Nguyên tắc:
Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối thích cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng.
Tiến hành
Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 173.113 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh thể với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường= 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h.
Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất.
2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng.
Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định kháng sinh đã tinh khiết hay chưa.
Tiến hành:
Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút.
Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi.
Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.
Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.
Xác định vết theo các phương pháp sau:
- Soi đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng sắc ký vào đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ hiện mầu.
- Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản
mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
-Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết. Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin.
-Tính hệ số Rf (Retardation factor) f a R b = Trong đó:
a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết họat chất. b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.
2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không
Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không. Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ vào bình sạch, cô đến khô. Cạo, thu lấy bột kháng sinh thô.
2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột.
Các bước tiến hành:
- Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ, để 30 phút cho bão hòa.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột.
- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 1g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột, ổn định cột trong 30 phút.
- Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.
- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn chính
là các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi không còn vết có Rf tương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh.
- Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào đĩa Petri sạch, cô chân không ở 50°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết.
2.3.9 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được.
Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, khối phổ để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được.
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể
Kết quả: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên được giới thiệu ở bảng 5 Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Dạng chủn g Hoạt tính kháng sinh Dạn g chủ ng Hoạt tính kháng sinh
S.aureus P. mirabilis S.aureus P. mirabilis
D (mm) s D (mm) s D (mm) S D (mm) s 01 19,34 0,35 18,64 0,56 19 19,92 0,21 20,11 0,45 02 18,66 0,58 16.84 0,86 20 22,11 0,76 21,17 0,34 03 20,22 0,06 19,12 0,25 21 18,62 0,71 19,43 0,03 04 22,68 0,10 21,93 0,74 22 17,73 0,00 18,73 0,53 05 20,58 0,12 19,66 0,13 23 19,57 0,04 20,37 0,64 07 17.74 0,78 18.34 0,79 25 21,73 0,49 21,23 0,55 12 20,07 0,09 19,14 0,23 30 19,67 0,04 21,30 0,00 13 17,32 0,96 18,45 0,72 31 20,07 0,32 18,98 0,35 15 19,40 0,51 18,11 0,76 32 19.88 0,18 18,76 0,50 17 18,82 0,32 17,65 1,28 35 17.28 1,15 18,73 0,53 18 21,89 0,27 20,45 0,79 36 19.94 0,23 20.14 0,47 Nhận xét: Chọn 3 dạng chủng số 04, 18, 20(SLNN.04, SLNN.18, SLNN.20) cho hoạt tính KS cao nhất đem nhân giống, bảo quản và sử dụng cho các nghiên cứu về sau.Dạng chủng số 04 có HTKS cao nhất đem đột biến lần 1 bằng ánh sáng UV.
3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
Đem đột biến chủng SLNN.04 bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian 5 phút. Đánh giá HTKS 36 biến chủng sau đột biến bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 6.
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 Ký hiệu dạng biến chủng Hoạt tính kháng sinh S. aureus P. mirabilis D (mm) s % hoạt tính so với MC (mm) D s % hoạt tính so với MC ĐB1.01 25,51 0,32 116,64 24,16 0,88 112,53 ĐB1.02 22,38 0.89 102,33 22,57 0,25 105,12 ĐB1.03 24,41 0,54 111,61 23,54 0,44 109,64 ĐB1.04 23.34 0,21 106,72 22,57 0,25 105,12 ĐB1.07 25,15 0,35 114,99 23,34 0,30 108,71 ĐB1.09 24,62 0,69 112,57 23,83 0,64 110,99 ĐB1.10 23.81 0,12 108,87 22,56 0,25 105,08 ĐB1.12 22,02 0,74 100,69 23,79 0,61 110,81 ĐB1.14 22,98 0,47 105,08 23,14 0,16 107,78 ĐB1.19 24,15 0,36 110,43 22,89 0,02 106,61 ĐB1.35 23,87 0,16 109,14 22,22 0,49 103,49 MC 21,87 0,00 100,00 21,47 0,45 100,00
Nhận xét: Sau đột biến lần 1 tỷ lệ sống sót là: 1,13%. Chọn 3 biến chủng có HTKS mạnh số 01, 03, 09 (ĐB1.01, ĐB1.03, ĐB1.09) so với mẫu chứng để nhân giống, lưu giữ và sử dụng cho các nghiên cứu về sau. Riêng chủng ĐB1.01 có HTKS tốt nhất, được sử dụng cho đột biến UV lần 2.
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
Đem chủng ĐB1.01 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút. Thử HTKS của 36 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được thể hiện trong bảng 7.
