Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết

P. mirabilis B.subtilis (mm) s % hoạt tính so với MC (mm) s % hoạt tính so với MC ĐB2.01 24,30 0,12 109,86 25,36 0,13 115,06 ĐB2.02 19,37 0,31 87,58 20,13 0,31 91,33 ĐB2.05 20,78 0,41 93,94 21,38 0,20 101,14 ĐB2.08 20,72 0,35 102,98 20,94 0,29 97 ĐB2.10 25,12 0,09 93,67 25,18 0,61 114,25 ĐB2.12 24,12 0,16 109,04 24,06 0,35 109,17 ĐB2.18 26,94 0,11 104,52 26,02 0,48 118,06 ĐB2.20 23,60 0,27 106,69 24,65 0,59 111,84 ĐB2.25 25,04 0,49 113,61 22,08 0,93 100,18 MC 22,12 0,12 100,00 22,04 0,09 100,00

Nhận xét: Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 1, 10, 18 (ĐB2.1, ĐB2.10, ĐB2.18). Trong đó chủng tốt nhất là dạng chủng 18. Đây là dạng chủng chính giữ lại để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

3.4. Kết quả đột biến hóa học bằng HNO2

Lấy chủng tốt nhất của đột biến lần 2 là chủng 18 đem đột biến hóa học bằng HNO2. Chỉnh pH xuống 4,5 trong thời gian 3 phút rồi nâng lên pH=7-8. Tỉ lệ sống sót

là 0,022%. Tuyển chọn ngẫu nhiên 33 chủng và thử HTKS bằng phương pháp khối thạch thu được kết quả chính ở bảng 8.

Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến HH

Ký hiệu dạng

biến chủng

Hoạt tính kháng sinh

P. mirabilis B.subtilis (mm) s % hoạt tính so với MC (mm) s % hoạt tính so với MC HH.06 24,75 0,18 102,44 22,48 0.33 100,65 HH.08 26,82 0,28 111 22,12 0,54 90,95 HH.12 26,02 0,16 111 26,78 0,26 110,03 HH.13 21,46 0,28 107,69 22,91 0,38 94,20 HH.15 27,88 0,31 115,39 26,20 0,61 107,73 HH.16 23,66 0,19 97,93 22,55 0,24 92,72 HH.21 27,54 0,24 113,99 28,04 0,30 115,30 HH.25 25,76 0,27 106,62 23,52 0,38 96,71 HH.30 24,16 0,28 100 23,10 0,14 94,98 MC 24,16 0,31 100 24,32 0,33 100

Nhận xét: Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 12, 15, 21(ĐB2.12, ĐB2.15, ĐB2.21). Trong đó chủng tốt nhất là dạng chủng 21. Đây là dạng chủng chính giữ lại để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm

Từ kết quả chọn MT nuôi cấy bề mặt, đã chọn được 3 MT tốt nhất là MT1, MT2 và MT6. Thực hiện lên men chìm Streptomyces 119.112 trên 3 MTdt tương ứng là MT1dt, MT2dt và MT6dt. Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối. Thử HTKS theo phương pháp giếng thạch. Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 9.

Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men chìm

VSV kiểm định MT1dt MT2dt MT6dt

(mm) s (mm) S (mm) S

B.subtilis 24,06 0,18 23,36 0,26 21,20 0,30 P. mirabilis 25,00 0,12 24,90 0,09 22,00 0,71

Nhận xét: Trong 3 môi trường lên men chìm thì MT1dt là môi trường sinh kháng sinh có hoạt tinh tốt nhất. Vì vậy, chọn MT1dt là MT lên men chìm hiệu quả nhất.

3.6. Kết quả chọn chủng lên men

Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, hóa học đã chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 119.112. Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT1dt. Dịch lên men được lọc qua giấy lọc để loại sinh khối rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.Kết quả được trình bày ở bảng 10.

Bảng 10: Kết quả chọn chủng lên men

Dạng chủng, biến chủng

Hoạt tính kháng sinh

P. mirabilis B.subtilis (mm) S (mm) s SLNN.5 19,10 0,20 18,32 0,69 SLNN.19 26,50 0,31 23,24 0,11 SLNN.20 19,94 0,14 18,46 0,67 ĐB1.26 20,28 0,29 20,64 0,11 ĐB1.27 25,80 0,21 27,26 0,26 ĐB1.28 28,84 0,16 29,22 0,47 ĐB2.1 24,16 0,42 23,52 0,34 ĐB2.10 24,00 0,02 26,84 0,18 ĐB2.18 29,40 0,43 33,44 1,03

HH.12 23,84 0,41 22,56 0,24

HH.15 22,12 0,47 22,48 0,26

HH.21 22,30 0,21 22,64 0,22

Nhận xét:Từ kết quả trên, chọn chủng ĐB2. 18 của đột biến bằng ánh sáng UV để lên men tạo kháng sinh.

