hòa tan trong pha động và được đưa qua pha tĩnh mà không bị hòa lẫn Pha tĩnh có thể được cố định trên cột hoặc bề mặt chất rắn Các chất tan trong mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào sự tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ vào sự khác biệt về tốc độ di chuyển, các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt, tạo thành dải trên sắc đồ, từ đó phục vụ cho phân tích định tính và định lượng.

Cơ chế của sự chia tách có thể bao gồm hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hoặc sự kết hợp của nhiều cơ chế khác nhau Sự lựa chọn cơ chế này phụ thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

- Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp KS:

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hai pha: pha tĩnh là chất hấp phụ được cố định trên bề mặt bản mỏng, trong khi pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ lệ nhất định Sự di chuyển của pha động qua bản mỏng diễn ra nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.

Sắc ký rửa giải trên cột là quá trình mà pha tĩnh được giữ lại trên cột, trong khi pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ vào áp suất hoặc trọng lực Quá trình này diễn ra bằng cách liên tục thêm một lượng mới của pha động để thực hiện rửa giải.

Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh

1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại

Quá trình hấp thụ bức xạ tử ngoại dẫn đến sự biến đổi năng lượng điện tử của phân tử, trong đó các electron từ trạng thái cơ bản E0 chuyển sang các trạng thái kích thích E1 và E2 Các electron tham gia vào quá trình này có thể là electron trong liên kết đơn, liên kết bội, hệ thống thơm, hoặc cặp electron tự do không tham gia liên kết của oxy.

Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau

Khi một nhóm nguyên tử trong phân tử hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động, nó tạo ra một dải hấp thụ trên phổ hồng ngoại (IR) Sự tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ cho phép nhận diện các nhóm chức thông qua sự hiện diện của các dải này Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trưng, điều này tạo nền tảng cho việc phân tích cấu trúc bằng phương pháp IR.

Khối phổ là một kỹ thuật phân tích cho phép đo tỷ số khối lượng và điện tích của các ion (m/z) được tạo ra từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu trong pha khí Quá trình này sử dụng chùm điện tử có năng lượng trung bình từ 50 đến 100 eV để ion hóa và phá vỡ các phân tử hữu cơ trong môi trường chân không cao (10 -6 mmHg) Các tín hiệu thu được từ các ion sẽ được biểu diễn dưới dạng các vạch (pic) với cường độ khác nhau, tạo thành một khối phổ đồ Từ khối phổ, người ta có thể định tính khối lượng phân tử, nhận dạng các chất, xác định cấu trúc và thực hiện định lượng các chất.

M ột số kết quả nghiên cứu về kháng sinh

1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus

Rapamycin không chỉ là một loại kháng sinh và ức chế miễn dịch, mà còn được công nhận là có khả năng làm chậm quá trình lão hóa Nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của mức oxy hòa tan (DO) đến sản xuất rapamycin dạng viên từ Streptomyces hygroscopicus Kết quả cho thấy cần có mức DO cao để tăng cường sản xuất rapamycin, nhưng việc duy trì sự tập trung rapamycin cao thông qua kiểm soát DO là rất quan trọng Nếu mức DO cao đạt được từ sự gia tăng kích động, điều này có thể làm hỏng hình thái viên trong bể lên men, dẫn đến giảm sản xuất rapamycin Mức rapamycin tối đa đạt được trong nghiên cứu này khoảng 780 mg.

Trong quá trình lên men hàng loạt, L được thực hiện với kiểm soát nồng độ oxy hòa tan (DO) trên 30% Quá trình này bao gồm việc bổ sung oxy tinh khiết vào khí đầu vào và duy trì tốc độ khuấy ở mức dưới 200 vòng/phút.

Mức độ cao và hình thái học của dạng bột viên đều ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng sản xuất rapamycin cao từ S hygroscopicus trong quá trình lên men.

