Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.

 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH Dược Hà Nội cung cấp:

Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 1228

Vi khuẩn Gram (-): Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định

• Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.1: Cácmôi trường nuôi cấy xạ khuẩn MT Thành phần MT1 MT5 MT6 Tinh bột 2 2,4 2 Glucose 1 Bột đậu tương 1,5 Cao thịt 0,3 Pepton 0,3 KNO3 0,1 CaCO3 0,4 (NH4)2SO4 0,2 K2HPO4 0,05 MgSO4.7H2O 0,05 NaCl 0,05 0,1 Cao nấm men 0,5 Thạch 1,8 2 2 Nước máy (ml) 100 100 100 pH 6,8-7,2

Chú thích: Đơn vị tính theo gram.

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút.

- Các môi trường lên men dịch th ể (MTdt): thành phần tương ứng như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.

• Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần

(%) Môi trường

NaCl Cao thịt Pepton Thạch pH

MT canh thang 0,5 0,3 0,5 0

7,0-7,4 MT thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,8

 Dung môi

Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng

Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (°C) Aceton 0,79 56 Acetonitril 0,782-0,783 80-82 n-Butanol 0,81 116-118 Butylacetat 0,880-0,885 117-118 Cloroform 1,470-1,480 60-62 Diclorometan 1,32 40 Ethanol 0,789-0,791 78,3 Ethylacetat 0,889-0,901 70,4 NH4OH 25% 0,880 Methanol 0,791-0,793 64,5 Triethylamin 0,726-0,728 90 n-Hexan 0,655 69

 Vật liệu chạy sắc ký

- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 3 ở trên.

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm.

2.1.2. Máy móc thiết bị

- Tác nhân gây đột biến: Ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V.

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf. - Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc. - Tủ lạnh Samsung.

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48. - Tủ sấy SL shellab.

- Lò vi sóng Whirlpool.

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030. - Cân kỹ thuật Sartorius TE 210.

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S. - Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt. - Máy cất quay Buchi Waterbath B480. - Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm. - Hộp Petri đường kính 9cm.

- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn.

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

Đo phổ nhiệt độ nóng chảy, IR, phổ UV, phổ MS.

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C.

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.

 Nguyên tắc:

Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.

 Tiến hành:

 Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106

-108 tế bào/ml.

đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105

tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.

 Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau :

- Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50oC, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.

- Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.

- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.

 Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.

 Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n = = − = = − ∑ ∑ Trong đó:

D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

i

D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3).

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên

 Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113,

cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6

 Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5

, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT1 trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

 Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.

2.3.4 Phương pháp đột biến.

 Bằng ánh sáng UV

 Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1(định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồn g độ 10-6 bằng nước vô trùng.

 Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6

, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.

 Đột biến bằng ánh sáng UV: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1đổ ra đĩa Petri vô trùng . Chiếu ánh sáng UV (λ=254 nm) vào đĩa Petri có hỗn dịch bào tử nồng độ 10-1 đặt cách nguồn sáng 60 cm, trong thời gian 5 phút. Lấy ra để vào chỗ tối 2 giờ, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

.

 Phân tán bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử sau đột biến ở các nồng độ 10-4

, 10-5, nhỏ vào hộp Petri có MT 1, dàn đều bằng que chang vô trùng rồi cho vào tủ ấm. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức: % độ sống sót = 0 N Nm x 10-6+k x 100% Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến,

N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng,

10-k: Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng.

Làm song song cả mẫu chứng. Sau 6 ngày để trong tủ ấm, thử hoạt tính kháng sinh. Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức:

% biến đổi hoạt tính =

0

D Di

x 100%

Di: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB.

D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.

Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

 Bằng tác nhân hoá học acid nitrơ (HNO2)

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 173.113 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1

(định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6bằng nước cất vô trùng.

Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6

, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.

Đột biến bằng acid nitroro: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1

cho them 0,07g NaNO2. Điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong 2-3 phút. Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

.

Phân tán bào tử sau đột biến, chọn lọc ngẫu nhiên, tính toán kết quả các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV.

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh.

Nguyên tắc:

Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối thích cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng.

 Tiến hành

Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 173.113 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.

Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh thể với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường= 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h.

Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất.

2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng.

 Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định kháng sinh đã tinh khiết hay chưa.

 Tiến hành:

Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút.

Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi.

Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.

Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.

Xác định vết theo các phương pháp sau:

- Soi đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng sắc ký vào đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ hiện mầu.

- Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản

mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.

-Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết. Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin.

-Tính hệ số Rf (Retardation factor) f a R b = Trong đó:

a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết họat chất. b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.

2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không

Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không. Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ vào bình sạch, cô đến khô. Cạo, thu lấy bột kháng sinh thô.

2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột.

Các bước tiến hành:

- Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ, để 30 phút cho bão hòa.

- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột.

- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 1g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột, ổn định cột trong 30 phút.

- Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.

- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn chính

là các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi không còn vết có Rf tương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh.

- Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào đĩa Petri sạch, cô chân không ở 50°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết.

2.3.9 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được.

Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, khối phổ để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được.

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

 Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể

 Kết quả: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên được giới thiệu ở bảng 5 Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Dạng chủn g Hoạt tính kháng sinh Dạn g chủ ng Hoạt tính kháng sinh

S.aureus P. mirabilis S.aureus P. mirabilis

D (mm) s D (mm) s D (mm) S D (mm) s 01 19,34 0,35 18,64 0,56 19 19,92 0,21 20,11 0,45 02 18,66 0,58 16.84 0,86 20 22,11 0,76 21,17 0,34 03 20,22 0,06 19,12 0,25 21 18,62 0,71 19,43 0,03 04 22,68 0,10 21,93 0,74 22 17,73 0,00 18,73 0,53 05 20,58 0,12 19,66 0,13 23 19,57 0,04 20,37 0,64 07 17.74 0,78 18.34 0,79 25 21,73 0,49 21,23 0,55 12 20,07 0,09 19,14 0,23 30 19,67 0,04 21,30 0,00