3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết

Thực hiện chiết dịch lọc với 4 dung môi: ethylacetat, n-butanol, butylacetat, dichloromethan, ở 5 pH 3, 5, 7, 9, 11. Thử HTKS của pha nước và pha dung môi bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 11.

Bảng 11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P. mirabilis)

pH Pha

Ethylacetat n-Butanol Butylacetat Dichloromethan

(mm) s (mm) S (mm) s (mm) s 3 Dung môi 20,83 0,55 20,78 0,49 15,35 0,88 17,89 0,68 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 8,35 0,30 9,81 0,99 5 Dung môi 19,23 0,55 19,47 0,02 16,28 0,10 17,48 1,03 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 9,62 0,68 7 Dung môi 19,80 0,47 19,67 0,35 14,83 0,58 7,79 0,32 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 10,29 0,83 9,00 1,50 9 Dung môi 17,25 0,67 17,23 0,22 14,85 0,80 18,53 0,44 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 8,70 1,53 10,10 0,68 11 Dung môi 14,94 0,12 13,39 0,04 10,11 1,39 9,61 0,38 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 8,72 0,59 0,00 0,00

Nhận xét: Dung môi ethylacetal và n-butanol đều chiết kiệt kháng sinh trong dịch lọc ở các pH khác nhau, HTKS cũng tương đương nhau nhưng lựa chọn

ethylacetat bởi vì khi chiết bằng butanol tạo rất nhiều nhũ tương, làm giảm hiệu suất chiết đáng kể. Hơn nữa, n-butanol là dung môi độc hơn so với ethylacetat.

HTKS khi chiết ở pH 3 có giá trị cao nhất.

Vậy chọn dung môi ethylacetat để chiết và chiết ở pH 3.

3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi

Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử dụng là B.subtilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng 12.

Bảng 12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Dung môi Thành phần Tỷ lệ Rf

1 Chloroform: methanol: amoniac 25% 2: 2: 1 0,82 2 Butanol: ethanol: dimethylformamid 3: 1: 1 0,75 3 Butylacetat: ethanol: triethylamin 1: 2: 1 0,67 4 Ethylacetat:propanol:dichloromethan 2: 2: 1 0,83

Nhận xét: Cả 4 hệ đều cho kết quả có vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt hơn cả vì vết hiện hình VSV có hình ngọn đuốc, trong khi với các hệ 1, 2, 4 vết gần như hình tròn.

3.9. Kết quả sắc ký cột

Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 5,3 lít, đem chiết bằng ethylacetat ở pH=3 thu được 750 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, thu được 0,5238g bột kháng sinh thô.

3.9.1. Kết quả sắc ký cột lần 1

Cân một lượng 0,1062g kháng sinh thô, cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel với hệ3 - Butyl acetat: ethanol: triethylamin tỷ lệ (1: 2: 1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi

phân đoạn 5ml vào ống nghiệm sạch.Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên B.subtilis).Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 13.

Bảng 13: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Phân đoạn (mm) s Phân đoạn (mm) s

1 00,00 0,00 14 16,52 0,60 2 27,00 0,15 15 15,26 0,06 3 26,20 0,54 16 17,26 0,32 4 26,12 0,57 17 18,00 0,31 5 26,00 0,08 18 18,24 0,18 6 24,00 0,67 19 18,52 0,34 7 22,50 0,21 20 16,02 0,30 8 19,12 0,21 21 13,48 0,11 9 17,26 0,49 22 12,24 0,37 10 15,34 0,13 23 10,16 0,11 11 18,28 0,20 24 8,14 0,29 12 17,02 0,31 25 7,36 0,16 13 17,48 0,02 26-30 00,00 0 Hình 6: Pic sắc ký cột lần 1

Nhận xét: Khả năng tách của hệ không được tốt. Tạm thời chia các phân đoạn sắc ký thành các nhóm dựa trên HTKS của nó. Nhóm 1: từ phân đoạn 2 đến 9; nhóm 2: từ phân đoạn 15 đền 20.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với các phân đoạn bằng hệ dung môi chạy là hệ

ethylacetat : methanol (10:1). Kết quả được thể hiện ở bảng 14.

