(LUẬN văn THẠC sĩ) góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 119 112​

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ NGỌC HIỆP GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MENTỞNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 119.112 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2013 download by : skknchat@gmail.com BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỢI LÊ THỊ NGỌC HIỆP GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 119.112 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Võ Thị Thu Thủy Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nợi HÀ NỢI-2013 download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths Võ Thị Thu Thủy người đã tận tình hướng dẫn từ những bước đầu tiên cho đến hoàn thiện khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học , Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội , Bộ mơn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp này cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập tại trường Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ suốt thời gian thực hiện khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm cũng kiến thức của bản thân có hạn , khóa ḷn này còn có nhiều thiếu sót Tơi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2013 Sinh viên LÊ THỊ NGỌC HIỆP download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh .2 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2.Đại cương xạ khuẩn .3 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn .4 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh……………………………………….…6 1.4.Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn .6 1.4.1 Mục đích 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao sáng lọc ngẫu nhiên .7 1.4.3 Đột biến cải tạo giống… 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………………………………… 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Các phương pháp lên men 1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men .10 1.6 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10 1.6.1 Vai trò chiết tách tinh chế kháng sinh 10 1.6.2 Các phương pháp chiết tách 11 1.7.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến 12 1.7.2 Phổ hồng ngoại .12 1.7.3 Khối phổ 13 download by : skknchat@gmail.com 1.8 Một số nghiên cứu liên quan…………………………………………………… 13 1.8.1 So sánh glucose glycerol làm nguồn carbon cho sản xuất ε-poly- L-Lysin từStreptomyces sp M-Z18………………………………………………………… 13 1.8.2 Tinh chế lực Phosphoprotein xác định protein tham gia vào Sadenosyl-L-methionine làm tăng cường sản xuất kháng sinh Streptomycescoelicolor……………………………………………………………… .14 1.8.3 Xác định định hoạt tính sinh học nhóm gồm 51 macrolide cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide Streptomyces ambofaciens……… .14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu .16 2.1.2 Máy móc thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu .18 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 18 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 18 2.2.3 Sơ xác định số tính chất kháng sinh thu .19 2.3 Phương pháp thực nghiệm 19 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 19 2.3.3 Chọn lọc ngẫu nhiên 20 2.3.4 Đột biến ……………………… 21 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh .22 2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 23 2.3.7 Tách thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng .23 2.3.8 Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay 24 download by : skknchat@gmail.com 2.3.9 Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột .24 2.3.10 Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu .25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 26 3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 26 3.2 Kết đột biến cải tạo giống lần .27 3.3 Kết đột biến cải tạo giống lần .27 3.4 Kết đột biến hóa học HNO2 28 3.5 Kết chọn mơi trường lên men chìm 