1.7.2 Tối ưu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp.ATCC 39.366 sản xuất Leptomycin bởi electroporation

Streptomyces sp ATCC 39.366 sản xuất leptomycin B, một chất ức chế mạnh đối với việc tạo ra protein hạt nhân Tuy nhiên, việc đưa DNA vào dòng này gặp khó khăn, cản trở việc sử dụng tiếp theo Chúng tôi đã phát triển một giao thức chuyển đổi Streptomyces sp ATCC 39.366 với DNA bên ngoài thông qua electroporation Nhiều điều kiện được kiểm tra, bao gồm phương pháp điều trị màng tế bào, các thông số electroporation và nội dung DNA Kết quả cho thấy chỉ plasmid DNA từ chủng ET12567 dẫn đến chuyển đổi thành công Sợi nấm phát triển trong môi trường men-peptone-dextrose với 1% glycine ở 28 °C trên máy lắc.

Tốc độ quay 220 rpm giúp phân tán hiệu quả hơn so với các thí nghiệm không bổ sung, đồng thời làm tăng khả năng electroporation Hiệu suất chuyển đổi tối đa đạt được là 8 × 10^2 CFU/mg DNA plasmid tại điện trường 13 kV/cm và thời gian 13 ms (với tụ điện 25 μF và điện trở song song 600 Ω) sử dụng electrocuvettes 1 mm Kết quả từ các biến đổi của hai loài Streptomyces cho thấy rằng các điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này có thể chỉ áp dụng cho một số trường hợp nhất định.

Đây là báo cáo đầu tiên về việc chuyển đổi thành công Streptomyces sp ATCC 39.366, mở ra cơ hội phát triển các đột biến gen trực tiếp trong loài vi khuẩn này Điều này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất hàng loạt các dẫn xuất leptomycin mới.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên v ật liệu và thiết bị

 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH Dược Hà Nội cung cấp:

Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 1228

Vi khuẩn Gram (-): Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định

• Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.1: Cácmôi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần MT1 MT5 MT6

Chú thích: Đơn vị tính theo gram

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút

- Các môi trường lên men dịch th ể (MTdt): thành phần tương ứng như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch

• Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần

NaCl Cao thịt Pepton Thạch pH

Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (°C)

 Vật liệu chạy sắc ký

- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 3 ở trên

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm

- Tác nhân gây đột biến: Ánh sáng UV (λ%4nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

- Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm

Buret, bình chiết, patuyn, pipet, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh và kim mũi mác là những dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm, phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau trong nghiên cứu và thí nghiệm khoa học.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được Đo phổ nhiệt độ nóng chảy, IR, phổ UV, phổ MS.

Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

Mẫu thử được đặt trên thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch, ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh.

 Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml

MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 10 6 -10 8 tế bào/ml

Cấy hỗn dịch vi sinh vật (VSV) vào môi trường thạch đã được tiệt trùng và làm nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (10^5 tế bào/1ml) Sau đó, lắc đều và đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml cho mỗi đĩa.

 Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau :

- Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm

3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới

50 o C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định

- Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định

- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng

Các mẫu thử được đặt trong đĩa Petri và ủ ở nhiệt độ 37ºC trong thời gian từ 18 đến 24 giờ để kiểm tra vi khuẩn Mỗi mẫu được thử nghiệm đồng thời trên ba đĩa với loại vi sinh vật (VSV) kiểm định giống nhau.

Kết quả được đánh giá bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn sử dụng thước kẹp Palmer với độ chính xác 0,02mm Đường kính vòng vô khuẩn sẽ được xử lý theo công thức để đưa ra đánh giá chính xác.

D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

D i (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3)

Để pha hỗn dịch bào tử Streptomyces 173.113, đầu tiên lấy một vòng que cấy bào tử và cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng Tiến hành lắc đều để bào tử phân tán, thu được hỗn dịch bào tử với độ pha loãng 10^-1 Sau đó, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10^-6 bằng nước vô trùng.

Cấy bào tử được thực hiện bằng cách sử dụng pipet vô trùng để hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các nồng độ pha loãng 10^-5 và 10^-6, sau đó nhỏ lên bề mặt thạch của môi trường MT1 trong đĩa Petri Sử dụng que trang vô trùng để dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch Quy trình này được thực hiện trên ba đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng Cuối cùng, các đĩa được đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày để quan sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

 Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Để pha hỗn dịch bào tử Streptomyces 173.113, lấy một vòng que cấy bào tử cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng và lắc đều để thu được hỗn dịch bào tử với độ pha loãng 10^-1 Tiếp theo, tiếp tục pha loãng hỗn dịch này đến nồng độ 10^-6 bằng nước vô trùng.

Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử với độ pha loãng 10^-6 và nhỏ vào hộp Petri chứa môi trường thạch Sử dụng que chang vô trùng để dàn đều mẫu, sau đó đặt vào tủ ấm để tạo mẫu chứng.

 Đột biến bằng ánh sáng UV: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10 -1 đổ ra đĩa

Để tiến hành thí nghiệm vô trùng, chiếu ánh sáng UV (λ%4 nm) vào đĩa Petri chứa hỗn dịch bào tử nồng độ 10 -1 từ khoảng cách 60 cm trong 5 phút Sau đó, để đĩa Petri ở nơi tối trong 2 giờ và sử dụng pipet vô trùng để pha loãng đến nồng độ 10 -5.

Phân tán bào tử sau đột biến được thực hiện bằng cách sử dụng pipet vô trùng để hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử với các nồng độ 10^-4 và 10^-5 Sau đó, cho dung dịch vào hộp Petri chứa môi trường 1, dàn đều bằng que chang vô trùng và đặt vào tủ ấm Sau 6 ngày, tiến hành đếm số khuẩn lạc để xác định kết quả.

% độ sống sót theo công thức:

Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến,

N 0 : Số khuẩn lạc trong mẫu chứng,

10 -k : Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng

 Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến, cấy ra hộp Petri

Làm song song cả mẫu chứng Sau 6 ngày để trong tủ ấm, thử hoạt tính kháng sinh Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức:

D i : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB

D 0 : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

Sau khi thực hiện các đột biến, cần dựa vào kết quả thu được để lựa chọn những biến chủng có tỷ lệ biến đổi hoạt tính cao nhất, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

 Bằng tác nhân hoá học acid nitrơ (HNO2)

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO 2

Để pha hỗn dịch bào tử Streptomyces 173.113, đầu tiên lấy một vòng que cấy bào tử cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng và lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử với độ pha loãng 10^-1 Tiếp theo, tiến hành pha loãng thêm đến nồng độ 10^-6 bằng nước cất vô trùng.

Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử với độ pha loãng 10^-6 và nhỏ vào hộp Petri chứa môi trường thạch Dàn đều hỗn dịch bằng que chang vô trùng và đặt vào tủ ấm để tạo mẫu chứng.

 Đột biến bằng acid nitroro: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10 -1 cho them

Để chuẩn bị dung dịch, hòa tan 0,07g NaNO2 và điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong 2-3 phút Tiếp theo, điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N, sau đó sử dụng pipet vô trùng để pha loãng đến nồng độ 10^-5.

 Phân tán bào tử sau đột biến, chọn lọc ngẫu nhiên, tính toán kết quả các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh

Sau khi xác định các môi trường nuôi cấy bề mặt tối ưu cho sản xuất kháng sinh, chúng tôi sử dụng giống cấp 1 để tiến hành quá trình lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng phù hợp.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

K ết quả sàng lọc ngẫu nhiên

 Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể

 Kết quả: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên được giới thiệu ở bảng 5

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Dạng chủn g

Hoạt tính kháng sinh Dạn g chủ ng

Chọn ba dạng chủng số 04, 18, 20 (SLNN.04, SLNN.18, SLNN.20) để đạt hoạt tính kháng sinh cao nhất cho việc nhân giống, bảo quản và nghiên cứu sau này Trong đó, dạng chủng số 04 cho thấy khả năng kháng sinh cao nhất và đã được đột biến lần 1 bằng ánh sáng UV.

K ết quả đột biến cải tạo giống lần 1

Đột biến chủng SLNN.04 được thực hiện bằng ánh sáng UV (λ%4nm) với khoảng cách chiếu 60 cm trong thời gian 5 phút Sau đó, 36 biến chủng đã được đánh giá hiệu quả kháng sinh bằng phương pháp khối thạch, và kết quả chính được trình bày trong bảng 6.

Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1

Ký hiệu dạng biến chủng

(mm) s % hoạt tính so với MC (mm) D s % hoạt tính so với MC ĐB1.01 25,51 0,32 116,64 24,16 0,88 112,53 ĐB1.02 22,38 0.89 102,33 22,57 0,25 105,12 ĐB1.03 24,41 0,54 111,61 23,54 0,44 109,64 ĐB1.04 23.34 0,21 106,72 22,57 0,25 105,12 ĐB1.07 25,15 0,35 114,99 23,34 0,30 108,71 ĐB1.09 24,62 0,69 112,57 23,83 0,64 110,99 ĐB1.10 23.81 0,12 108,87 22,56 0,25 105,08 ĐB1.12 22,02 0,74 100,69 23,79 0,61 110,81 ĐB1.14 22,98 0,47 105,08 23,14 0,16 107,78 ĐB1.19 24,15 0,36 110,43 22,89 0,02 106,61 ĐB1.35 23,87 0,16 109,14 22,22 0,49 103,49

Nh ận xét: Sau đột biến lần 1 tỷ lệ sống sót là: 1,13% Chọn 3 biến chủng có

HTKS số 01, 03, 09 (ĐB1.01, ĐB1.03, ĐB1.09) được sử dụng để nhân giống, lưu giữ và phục vụ cho các nghiên cứu sau này Trong số đó, chủng ĐB1.01 có HTKS tốt nhất và được áp dụng cho đột biến UV lần 2.

Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2

Chủng ĐB1.01 được đột biến bằng ánh sáng UV (λ%4nm) với khoảng cách 60 cm trong thời gian 5 phút Thí nghiệm HTKS đã được thực hiện trên 36 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch, và kết quả chính được trình bày trong bảng 7.

(mm) S % hoạt tính so với MC (mm) D S % hoạt tính so với MC ĐB2.01 26,16 0,48 104,89 24,43 0,04 97,25 ĐB2.02 27,50 0,43 110,26 26,73 0,58 106,41 ĐB2.04 25,47 0,07 102,13 24,67 0,13 98,21 ĐB2.05 26,86 0,96 107,69 25,95 1,03 103,30 ĐB2.07 26,91 1,01 107,90 25,37 0,62 100,99 ĐB2.12 24,23 0,88 97,15 23,79 0,49 94,71 ĐB2.13 25,82 0,24 103,53 25,37 0,62 97,05 ĐB2.30 24,35 0,80 97,63 23,49 0,00 93,51 ĐB2.32 24,13 0,95 96,75 23,37 0,80 93,03 ĐB2.35 25,18 0,21 100,96 24,79 0,21 98,69 ĐB2.36 25,56 0,06 102,49 25,44 0,67 101,27

Tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 đạt 0,54% Ba biến chủng có khả năng thích nghi tốt nhất là ĐB2.03, ĐB2.05 và ĐB2.07, được lựa chọn để lưu giữ và nhân giống cho các nghiên cứu sau này Đặc biệt, biến chủng số 02 của ĐB2 được sử dụng cho quá trình đột biến hóa học bằng tác nhân HNO2.

K ết quả đột biến cải tạo giống lần 3

Đem chủng ĐB2.02 đột biến bằng tác nhân hóa học HNO2 Thử HTKS của

36 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch Kết quả chính được thể hiện trong bảng 8.

(mm) S % hoạt tính so với MC (mm) D s % hoạt tính so với MC ĐB3.01 27,10 0.33 100,33 24,11 0,78 98,61 ĐB3.03 26,22 0,29 97,08 24,35 0,61 99,59 ĐB3.04 28,19 0,11 104,37 26,12 0,95 106,83 ĐB3.07 27,85 0,86 103,11 25,58 0,26 104,62 ĐB3.09 26,43 0,00 97,85 23,51 0,21 96,15 ĐB3.11 26,78 0,11 99,15 24,01 0,85 98,20 ĐB3.15 26,97 0,95 99,85 24,85 0,25 97,64 ĐB3.19 27,67 0,74 103,44 25,42 0,15 103,97 ĐB3.20 27,78 0,81 102,85 25,06 0,60 102,49 ĐB3.25 25,79 0,59 95,48 22,64 0,30 88,96 ĐB3.36 27,01 0,32 100,00 24,74 0,33 101,19

Tỷ lệ sống sót của các tế bào khi bị đột biến do tác nhân hóa học chỉ đạt 0,15%, thấp hơn nhiều so với tỷ lệ sống sót khi đột biến do ánh sáng UV.