Bảng 14: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột lần 1

Phân đoạn 2 3 4 5 6 7-9 15-20

Rf1 0,90 0,90 0,89 0,90 0,88 0,86 -

Rf2 0,82 0,80 0,79 0,79 0,76 0,75 -

Nhận xét:Từ kết quả sắc ký ta tạm thời chia các phân đoạn thành 2 nhóm:

- Nhóm 1 (phân đoạn 2 đến 9) có ít nhất là 2 thành phần, đem cô được 0,0485g bột KS. Hiệu suất tinh chế lần 1 là H1=45,67%.

- Nhóm 2 (phân đoạn 15 đến 19) đây là thành phần phụ.

3.9.2. Kết quả sắc ký cột lần 2

Gộp dịch từ phân đoạn 2 đến 9, cô chân không đến kết tinh, chạy cột sắc ký bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol(10:1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml vào ống nghiệm sạch.Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên

B.subtilis).Kết quả được trình bày ở bảng 15.

Bảng 15: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2

Phân đoạn (mm) s Phân đoạn (mm) s

1 22,86 0,44 14 14,02 0,14

2 21,54 0,22 15 10,68 0,25

3 20,46 0,10 16 14,54 0,40

4 20,32 0,44 17 15,16 0,45

6 17,14 0,42 19 16,20 0,47 7 15,80 0,39 20 17,48 0,17 8 15,83 0,20 21 11,36 0,02 9 16,36 0,24 22 10,88 0,73 10 17,02 0,24 23 9,72 0,39 11 18,54 0,17 24 8,64 0,07 12 14,76 0,67 25 00,00 0,00 13 14,08 0,32 26-30 00,00 0,00 Hình 7: Pic sắc ký cột lần 2

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol (10:1).Kết quả được trình bày ở bảng 16.

Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2

1 0,68 - 13 0,54 0,46 2 0,64 - 14 0,53 0,41 3 0,68 - 15 0,62 0,48 4 0,67 - 16 0,61 0,48 5 0,65 - 17 0,71 0,61 6 0,56 0,46 18 0,74 0,61 7 0,57 0,48 19 0,61 0,51 8 0,59 0,47 20 0,64 0,58 9 0,57 0,45 21 0,64 0,56 10 0,58 0,46 22 0,69 0,52 11 0,59 0,45 23 0,70 0,59 12 0,54 0,48 24-30 - -

Nhận xét:Từ kết quả sắc ký ta tạm thời chia các phân đoạn thành 3 nhóm:

- Nhóm 1: phân đoạn (1- 5 ) đem cô được 0,0082g bột KS màu đỏ, hiệu suất tinh chế lần 2 là H2=16,91%.Đây là KS chính (do có HTKS cao nhất).

- Nhóm 2: phân đoạn ( 6-15 ) đem cô được 0,0218g bột KS .Tiếp tục chạy cột để tách tiếp thu kháng sinh.

- Nhóm 3: phân đoạn (15-24 ) cô được 0,0179 g bột KS. Tiếp tục chạy cột để tách tiếp thu kháng sinh.

3.9.3. Kết quả sắc ký cột lần 3

• Tiến hành sắc ký cột nhóm 2:

Lấy 0,0218g bột KS sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat:

Methanol (10:1)thu được 20 phân đoạn. Thử HTKS các phân đoạn, kết quả được

Bảng 17: Kết quả thử HTKS nhóm 2 sau chạy cột

Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) S

1 00,00 00,00 9 16,60 0,84 2 22,71 0,35 10 15,78 0,67 3 21,53 0,65 11 10,02 0,38 4 20,79 0,61 12 9,64 0,42 5 20,35 1,28 13 8,38 0,56 6 18,27 0,71 14 8,16 0,14 7 17,72 0,24 15 7,12 0,62 8 15,67 1,53 16-20 00,00 00,00 Hình 8: Pic sắc ký cột lần 3 nhóm 2

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol (10:1). Kết quả được trình bày ở bảng 18.

Bảng 18: Kết quả SKLM nhóm 2 sau chạy cột

Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2) Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2)

2 0,67 - 9 0,64 0,52 3 0,68 - 10 0,65 0,55 4 0,64 - 11 0,64 0,54 5 0,68 - 12 0,67 0,56 6 0,65 - 13 0,68 0,57 7 0,64 - 14 0,68 0,56 8 0,70 0,59 15 0,69 0,59

Nhận xét: Từ kết quả trên ta chia thành 2 phân nhóm:

- Phân nhóm 1: phân đoạn ( 2-7 ) đem cô được 0,0016g bột kháng sinh màu đỏ, hiệu suất tinh chế lần 3 là H3=3,29%.