29 3.6 Kết chọn chủng lên men 30 3.7 Kết chọn dung môi pH chiết .30 3.8 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 3.9 Kết sắc kí cột………………… .32 3.9.1 Kết sắc ký cột lần 32 3.9.2 Kết sắc ký cột lần 34 3.9.3 Kết sắc ký cột lần 36 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC 6633 Trung tâm giữ giống Hoa Kỳ BV 108 Bệnh viện 108 B.subtilis Bacillussubtilis ATCC 6633 ĐB1 Đột biến lần ĐB2 Đột biến lần ĐBHH Đột biến hóa học G(+) Gram dương G(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MT1dt Môi trường dịch thể MT2dt Môi trường dịch thể MT6dt Môi trường dịch thể P mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên VSV Vi sinh vật download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các vi khuẩn kiểm định Bảng 2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 4: Các dung môi sử dụng Bảng 5: Kết thử HTKS sàng học ngẫu nhiên Bảng 6: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 7: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 8: Kết thử HTKS đột biến hóa học Bảng 9: Kết chọn mơi trường lên men chìm Bảng 10: Kết chọn chủng lên men Bảng 11: Kết chọn dung môi pH chiết Bảng 12: Kết SKLM chọn hệ dung môi Bảng 13: Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy sắc ký lần Bảng 14: Kết SKLM sau chạy cột lần Bảng 15: Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy sắc ký lần Bảng 16: Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 17: Kết thử HTKS nhóm sau chạy cột Bảng 18: Kết SKLM nhóm sau chạy cột Bảng 19: Kết thử HTKS nhóm sau chạy cột Bảng 20: Kết SKLM nhóm sau chạy cột Bảng 21: Kết IR download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Sơ đồ chế tác dụng họ kháng sinh Hình 2: Sơ phân loại xạ khuẩn Hình 3: Các khuẩn ty xạ khuẩn Hình 4: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 5: Đường cong sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Hình 6: Pic sắc ký cột lần Hình 7: Pic sắc ký cột lần Hình 8: Pic sắc ký cột lần nhóm Hình 9: Pic sắc ký cột lần nhóm Hình PL1: Xạ khuẩn giai đoạn phát triển 5-6 ngày Hình PL2: Kết đột biến ánh sáng UV Hình PL3: Thử HTKS phương pháp khối thạch(P mirabilis) Hình PL4: Thử HTKS phương pháp giếng thạch (B subtilis) Hình PL5: Thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc(B subtilis) Hình PL6: Kết chọn MT lên men chìm Hình PL7: Kết chọn chủng lên men Hình PL8: Kết SKLM sau chạy cột lần Hình PL9: Kết chạy sắc ký cột Hình PL10: Kết đo phổ UV kháng sinh Hình PL11: Kết đo phổ IR kháng sinh Hình PL12: Kết đo phổ khối kháng sinh download by : skknchat@gmail.com ĐẶT VẤN ĐỀ Việc khám phá phát triển kháng sinh tạo lực vũ khí hữu hiệu giúp người chống lại vi khuẩn Phạm vi điều trị kháng sinh không dừng lại bệnh nhiễm khuẩn, mà kháng sinh dùng ngày nhiều để điều trị ung thư Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển kháng sinh có xu hướng giảm theo thời gian Trong đó, mơ hình bệnh nhiễm khuẩn ngày đa dạng, việc sử dụng kháng sinh ngày tràn lan, tình hình kháng kháng sinh ngày gia tăng mối lo ngại toàn cầu Hiện trạng tiếng chng cảnh báo, người thua chiến chống vi khuẩn Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất kháng sinh có hiệu điều trị cao, độc tính thấp bị kháng thuốc yêu cầu tất yếu cấp thiết công bảo vệ chăm sóc sức khỏe người dân Trong tất kháng sinh biết đến có khoảng 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn 60% số thuộc chi Streptomyces Đó sở để nhà khoa học nước ta tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn Chính vậy, em chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 119.112” làm khóa luận tốt nghiệp Chủng Streptomyces 119.112 Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường đại học Dược Hà Nội phân lập cung cấp Khóa luận mong muốn đạt mục tiêu sau đây: - Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces 119.112bằng sàng lọc ngẫu nhiên đột biến cải tạo giống - Lựa chọn mơi trường biến chủng thích hợp cho trình lên men - Chiết tách tinh chế