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 Ký hiệu dạng biến chủng Hoạt tính kháng sinh S. aureus P. mirabilis D (mm) S % hoạt tính so với MC (mm) D S % hoạt tính so với MC ĐB2.01 26,16 0,48 104,89 24,43 0,04 97,25
ĐB2.02 27,50 0,43 110,26 26,73 0,58 106,41 ĐB2.04 25,47 0,07 102,13 24,67 0,13 98,21 ĐB2.05 26,86 0,96 107,69 25,95 1,03 103,30 ĐB2.07 26,91 1,01 107,90 25,37 0,62 100,99 ĐB2.12 24,23 0,88 97,15 23,79 0,49 94,71 ĐB2.13 25,82 0,24 103,53 25,37 0,62 97,05 ĐB2.30 24,35 0,80 97,63 23,49 0,00 93,51 ĐB2.32 24,13 0,95 96,75 23,37 0,80 93,03 ĐB2.35 25,18 0,21 100,96 24,79 0,21 98,69 ĐB2.36 25,56 0,06 102,49 25,44 0,67 101,27 MC 24,94 0,00 100,00 25,12 0,45 100,00
Nhận xét: Tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là 0,54%. Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 02, 05, 07 (ĐB2.03, ĐB2.05, ĐB2.07) so với mẫu chứng được lưu giữ, nhân giống cho các nghiên cứu về sau. Riêng biến chủng số 02 của ĐB 2 được dùng cho đột biến hóa học bằng tác nhân HNO2.
3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3
Đem chủng ĐB2.02 đột biến bằng tác nhân hóa học HNO2. Thử HTKS của 36 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được thể hiện trong bảng 8. Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 Ký hiệu dạng biến chủng Hoạt tính kháng sinh S. aureus P. mirabilis D (mm) S % hoạt tính so với MC (mm) D s % hoạt tính so với MC ĐB3.01 27,10 0.33 100,33 24,11 0,78 98,61 ĐB3.03 26,22 0,29 97,08 24,35 0,61 99,59 ĐB3.04 28,19 0,11 104,37 26,12 0,95 106,83 ĐB3.07 27,85 0,86 103,11 25,58 0,26 104,62 ĐB3.09 26,43 0,00 97,85 23,51 0,21 96,15 ĐB3.11 26,78 0,11 99,15 24,01 0,85 98,20 ĐB3.15 26,97 0,95 99,85 24,85 0,25 97,64
ĐB3.19 27,67 0,74 103,44 25,42 0,15 103,97
ĐB3.20 27,78 0,81 102,85 25,06 0,60 102,49 ĐB3.25 25,79 0,59 95,48 22,64 0,30 88,96 ĐB3.36 27,01 0,32 100,00 24,74 0,33 101,19
MC 27,01 0.12 100,00 24,45 0,00 100,00
Nhận xét: Tỷ lệ sống sót là 0,15%. Tỷ lệ sống sót khi đột biến bằng tác nhân hoá học nhỏ hơn rất nhiều so với đột biến bằng ánh sáng UV (0,15% so với 0,54%). Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 04, 07, 19(ĐB3.04, ĐB3.07, ĐB3.19) để nhân giống, lưu giữ cho các nghiên cứu sau.
3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Từ kết quả chọn MT nuôi cấy bề mặt đã tham khảo từ khóa luận trước, đã chọn được 3 MT tốt nhất là MT1, MT5 và MT6 [15]. Thực hiện lên men chìm
Streptomyces 173.113 trên 3 MTdt tương ứng là MT1dt, MT5dt và MT6dt. Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối. Thử HTKS theo phương pháp giếng thạch. Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 9.
Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men
Môi trường S.aureus P. mirabilis (mm) s (mm) s MT1 dt 24,48 0,28 22,47 0,33 MT5 dt 21,15 0,67 19,53 0,75 MT6 dt 22,37 0,21 19,76 0,59
Nhận xét: Kết quả lên men Streptomyces 173.113 trên MT1dt có HTKS mạnh nhất nên lựa chọn MT1 làm môi trường lên men cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.6 Kết quả chọn chủng lên men
Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, lần 3 đã chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 173.113. Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT1dt. Dịch lên men được lọc qua giấy lọc để loại sinh khối rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 10.
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men
Dạng chủng, biến chủng Hoạt tính kháng sinh P. mirabilis S. aureus D(mm) s D(mm) s SLNN.04 22,14 0,37 23,46 0,27 SLNN.20 22,55 0,82 23,13 0,41 ĐB1.01 24,45 0,13 25,39 0,55 ĐB1.09 23,67 0,45 25,39 0,74 ĐB2.02 26,56 0,31 27,71 0,11 ĐB2.07 26,40 0,35 27,48 0,46 ĐB3.04 28,45 0,37 29,41 0,77 ĐB3.19 27,31 0,56 29,11 0,92
Nhận xét: Theo kết quả thử HTKS, biến chủng ĐB3.04 khả năng sinh tổng hợp KS tốt nhất, chọn làm chủng lên men chìm lấy dịch cho những nghiên cứu sau
3.7 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử dụng là P. mirabilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng 11.
Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
Dung môi Thành phần Tỷ lệ Rf
Vết 1 Vết 2 1 Chloroform: methanol: amoniac
25% 2: 2: 1 - - 2 Butanol: ethanol:
dimethylformamid 3: 1: 1 - -
3 Butylacetat: aceton: triethylamin 1: 2: 1 0,31 0,42
4 Ethylacetat: propanol: aceton nitril 2: 3: 1 0,40 0,50
Nhận xét: Kết quả chỉ có hệ 3, 4 cho tách thành vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt hơn vì vết hiện hình VSV có dạng hình tròn, không có đuôi kéo dài trong khi với hệ 4 gần như giọt nước ngược, có đuôi kéo dài.
3.8 Kết quả sắc ký cột
Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 7 lít, đem chiết bằng ethylacetat ở pH 5 thu được 950 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, thu được 0,7232g bột kháng sinh thô mang chạy sắc ký cột.
Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết.
Chạy sắc ký lần 1:
Cân 0,1112 g bột KS thô để chạy cột với hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1).
- Bước 2: Rửa cột bằng 15-20ml n-hexan. - Bước 3: Chạy cột với hện dung môi 3.
Lấy 36 phân đoạn, mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P. mirabilis). Thu được 24 phân đoạn có HTKS. Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 12.
Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Phân đoạn D(mm) s Phân đoạn D(mm) s
1 17,44 0,18 14 17,49 0,22 2 18,51 0,17 15 16,34 0,60 3 22,57 0,39 16 15,79 0,00 4 24,49 0,45 17 15,40 0,57 5 24,11 0,43 18 13,54 0,09 6 23,78 0,54 19 11,12 1,00 7 23,02 0,78 20 10,42 1,12 8 22,11 0,22 21 9,67 0,70 9 21,12 0,72 22 8,05 0,24 10 20,82 0,10 23 7,00 0,00 11 19,73 0,59 24 6,30 1,33 12 19,22 1,34 25 0,00 0,00 13 18,50 0,45 26-36 0,00 0,00
Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, hệ dung môi chạy là hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1). Kết quả được thể hiện ở bảng 13.
Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 1(hiện hình bằng P. mirabilis)
Phân đoạn Vết 1 Vết 2 Phân đoạn Vết 1 Vết 2 1 0,32 - 7 0,30 0,20 2-4 0,31 - 8-18 0,3 0,20 5 0,31 0,22 19-28 - 0,20 6 0,30 0,20 29-36 - -
Đánh giá cảm quan: Có một chất màu nâu bị giữ trên cột. Phân đoạn 1, 2 có màu vàng nhat. Phân đoạn 3 đến 8 có màu vàng cam. Phân đoạn 9 đến 36, màu vàng nhạt dần.
Nhận xét: Khả năng chạy sắc kí của hệ không được tốt. Tạm thời chia hệ chạy sắc kí làm 4 phần: Phần 1 từ phân đoạn 1 đến 4, phần 2 từ phân đoạn 5 đến 18 và phần 3 từ phân đoạn 19 đến 28 và phần 4 từ phân đoạn 29 đến 36. Phân đoạn chính là phân đoạn từ 1 đến 4. Phần 2 có 2 chất trong đó có hoạt chất chính. Nhận thấy hiệu suất quá trình tinh chế thấp, dựa theo nghiên cứu trước và khảo sát một loạt hệ dung môi, nhận thấy hệ Etylacetat – methanol (10:1) cho tách vết tốt. Dùng hệ dung môi này cho chạy cột lần 2.
Kết quả: Cô phần 1 thu được 0,0116g bột KS màu vàng cam. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 1 là H1 = 10,36%. Cô phần 2 được 0,0655g KS hỗn hợp để chạy cho lần tách tiếp theo.
Chạy sắc ký lần 2
Dùng 0,0655g KS sau tinh chế lần 1, chạy cột với hệ dung môi Etylacetal: methanol (10: 1).
- Bước 1: Đưa silicagel lên cột bằng hệ dung môi đã chuẩn bị. - Bước 2: Rửa cột bằng 15 – 20 ml n-hexan.
- Bước 3: Chạy cột như bình thường.
Thu được 30 phân đoạn trong đó có 20 phân đoạn có HTKS. Kết quả thử HTKS được trình bày trong bảng 14.
Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) s
1 16,34 0 13 21,04 0,19