- Phân nhóm 2: phân đoạn (8-15 ) cô được 0,020g bột KS màu đỏ cam.

• Tiến hành sắc ký cột nhóm 3:

Lấy 0,0180g bột KS sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat:

Methanol (10:1)thu được 26 phân đoạn. Thử HTKS các phân đoạn, kết quả được

trình bày ở bảng 19.

Bảng 19: Kết quả thử HTKS nhóm 3 sau chạy cột

Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) s

3 17,04 0,61 15 20,45 0,54

4 18,02 0,46 16 20,54 0,83

6 18,45 0,09 18 18,72 0,06 7 18,62 0,50 19 19,57 0,62 8 17,54 0,46 20 17,57 0,02 9 19,02 1,00 21 14,64 0,09 10 19,36 0,20 22 13,02 0,20 11 19,42 0,08 23 11,36 0,15 12 19,56 0,21 24-26 00,00 0,00 Hình 9: Pic sắc ký cột lần 3 nhóm 3

Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol (10:1).Kết quả được trình bày ở bảng 20.

Bảng 20: Kết quả SKLM nhóm 3 sau chạy cột

Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2) Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2)

3 0,66 0,58 11 - 0,56

5 0,71 0,60 13 - 0,57 6 0,68 0,57 14 - 0,54 7 0,66 0,54 15 - 0,58 8 0,64 0,58 16 - 0,58 9 0,68 0,54 17 - 0,60 10 - 0,56 18-23 - -

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 19, 20 ta thấy có chất KS thứ 2 ở phân đoạn (10- 17), gộp lại đem cô được 0,002g bột KS màu đỏ.

Hiệu suất chất 2 là Hchất 2%=11,17%.

Như vậy: sau khi tách bằng sắc ký cột thu được: chất KS thứ 1(chất chính), hỗn hợp KS và chất KS thứ 2.

HKS1%=H2+H3=16,91+3,29=20,20% bột KS màu đỏ, bột KS này dùng để đo phổ UV, IR, MS, nhiệt độ nóng chảy.

HKS2%=11,17% bột KS màu đỏ cam.

3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết

Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh: 216ºC.

Phổ tử ngoại: cho các đỉnh hấp thụ ở: 208,50nm; 230nm và 442,50 nm. Từ đó, dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc điểm trên.(xem PL10)

Phổ hồng ngoại: cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 21.(xem PL11)

Bảng 21: Kết quả IR

Đỉnh hấp thụ (cm-1

3265 Amin (> N-H) 2956, 2925,2854 Alkan (C-H)

1740 C-O aldehyd hoặc C=O ester

1668,1648 C=C alken hoặc C=O amid, nitro-NO2

1583 Nitro (-NO2) 1466,1409 Imin (>C=N-)

1377 Nhóm nitro, alkyl fluorid.

1268 Nhóm nitro, alkyl fluorid, ether thơm.

1192, 1121, 1074 C-O hoặc C-N amin hoặc C-F alkyl florid 949, 823,722 Alkan (C-H)

644 C-H hoặc C-Cl anlky chlorid

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau:

- Qua 2 lần đột biến bằng UV thì hoạt tính kháng sinh của Streptomyces

119.112tăng lên đáng kể.

-Tìm được MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất là MT1 và MT lên men chìm tốt nhất với chủng Streptomyces 119.112 là MT1dt, biến chủng ĐB2.18 có khả năng sinh tổng hợp KS mạnh nhất.

- Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi ethylacetat ở pH 3 cho hiệu quả tốt nhất, sử dụng hệ dung môi butylacetat: ethanol: triethylamin (1: 2: 1) và hệ ethylacetat: methanol (10: 1) để tách các thành phần kháng sinh.

- Kháng sinh do Streptomyces 119.112sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:

+ Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn Gram(-)

+ Tương đối bền với nhiệt độ

+ Tách riêng được 3 thành phần trong kháng sinh thô thu được: hỗn hợp kháng sinh, kháng sinh 1(KS1) là KS chính, kháng sinh 2 (KS2).

+ Kháng sinh thô thu được có ít nhất 3 thành phần + Hiệu suất tinh chế kháng sinh:

- HKS1%=20,20% - HKS2%=11,17%

+ Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 216ºC, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại, phổ khối. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể có chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, các nhóm chức có trong kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, amin, nitro, …

ĐỀ XUẤT

Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:

- Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của

Streptomyces 119.112.

- Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 119.112(bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang, …) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.

- Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu.

- Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn. - Tiến hành phổ khối, cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa, … để xác định chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces