KỸ THUẬT SINH HÓA SỬ DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME

CHUƠNG KỸ THUẬT SINH HÓA SỬ DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME Enzyme chất xúc tác hệ thống sinh học Chúng có khả xúc tác đặc biệt, thường mạnh nhiều so với chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác chúng mang tính đặc hiệu cao chất, làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng hóa học xảy môi trường nước điều kiện nhiệt độ pH êm dịu Enzyme chìa khóa để hiểu biết q trình hoạt động sống tế bào Hoạt động trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định đường trao đổi chất mà nhờ chất dinh dưỡng bị phân hủy, lượng hóa học lưu giữ biến đổi, đại phân tử sinh học tạo từ chất tiền thân đơn giản Một số enzyme tham gia trình trao đổi chất enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm tín hiệu trao đổi chất khác cách thay đổi hoạt tính xúc tác chúng cách thích hợp Thơng qua hoạt động enzyme điều hòa hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với để tạo mối quan hệ hài hòa hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc trì sống 7.1 Ý nghĩa việc nghiên cứu động học enzyme Nghiên cứu động học enzyme nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố: nồng độ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme cho ta biết vấn đề sau đây: - Có thể biết chế phân tử tác động enzyme - Cho phép ta hiểu biết mối quan hệ mặt lượng trình enzyme - Thấy vai trò quan trọng mặt lý luận lẫn thực tiễn: lựa chọn đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết điều kiện tốt hoạt động enzyme, cần phải biết yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chúng - Là điều kiện cần thiết để thực tốt bước tinh chế enzyme, người ta cần phải kiểm tra mặt lượng cách xác định có hệ thống hoạt động chế phẩm enzyme giai đoạn tinh chế 7.2 Động học phản ứng enzyme 7.2.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme Trong điều kiện dư thừa chất, nghĩa [S] >>[E] tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E], v= K[E] có dạng y=ax Nhờ người ta đo [E] cách đo vận tốc phản ứng enzyme xúc tác 114 Có nhiều trường hợp mơi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác khơng phụ thuộc tuyến tính với [E] Hình 7.1 Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào [E] 7.2.2 Ảnh hưởng nồng độ chất [S] Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chất Gọi v1 vận tốc phản ứng tạo thành phức chất ES Gọi v-1 vận tốc phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E S Gọi v2 vận tốc phản ứng tạo thành E P (sản phẩm) v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] 115 Khi hệ thống đạt trạng thái cân ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2) nồng độ ban đầu: Gọi E0 [E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S] k1 [E0] [S] [ES] = -k-1+ k2+k1[S] Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1 (Km: gọi số Michalis Menten) Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S] Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V = k2[ES] Thay [ES] giá trị ta thu được: k2[E0] [S] v = - (4) Km + [S] Qua ta thấy nồng độ enzyme cao vận tốc phản ứng enzyme lớn Vận tốc đạt cực đại toàn enzyme liên kết với chất, nghĩa là: Vmax= k2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được: [S] v = Vmax - (5) Km+ [S] Phương trình (5) gọi phương trình Michelis Menten Km gọi số Michelis Menten đặc trưng cho enzyme Km đặc trưng cho lực enzyme với chất, Km có trị số nhỏ lực enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn Ý nghĩa thực tiển số Michaelis chỗ giá trị nồng độ chất tốc độ phản ứng ½ tốc độ tối đa Thay V v số tương ứng 116 0,5 vào