kháng sinh thu - Từng bước xác định đánh giá tính chất vật lý cấu trúc hóa học kháng sinh chủng Streptomyces 119.112 download by : skknchat@gmail.com 41 18,45 0,09 18 18,72 0,06 18,62 0,50 19 19,57 0,62 17,54 0,46 20 17,57 0,02 19,02 1,00 21 14,64 0,09 10 19,36 0,20 22 13,02 0,20 11 19,42 0,08 23 11,36 0,15 12 19,56 0,21 24-26 00,00 0,00 Hình 9: Pic sắc ký cột lần nhóm Tiến hành sắc ký lớp mỏng phân đoạn hệ dung môi Ethylacetat: Methanol (10:1).Kết trình bày bảng 20 Bảng 20: Kết SKLM nhóm sau chạy cột Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2) Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2) 0,66 0,58 11 - 0,56 0,67 0,58 12 - 0,54 download by : skknchat@gmail.com 42 0,71 0,60 13 - 0,57 0,68 0,57 14 - 0,54 0,66 0,54 15 - 0,58 0,64 0,58 16 - 0,58 0,68 0,54 17 - 0,60 10 - 0,56 18-23 - - Nhận xét: Từ kết bảng 19, 20 ta thấy có chất KS thứ phân đoạn (1017), gộp lại đem cô 0,002g bột KS màu đỏ Hiệu suất chất Hchất 2%=11,17% Như vậy: sau tách sắc ký cột thu được: chất KS thứ 1(chất chính), hỗn hợp KS chất KS thứ HKS1%=H2+H3=16,91+3,29=20,20% bột KS màu đỏ, bột KS dùng để đo phổ UV, IR, MS, nhiệt độ nóng chảy HKS2%=11,17% bột KS màu đỏ cam 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh: 216ºC Phổ tử ngoại: cho đỉnh hấp thụ ở: 208,50nm; 230nm 442,50 nm Từ đó, dự đốn cấu trúc KS có nhân thơm, nối đơi liên hợp, dị tố, kết hợp đặc điểm trên.(xem PL10) Phổ hồng ngoại: cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại nhóm chức dự đốn tương ứng trình bày bảng 21.(xem PL11) Bảng 21: Kết IR Đỉnh hấp thụ (cm-1) Nhóm chức đặc trưng download by : skknchat@gmail.com 43 3265 2956, 2925,2854 1740 1668,1648 Amin (> N-H) Alkan (C-H) C-O aldehyd C=O ester C=C alken C=O amid, nitro-NO2 1583 Nitro (-NO2) 1466,1409 Imin (>C=N-) 1377 Nhóm nitro, alkyl fluorid 1268 Nhóm nitro, alkyl fluorid, ether thơm 1192, 1121, 1074 949, 823,722 644 C-O C-N amin C-F alkyl florid Alkan (C-H) C-H C-Cl anlky chlorid Phổ khối(MS): Khối lượng phân tử 1268,42 đvC (hình PL12) download by : skknchat@gmail.com 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, chúng tơi hồn thành mục tiêu ban đầu khóa luận tốt nghiệp Các kết luận cụ thể sau: - Qua lần đột biến UV hoạt tính kháng sinh Streptomyces 119.112tăng lên đáng kể -Tìm MT ni cấy bề mặt tốt MT1 MT lên men chìm tốt với chủng Streptomyces 119.112 MT1dt, biến chủng ĐB2.18 có khả sinh tổng hợp KS mạnh - Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi ethylacetat pH cho hiệu tốt nhất, sử dụng hệ dung môi butylacetat: ethanol: triethylamin (1: 2: 1) hệ ethylacetat: methanol (10: 1) để tách thành phần kháng sinh - Kháng sinh Streptomyces 119.112sinh tổng hợp có số đặc điểm sau: + Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, vi khuẩn Gram(+) vi khuẩn Gram(-) + Tương đối bền với nhiệt độ + Tách riêng thành phần kháng sinh thô thu được: hỗn hợp kháng sinh, kháng sinh 1(KS1) KS chính, kháng sinh (KS2) + Kháng sinh thơ thu có thành phần + Hiệu suất tinh chế kháng sinh: - HKS1%=20,20% - HKS2%=11,17% + Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 216ºC, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại, phổ khối Cấu trúc phân tử kháng sinh dự đốn có chứa nhân thơm, nối đơi liên hợp, dị tố, nhóm chức có kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, amin, nitro, … download by : skknchat@gmail.com 45 ĐỀ XUẤT Từ kết thu được, đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu theo hướng sau: - Tiến hành giải trình tự gen để xác định xác tên khoa học Streptomyces 119.112 - Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 119.112(bằng UV, hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang, …) để tạo chủng có khả siêu sinh tổng hợp kháng sinh - Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu - Nghiên cứu phương pháp chiết, tách để tạo kháng sinh với độ tinh khiết hiệu suất cao Chiết tách để thu lấy kháng sinh phụ nghiên cứu sâu - Tiến hành phổ khối, cộng hưởng