0,54%) Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 04, 07, 19(ĐB3.04, ĐB3.07, ĐB3.19) để nhân giống, lưu giữ cho các nghiên cứu sau.

Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Dựa trên kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy bề mặt từ khóa luận trước, ba môi trường tốt nhất đã được xác định là MT1, MT5 và MT6 Tiến hành thực hiện quá trình lên men chìm.

Streptomyces 173.113 được nghiên cứu trên ba môi trường dinh dưỡng MT1dt, MT5dt và MT6dt Sau khi lọc dịch lên men qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối, thử nghiệm hoạt tính kháng sinh (HTKS) được thực hiện theo phương pháp giếng thạch Kết quả chi tiết của nghiên cứu này được trình bày trong bảng 9.

Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men Môi trường

Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường lên men MT1dt với chủng Streptomyces 173.113 cho ra hiệu suất kháng sinh (HTKS) cao nhất Do đó, MT1 được lựa chọn làm môi trường lên men cho các thí nghiệm tiếp theo.

Kết quả chọn chủng lên men

Qua các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên và các đột biến, đã lựa chọn và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 173.113 Các biến chủng này được lên men chìm riêng rẽ trong môi trường MT1dt Sau khi lọc dịch lên men qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối, phương pháp giếng thạch đã được áp dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng sinh (HTKS) Kết quả chính được trình bày trong bảng 10.

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men

SLNN.20 22,55 0,82 23,13 0,41 ĐB1.01 24,45 0,13 25,39 0,55 ĐB1.09 23,67 0,45 25,39 0,74 ĐB2.02 26,56 0,31 27,71 0,11 ĐB2.07 26,40 0,35 27,48 0,46 ĐB3.04 28,45 0,37 29,41 0,77 ĐB3.19 27,31 0,56 29,11 0,92

Biến chủng ĐB3.04 đã cho thấy khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất trong thử nghiệm HTKS, do đó được chọn làm chủng lên men chìm để thu nhận dịch cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.7 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi

Dịch chiết dung môi hữu cơ được sử dụng trong quá trình sắc ký lớp mỏng, với việc thử nghiệm 4 hệ dung môi khác nhau Vết được phát hiện bằng phương pháp hiện hình vi sinh vật, cụ thể là vi khuẩn P mirabilis Thành phần của các hệ dung môi và kết quả thử nghiệm được trình bày chi tiết trong bảng 11.

Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Dung môi Thành phần Tỷ lệ Rf

Kết quả cho thấy hệ 3 và 4 đều có khả năng tách vết kháng sinh, nhưng hệ 3 tỏ ra vượt trội hơn Hệ 3 tạo ra vết hiện hình vi sinh vật (VSV) có dạng hình tròn, không có đuôi kéo dài, trong khi hệ 4 lại cho ra vết giống giọt nước ngược với đuôi kéo dài.

3.8 Kết quả sắc ký cột

Sau khi dịch lọc của quá trình lên men được thu lại khoảng 7 lít, tiến hành chiết xuất bằng ethylacetat ở pH 5, thu được 950 ml dung môi hữu cơ Dung môi này sau đó được cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, dẫn đến việc thu được 0,7232g bột kháng sinh thô để tiếp tục thực hiện chạy sắc ký cột.

 Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết

Cân 0,1112 g bột KS thô để chạy cột với hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1)

- Bước 1: Đưa silicagel lên cột bằng hệ dung môi đã chuẩn bị

- Bước 2: Rửa cột bằng 15-20ml n-hexan

- Bước 3: Chạy cột với hện dung môi 3

Lấy 36 phân đoạn, mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào ống nghiệm sạch Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P mirabilis) Thu được 24 phân đoạn có HTKS Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 12

Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Phân đoạn D(mm) s Phân đoạn D(mm) s

Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis

Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn hoạt tính sử dụng hệ dung môi Butylacetat, Aceton và Triethylamin theo tỷ lệ 1:2:1 Kết quả được trình bày trong bảng.

Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 1(hiện hình bằng P mirabilis)

Phân đoạn Vết 1 Vết 2 Phân đoạn Vết 1 Vết 2

Trong quá trình đánh giá cảm quan, chúng tôi nhận thấy có một chất màu nâu được giữ lại trên cột Các phân đoạn 1 và 2 có màu vàng nhạt, trong khi phân đoạn 3 đến 8 thể hiện màu vàng cam Đặc biệt, từ phân đoạn 9 đến 36, màu sắc dần chuyển sang vàng nhạt.

Khả năng chạy sắc kí của hệ không đạt yêu cầu, được chia thành 4 phần: Phần 1 từ phân đoạn 1 đến 4, phần 2 từ phân đoạn 5 đến 18, phần 3 từ phân đoạn 19 đến 28 và phần 4 từ phân đoạn 29 đến 36 Phân đoạn chính là từ 1 đến 4, trong khi phần 2 chứa 2 chất, bao gồm hoạt chất chính Hiệu suất tinh chế thấp đã được ghi nhận, và qua nghiên cứu trước cùng khảo sát nhiều hệ dung môi, hệ Etylacetat – methanol (10:1) cho kết quả tách vết tốt Hệ dung môi này sẽ được sử dụng cho lần chạy cột thứ hai.

Kết quả thu được từ cô phần 1 là 0,0116g bột KS màu vàng cam, với hiệu suất quá trình tinh chế lần đầu đạt 10,36% Cô phần 2 chứa 0,0655g KS hỗn hợp, sẵn sàng cho lần tách tiếp theo.

Dùng 0,0655g KS sau tinh chế lần 1, chạy cột với hệ dung môi Etylacetal: methanol (10: 1)

- Bước 2: Rửa cột bằng 15 – 20 ml n-hexan

- Bước 3: Chạy cột như bình thường

Thu được 30 phân đoạn trong đó có 20 phân đoạn có HTKS Kết quả thử HTKS được trình bày trong bảng 14

Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) s

Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, hệ dung môi chạy là hệ dung môi Ethylacetat: methanol (10:1) Kết quả được thể hiện ở bảng

Bài viết này phân tích kết quả thử nghiệm HTKS và sắc ký, chia thành 4 phần chính Phần 1, từ phân đoạn 1 đến 11, thu được 1 chất và được coi là phân đoạn chính Phần 2, từ phân đoạn 12 đến 16, có 2 chất với sự hiện diện của hoạt chất 1 Phần 3, từ phân đoạn 17 đến 25, thu được 1 chất và là phân đoạn phụ Cuối cùng, phần 4, từ phân đoạn 26 đến 30, không thu được hoạt chất nào.

Kết quả thu được từ quá trình cô phần 1 là 0,0165g KS tinh khiết, với hiệu suất tinh chế lần 2 đạt 25,19% Cô phần 2 cho 0,0225g KS hỗn hợp, sẽ được sử dụng cho lần chạy tiếp theo.

Cân 0,0225 g KS sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol (10:1)

- Bước 2: Rửa cột bằng 15-20 ml n-hexan

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol Hiện hình VSV bằng P mirabilis kết quả như sau

Bảng 3.13 : Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3(hiện hình bằng P mirabilis)

Nhận xét: Sau lần chạy sắc kí, ta thu được 2 phần có hoạt chất Phần 1 gồm phân đoạn 1 tới 11 và phần 2 từ phân đoạn 15 tới 21

Kết quả từ bảng cho thấy ở lần chạy sắc kí thứ 3, đã tách rõ ràng giữa KS 1 và KS 2, với phân đoạn chính từ 1 đến 11 Sau khi tinh chế, thu được 0,0094 g bột tinh thể KS chính màu vàng cam Hiệu suất tinh chế lần 3 đạt 41,77%, trong khi hiệu suất tổng thể là 33,48% KS tinh khiết này được sử dụng để đo phổ IR, UV, nhiệt độ nóng chảy và khối phổ.

3.8 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết

Phổ tử ngoại cho thấy các đỉnh hấp thụ tại 204 nm, 333 nm và 443 nm, từ đó cho phép dự đoán cấu trúc của KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc sự kết hợp của các đặc điểm này.