phương trình trên, ta thấy rõ điều Như vậy, Km đo đơn vị nồng độ, tức mol/l Hằng số Michaelis số quan trọng Nó xác định lực enzyme với chất Km nhỏ lực lớn, tốc độ phản ứng cao tốc độ tối đa V đạt giá trị nồng độ chất thấp Trên sở phương trình Michaelis-Menten, cách xây dựng đường biểu diễn phụ thuộc v vào [S] đồ thị xác định tốc độ tối đa V ta tìm thấy giá trị [S], v = V/2, tức giá trị Km (hình 7.2) Khi tăng [S] v phản ứng tăng, tăng [S] đến giá trị v đạt đến giá trị vmax không tăng ta tiếp tục tăng [S] Khi Km = [S] v0 =1/2 Vmax Năm 1934 Lineweaver Burk, sở phương trình (5) nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, có ý nghĩa lớn việc nghiên cứu kìm hãm enzyme 117 Trong nhiều phản ứng enzyme xúc tác có hay nhiều chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng: ATP + glucose hexokinase ADP + glucose phosphate Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng chất sau: a/ Cơ chế tạo phức thành phần b/ Cơ chế không tạo phức thành phần Đây trường hợp chất thứ (S2) kết hợp vào enzyme ( trạng thái E’) sau P1 tạo thành 118 Vận tốc phản ứng trường hợp phân biệt qua số Michalis-Menten chất Qua nghiên cứu động học cho thấy: Phản ứng chất (bisubstrate) thường vận chuyển nguyên tử hay nhóm chức từ chất đến chất khác Khi cho S2 không đổi, đường biểu diễn tốc độ hai trường hợp 7.2.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm (inhibitior) Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme khơng cịn khả nâng xúc tác biến chất thành sản phẩm * Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition) 119 Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh chất chất kìm hãm tác dung lên trung tâm hoạt động enzyme, Chất kìm hãm chốn chổ chất enzyme Khi chất dư thùa, nồng độ chất kìm hãm thấp loại bỏ tác dụng chất kìm hãm, cịn nồng độ chất thấp nồng độ chất kìm hãm cao lại có tác dụng kìm hãm hồn tồn Người ta thấy kìm hãm phần lớn chất kìm hãm chất có tương đồng mặt hóa học ví dụ: malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatdehydrogenase, enzyme xúc tác cho biến đổi succinic acid thành fumaric acid 120 Trường hợp đặc biệt kìm hãm cạnh tranh kìm hãm sản phẩm Trường hợp xảy sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme choán vị trí hoạt động phân tử enzyme Đường thẳng có chất kìm hãm có độ xiên lớn cắt trục tung điểm 1/Vmax * Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition) Đặc trưng kiểu kìm hãm chất kìm hãm liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự * Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp (Mixed inhibition) 121 Trong đó, chất kìm hãm khơng liên kết với enzyme tự mà cịn liên kết với phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo sản phẩm P Hiện tượng kìm hãm phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm Tốc độ cực đại đo khơng có mặt chất kìm hãm cao có mặt chất kìm hãm Giá trị Km thay đổi khơng giống trường hợp cạnh tranh Tương tự ta có phương trình : Các giá trị α , α’ định nghĩa Trường hợp α = α’ gọi không cạnh tranh (noncompetitive) Bảng 7.1 Ảnh hưởng kiểu kìm hãm lên Vmax Km Cạnh tranh (Competitive) Phi cạnh tranh (Uncompetitive) Hỗn tạp (Mixed) 122 Khơng cạnh tranh (Noncompetitive) Trường hợp kìm hãm enzyme nồng độ cao chất gọi “kìm hãm chất” kìm hãm urease nồng độ ure cao, ngồi cịn có enzyme khác lactatdehydrogenase, carbonxypeptidase, lipase, pyrophotphatase, photphofructokinase (đối với ATP) Nguyên nhân tượng cịn chưa biết rõ Đó là: + Tồn nhiều trung tâm liên kết với chất lực khác Khi nồng độ chất thấp enzyme liên kết với phân tử chất, nồng độ chất cao liên kết với nhiều chất dẫn đến hình thành phức hợp ES khơng hoạt động + Cơ chất liên kết nhờ vị trí đặc biệt enzyme Đó nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác cịn có trung tâm điểu chỉnh + Cơ chất liên kết với chất hoạt hóa cách tách khỏi E + Cơ chất chốn chổ (ngăn cản) cofactor hay coenzyme + Cơ chất ảnh hưởng đến ion lực mơi trường qua làm tình chun hóa enzyme 7.2.4 Ảnh hưởng chất hoạt hóa (activator) Là chất làm tăng khả xúc tác chuyển hóa chất thành sản phẩm Thông thường cation kim loại hay hợp chát hữu vitamin tan nước Ví dụ: Mg++ hoạt hóa enzyme mà chất phosphoryl hóa pyrophosphatase (cơ chất pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất ATP) Các cation kim loại có tính đặc hiệu, tính đối kháng tác dụng tuỳ thuộc vào nồng độ Tính chất hoạt hóa cation kim loại: + Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho kiểu phản ứng định + Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối + Cation kim loại có đối kháng ion + Phụ thuộc nồng độ cation kim loại + Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích 123 Ảnh hưởng giá trị pH đến tác dụng enzyme sở sau: a/ Enzyme có thay đổi không thuận nghịch phạm vi pH cực hẹp b/ Ở hai sườn pH tối thích xảy phân ly nhóm prosthetic hay coenzyme c/ Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly chất d/ Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức định phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi lực liên kết enzyme với chất thay đổi hoạt tính cực đại Nhờ xác định Vmax Km phụ thuộc giá trị pH cho phép nhận định lại chất nhóm tham gia vào liên kết chất trình tự xúc tác 7.2.7 Các yếu tố khác + Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác đến loại enzyme, bước sóng khác có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu Ánh sáng vùng tử ngoại gây nên bất lợi, enzyme trạng thái dung dịch bền kết tinh dạng tinh thể, nồng độ enzyme dung dịch thấp bền, tác động tia tử ngoại tăng lên nhiệt độ Ví dụ: tác động tia tử ngoại nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng hoạt tính + Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ cao tác động phá hủy mạnh Tác động mạnh dịch enzyme có nồng độ thấp Có thể tạo thành gốc tự do, từ cơng vào phản ứng enzyme + Sóng siêu âm: Tác động khác loại enzyme, có enzyme bị hoạt tính, có enzyme lại khơng chịu ảnh hưởng * Nhận xét chung: Độ bền phụ thuộc vào trang thái tồn enzyme, tinh khiết enzyme bền, dịch lỗng độ bền kém, tác động số ion kim loại dịch với nồng độ khoảng 10-3M Ca++ làm tăng tính bền Enzyme allosteric (dị lập thể, dị không gian) 125 Cho đến nay, người ta mô tả enzyme mà hoạt tính enzyme phụ thuộc nồng độ chất khơng có dạng hyperbol mà có dạng sigmoid enzyme dị lập thể (hình 7.10) Đối với enzyme này, nồng độ chất thấp tốc độ phản ứng tăng chậm, sau tiếp tục tăng nồng độ tốc độ nhanh chóng đạt giá trị cực đại Như ta biết, enzyme tuân theo động học Michalis-Menten hay nhiều chất liên kết vào vị trí phân tử enzyme, điều dẫn đến enzyme bão hòa chất Còn enzyme có đường cong tốc độ sigmoid xuất enzyme oligomer, nên liên kết với nhiều phân tử chất Điều có nghĩa enzyme dị lập thể có nhiều trung tâm liên kết, monomer có trung tâm liên kết Hình 7.10 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất Người ta cho rằng, trường hợp có tính hợp tác vị trí liên kết chất phân tử enzyme oligomer Các enzyme oligomer Monod gọi enzyme dị lập thể (allosteric) Đường cong tốc độ sigmoid bị chất điều hịa (modulator) đẩy phía trái hay phải Chất điều hòa dương tức làm tăng lực enzyme allosteric với chất, ngược lại chất điều hòa âm Các chất điều hịa làm ảnh hưởng khác đến thông số động học, làm thay đổi giá trị riêng lẻ hai giá trị Km hay Vmax Hình 7.11 Minh họa có modulator 126 7.3 Enzym cố định 7.3.1 Giới thiệu chung Enzyme khơng hồ tan hay cịn gọi enzyme cố định (immobilized enzyme) thường enzyme hoà tan gắn vào chất mang nhiều kỹ thuật khác Nhờ trình gắn mà enzyme từ trạng thái hồ tan chuyển sang khơng hồ tan Khi chuyển từ trạng thái hồ tan sang trạng thái khơng hồ tan, enzyme khơng hồ tan có ưu điểm sau: Enzyme khơng hồ tan sử dụng nhiều lần, hoạt tính enzyme khơng hồ tan thay đổi lần tái sử dụng Nhờ ta tái sử dụng nhiều lần làm giảmchi phí cho việc sản xuất enzyme Đây ưu điểm lớn vệc thu nhận ứng dụng enzyme khơng hồ tan Enzyme khơng hồ tan không lẫn vào sản phẩm cuối phản ứng, khơng phí cho việc tách enzyme khỏi sản phẩm Sản phẩm cuối thu coi sản phẩm tương đối Dùng enzyme cố định dừng nhanh chóng phản ứng cần thiết cách tách khỏi chất ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZYM KHÔNG TAN Khi gắn enzyme hoà tan vào số chất mang, enzyme có đặc điểm khác hẳn enzyme hồ tan 1- Hoạt tính enzyme khơng hồ tan thường nhỏ hoạt tính riêng enzyme hồ tan loại Sở dĩ có thay đổi hoạt tính riêng enzyme khơng hồ tan ngun nhân sau: - Do ảnh hưởng điện tích chất mang Khi gắn enzyme vào chất mang có điện tích khác với điện tích enzyme, cấu trúc khơng gian enzyme có thay đổi mức độ định Vì thay đổi cấu trúc khơng gian enzyme nên tương tác enzyme chất chậm lại, phản ứng xảy yếu Mức độ giãm hoạt tính enzyme phụ thuộc vào mức độ thay đổi cấu trúc không gian enzyme ta gắn chúng vào chất mang - Do enzyme bị nhốt vào gel Khi ta nhốt enzyme vào gel đó, gel bao lấy phân tử enzyme tạo thành vật cản chất enzyme Do đó, tiếp xúc trung tâm hoạt động enzyme với chất gặp nhiều khó khăn so với tiếp xúc chất enzyme tự 2- Enzyme khơng hồ tan hồn tồn tuân theo định luật Michaelis-Menten Tuy nhiên, phản ứng chất với enzyme khơng hồ tan có sai khác định: - Có thể xảy tượng cạnh tranh chất với enzyme chất mang 127 - Hiện tượng cản trở khuếch tán chất sản phẩm phản ứng làm giảm tốc độ phản ứng 3- Enzyme khơng hồ tan có tính bền nhiệt enzyme hồ tan loại chúng bảo vệ chất mang 4- Enzyme không hồ tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm acid so với pH tối ưu enzyme hồ tan khơng trùng với pH tối ưu enzyme hồ tan loại 5- Enzyme khơng hồ tan có khả bảo quản tốt enzyme hồ tan loại 6- Có thể tái sử dụng enzyme khơng hồ tan nhiều lần, enzyme hồ tan sử dụng lần Đặc điểm có ý nghĩa mặt kinh tế ta tiến hành phản ưng theo quy mô công nghiệp Chất mang dùng để cố định enzym a) Những yêu cầu chất mang lý tưởng Một chất mang lý tưởng cần có tính chất sau: - Chất mang phải rẻ tiền - Phải có tính chất lý bền vững, ổn định - Phải bền vững, không tan môi trường phản ứng, không làm hoạt tính enzyme, khơng gây phản ứng hấp phụ khơng đặc hiệu - Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao - Phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn - Chất mang có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, dạng hạt, dạng màng… b) Phân loại chất mang Chất mang dùng cố định enzyme chia làm hai nhóm: chất mang polymer hữu chất mang vô Chất mang polymer hữu gồm hai nhóm: polymer tổng hợp polymer tự nhiên 7.3.2 Các phương pháp cố định enzym Theo kỹ thuật chế tạo enzyme cố định, enzyme gắn vào vật mang 128 Những vật mang cellulose dẫn xuất nó, hạt kính xốp, gel polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh bột, loại allumosilicate oxide kim loại Về nguyên tắc, có phương pháp điều chế enzyme cố định: - Gắn liên kết đồng hóa trị phân tử enzyme vào chất mang khơng hịa tan gắn enzyme với để tạo nên đại phân tử khơng hịa tan (hình 16); Hình 16 Sơ đồ điều chế enzyme định cách đính mạch ngang nhờ tác nhân lưỡng chức đa