từ hạt nhân, xác định tính chất lý, hóa, … để xác định xác cấu trúc hóa học kháng sinh Streptomyces 119.112sinh tổng download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2 Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr PL129-PL131 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr 25-57 Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 39-67 Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập Võ Thị Bạch Huệ (2008) ,Hóa phân tích, NXB y học, tập 2, tr 58-122, tr 205-225 Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 10 Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 737 11 Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp 12 Trịnh Mai Phương, Góp phần nâng cao sinh tổng hợp khángsinh nhờStreptomyces 119.112, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ khóa 2006-2012, Trường ĐH Dược Hà Nội 13 Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 35-57 14 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr 40-52 download by : skknchat@gmail.com 15 Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB Y học, Hà Nội 16 Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập Tiếng Anh: 17 Chen XS, Mao ZG (2013), ‘‘Comparison of Glucose and Glycerol as Carbon Sources for ε-Poly-L-Lysine Production by Streptomyces sp M-Z18’’ The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University 18 Meng L, Yang SH, Palaniyandi SA, Lee SK, Lee IA, Kim TJ, Suh JW (2013), ‘‘Phosphoprotein affinity purification identifies proteins involved in Sadenosyl-L-methionine-induced enhancement of antibiotic production in Streptomyces coelicolor’’, Division of Bioscience and Bioinformatics, College of Natural Science, Myongji University, Gyeonggi-Do, Korea 19 Laureti L, Song L, Huang S, Corre C, Leblond P, Challis GL, Aigle B (2013), ‘‘Identification of a bioactive 51-membered macrolide complex by activation of a silent polyketide synthase in Streptomyces ambofaciens’’Unité Mixte de Recherche1128 Génétique et Microbiologie, Université Henri Poincaré, France download by : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC Hình PL1: Xạ khuẩn giai đoạn phát triển 5-6 ngày Hình PL2: Kết đột biến ánh sáng UV download by : skknchat@gmail.com Hình PL3: Thử HTKS phương pháp khối thạch(P mirabilis) Hình PL4: Thử HTKS phương pháp giếng thạch(B subtilis) download by : skknchat@gmail.com Hình PL5: Thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc (B subtilis) Hình PL6: Kết chọn MT lên men chìm download by : skknchat@gmail.com Hình PL7: Kết chọn chủng lên men Hình PL8: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột lần download by : skknchat@gmail.com Hình PL9: Kết chạy sắc ký cột download by : skknchat@gmail.com Hình PL10: Kết đo phổ UV kháng sinh download by : skknchat@gmail.com BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Nguoi do: Nguyen Thi Son DT: 0912140352 Resolution: 4cm-1 Mail: sonhuco@yahoo.com Date: 3/13/2013 Mau Hp 100.0 95 644 90 823 744 85 949 80 75 70 3265 1409 1377 65 1074 1121 60 1192 55 1268 50 1583 1668 1648 %T 45 2854 2956 40 1466 1740 35 30 25 2925 20 15 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 Hình PL11: Kết đo phổ IR kháng sinh download by : skknchat@gmail.com 600.0 Hình PL12: Kết đo phổ khối download by : skknchat@gmail.com ... 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Các phương pháp lên men 1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men .10 1.6 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men. .. gốc từ xạ khuẩn 60% số thuộc chi Streptomyces Đó sở để nhà khoa học nước ta tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn Chính vậy, em chọn đề tài: ? ?Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces. .. khuẩn mơi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng tủ lạnh 2°C định kỳ 3-6 tháng cấy lại lần [9], [13] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh Lên men trình trao đổi chất sinh học tiến