Phổ hồng ngoại: cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 17

Phổ khối lượng phân tử: dự đoán phân tử lượng là 1268, 49dvC

Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR [20] λ(nm) Nhóm chức đặc trưng λ(nm) Nhóm chức đặc trưng

3433 Liên kết hidro: nhóm amin hoặc OH nhân thơm

2925 Alkan no ( C-H) 2863 CO của ester hoặc anhydride acid (RO) 2 O

1738 -CO- của aldehyd mạch thẳng hoặc Ceton

1652 C=O của hợp chất Ceton không bão hòa= lien kết

1191,1096 Alcol, ether, ester, acid, carboxylic, anhydride (CO), hay nhóm amin (C-N)

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp với những kết luận cụ thể như sau:

 Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần bằng tác nhân hoá học thì hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 173.113 tăng lên so với mẫu sàng lọc khoảng 10-20%

 Chọn môi trường lên men chìm tổng hợp kháng sinh là MT1dt

 Kháng sinh do Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:

 Có ít nhất 3 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được

 Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 33, 48%

Kết quả sắc kí cột

Sau khi dịch lọc của dịch lên men được thu thập khoảng 7 lít, tiến hành chiết bằng ethylacetat ở pH 5, thu được 950 ml dung môi hữu cơ Dung môi này được cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, kết quả thu được 0,7232g bột kháng sinh thô để tiến hành chạy sắc ký cột.

 Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết

Cân 0,1112 g bột KS thô để chạy cột với hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1)

- Bước 2: Rửa cột bằng 15-20ml n-hexan

- Bước 3: Chạy cột với hện dung môi 3

Lấy 36 phân đoạn, mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào ống nghiệm sạch Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P mirabilis) Thu được 24 phân đoạn có HTKS Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 12

Phân đoạn D(mm) s Phân đoạn D(mm) s

Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, sử dụng hệ dung môi Butylacetat, Aceton và Triethylamin theo tỷ lệ 1:2:1 Kết quả của quá trình này được trình bày trong bảng.

Trong quá trình đánh giá cảm quan, một chất màu nâu được giữ lại trên cột Các phân đoạn 1 và 2 có màu vàng nhạt, trong khi phân đoạn 3 đến 8 mang màu vàng cam Từ phân đoạn 9 đến 36, màu sắc dần chuyển sang vàng nhạt.

Khả năng chạy sắc kí của hệ không đạt yêu cầu, được chia thành 4 phần: Phần 1 từ phân đoạn 1 đến 4, phần 2 từ phân đoạn 5 đến 18, phần 3 từ phân đoạn 19 đến 28, và phần 4 từ phân đoạn 29 đến 36 Phân đoạn chính là từ 1 đến 4, trong khi phần 2 chứa 2 chất, bao gồm hoạt chất chính Hiệu suất tinh chế thấp đã được ghi nhận, và sau khi khảo sát nhiều hệ dung môi, hệ Etylacetat – methanol (10:1) cho kết quả tách vết tốt Hệ dung môi này sẽ được sử dụng cho lần chạy cột thứ hai.

Kết quả thu được từ cô phần 1 là 0,0116g bột KS màu vàng cam, với hiệu suất tinh chế đạt 10,36% Cô phần 2 cho 0,0655g KS hỗn hợp để tiếp tục quá trình tách.

Dùng 0,0655g KS sau tinh chế lần 1, chạy cột với hệ dung môi Etylacetal: methanol (10: 1)

- Bước 2: Rửa cột bằng 15 – 20 ml n-hexan

Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, hệ dung môi chạy là hệ dung môi Ethylacetat: methanol (10:1) Kết quả được thể hiện ở bảng

Bài viết này phân tích kết quả thử nghiệm HTKS và sắc ký, chia thành 4 phần với 2 phần chính Phần 1 từ phân đoạn 1 đến 11 thu được 1 chất, là phân đoạn chính Phần 2 từ phân đoạn 12 đến 16 có 2 chất, trong đó vẫn còn hoạt chất 1 Phần 3 từ phân đoạn 17 đến 25 thu được 1 chất, được coi là phân đoạn phụ Cuối cùng, phần 4 từ phân đoạn 26 đến 30 không thu được hoạt chất nào.

Kết quả thu được từ cô phần 1 là 0,0165g KS tinh khiết với hiệu suất tinh chế lần 2 đạt 25,19% Trong khi đó, cô phần 2 cho 0,0225g KS hỗn hợp, được sử dụng cho lần chạy tiếp theo.

Cân 0,0225 g KS sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol (10:1)

- Bước 2: Rửa cột bằng 15-20 ml n-hexan

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol Hiện hình VSV bằng P mirabilis kết quả như sau

Bảng 3.13 : Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3(hiện hình bằng P mirabilis)

Nhận xét: Sau lần chạy sắc kí, ta thu được 2 phần có hoạt chất Phần 1 gồm phân đoạn 1 tới 11 và phần 2 từ phân đoạn 15 tới 21

Kết quả từ bảng cho thấy rằng trong lần chạy sắc kí thứ 3, đã tách biệt rõ ràng giữa KS 1 và KS 2, với phân đoạn chính nằm trong khoảng 1 – 11 Sau khi tinh chế, thu được 0,0094 g bột tinh thể KS chính màu vàng cam Hiệu suất tinh chế ở lần thứ 3 đạt 41,77%, trong khi hiệu suất tổng thể của quá trình tinh chế là 33,48% KS tinh khiết này sẽ được sử dụng để đo phổ IR, UV, nhiệt độ nóng chảy và khối phổ.

3.8 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết

Phổ tử ngoại cho thấy các đỉnh hấp thụ tại 204 nm, 333 nm và 443 nm, từ đó có thể dự đoán cấu trúc của hợp chất KS có chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, hoặc các dị tố, hoặc sự kết hợp của những đặc điểm này.

Phổ hồng ngoại: cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 17

Phổ khối lượng phân tử: dự đoán phân tử lượng là 1268, 49dvC

Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR [20] λ(nm) Nhóm chức đặc trưng λ(nm) Nhóm chức đặc trưng

3433 Liên kết hidro: nhóm amin hoặc OH nhân thơm

2925 Alkan no ( C-H) 2863 CO của ester hoặc anhydride acid (RO) 2 O

1738 -CO- của aldehyd mạch thẳng hoặc Ceton

1652 C=O của hợp chất Ceton không bão hòa= lien kết

1191,1096 Alcol, ether, ester, acid, carboxylic, anhydride (CO), hay nhóm amin (C-N)

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp, và dưới đây là các kết luận cụ thể.

 Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần bằng tác nhân hoá học thì hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 173.113 tăng lên so với mẫu sàng lọc khoảng 10-20%

 Chọn môi trường lên men chìm tổng hợp kháng sinh là MT1dt

 Kháng sinh do Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:

 Có ít nhất 3 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được

 Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 33, 48%

Kháng sinh tinh khiết có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại và hồng ngoại Cấu trúc phân tử của kháng sinh thường chứa các thành phần như nhân thơm, nối đôi liên hợp và dị tố Ngoài ra, các nhóm chức trong kháng sinh bao gồm ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro và amid.

Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:

 Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của

Tiếp tục thực hiện quá trình đột biến chủng Streptomyces 173.113 thông qua các phương pháp như UV, hóa chất và đột biến bậc thang nhằm phát triển chủng có khả năng tổng hợp kháng sinh vượt trội.

 Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu

Nghiên cứu các phương pháp chiết tách mới nhằm tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn Quá trình chiết tách không chỉ thu hồi kháng sinh chính mà còn giúp thu được các kháng sinh phụ, từ đó mở rộng hiểu biết và ứng dụng trong lĩnh vực này.

Tiến hành phân tích cộng hưởng từ hạt nhân để xác định các tính chất lý hóa, nhằm làm rõ cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces 173.113 tổng hợp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:

1 Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2

2 Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến và ứng dụng trong định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật

3 Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr PL129-PL131

4 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr 22-87

5 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật

6 Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr 25-57

7 Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 39-67

Tiêu đề	Góp Phần Nghiên Cứu Lên Men Sinh Tổng Hợp Kháng Sinh Nhờ Streptomyces 173.113
Tác giả	Lê Thị Thu Hiền
Người hướng dẫn	ThS. Võ Thị Thu Thủy
Trường học	Đại học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Dược sĩ
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2013
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	1,65 MB

(LUẬN văn THẠC sĩ) góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 173 113​