chức - Đính enzyme lên bề mặt chất mang vào lịng khn gel có kích thước lỗ nhỏ đủ để giữ enzyme, để chất khác qua lại tự (Hình 17); Hình 17 Hấp phụ enzyme bề mặt chất mang (a) lòng chất mang (b) - Hấp phụ enzyme lên chất mang khơng hịa tan có mang khơng mang điện tích (Hình 18) 129 Hình 18 Sơ đồ hấp phụ enzyme chất mang khơng có có điện tích a/ Phương pháp gắn enzyme liên kết đồng hoá trị Đa số enzyme cố định thu phương pháp Với phương pháp thu enzyme cố định hai cách • Kết hợp phân tử protein enzyme vào chất mang khơng hịa tan Các chất mang để gắn enzyme phải thỏa mãn yêu cầu sau: - Có độ hịa tan thấp bền vững tác động học hóa học; - Khơng gây tác động kìm hãm đến hoạt tính enzyme; - Khơng hấp phụ phi chọn lọc protein khác; - Chất mang tốt có tính háo nước, chất mang kỵ nước gây tác dụng ức chế enzyme liên kết; - Việc gắn enzyme có hiệu điện tích enzyme chất mang có dấu ngược Các chất mang loại thường polypeptide, dẫn xuất cellulose dextran (DEAE-cellulose, CM-cellulose, DEAE- sephadex, CM, sephadex), agarose polimer tổng hợp khác polyacrilamide, polystyrol, polyamide chất vô silicagen, bentonit, hydroxide nhôm v.v Chất mang phổ biến dextran có liên kết ngang (Sephadex) agarose hạt (sepharose) Các hai loại chất có cấu trúc lỗ xốp khiến cho phân tử lớn xâm nhập vào gel cách dễ dàng Poliacrylamide chất mang tiện lợi vi có độ bền vững học hóa học cao Chất mang vô thường bền với nhiệt, học, với dung môi hữu với vi sinh vật, khơng bị biến đổi cấu hình khn thay đổi tính chất mơi trường xung quanh Nhiều dẫn liệu cho thấy enzyme đính với khuôn vô bảo quản thường bền vững enzyme gắn với khuôn polymer hữu Tham gia tạo thành liên kết đồng hóa trị có nhóm chức phân 130 tử protein enzyme nhóm β- γ-carboxyl –COOH acid asparaginic acid glutamic, nhóm ε-NH2 lysine, nhóm β-SH cysteine, vịng phenol tyrosine, nhân imidasol histidine, nhóm OH serine, threonine, nhóm guanidine arginine imidasol tryptophan Quá trình kết hợp enzyme xảy cách trực tiếp chất mang có chứa nhóm chức có khả liên kết trực tiếp nói phân tử protein enzyme Ví dụ gốc anhydride maleic liên kết với nhóm ε-NH2 lysine Trong trường hợp khác liên kết chất mang protein enzyme xảy sau chất mang hoạt hóa Việc hoạt hóa sơ chất mang thực nhiều cách Ví dụ,các nhóm hydroxyl dextran polyoside khác hoạt hóa bromur cyan (BrCN).Sau chất mang hoạt hóa liên kết với enzyme (hình 19) Hình 19 Gắn enzyme với vật mang hoạt hóa bromur cyan (BrCN) Các chất mang có chứa nhóm amin aminobenzoylcellulose, polyaminostyrol hoạt hóa phản ứng diazo Ví dụ, polyaminostyrol trước hết diazo hóa natri nitrit mơi trường acid thành muối diazo, sau kết hợp với enzyme: Enzyme liên kết với chất mang Enzyme liên kết với chất mang chưa hoạt hóa Đã hoạt hóa 131 Phản ứng kết hợp enzyme tiến hành nhanh chóng điều kiện nhiệt độ thường dung dịch nước trung tính Nếu chất mang có chứa nhóm amin hoạt hóa cách cho tác dụng với phosgen tiophosgen để tạo thành dẫn xuất isosianat izothyosianat Các nhóm isosianat izothyosianat pH trung tính liên kết dễ dàng với nhóm ε-NH2 lysine Bằng phương pháp người ta điều chế dẫn xuất enzyme cố định trypsin, chimotrypsin, α-, β-amylase, glucoamylase Nếu chất mang có chứa nhóm –COOH CM-cellulose nhựa tổng hợp cần hoạt hóa trước gắn kết với enzyme phương pháp azit, carbodiimit -Hoạt hóa phương pháp azit: Azit Enzyme cố định Các enzyme trypsin, DNA-ase, chimotrypsin, bromelin cố định phương pháp -Hoạt hóa phương pháp carbodiimit: 132 Vì phản ứng xảy môi trường acid yếu (pH=5) nên phương pháp đặc biệt thuận lợi enzyme có tính acid pepsin •Kết hợp đồng hóa trị phân tử enzyme với chất mang Cố định enzyme cách liên kết đồng hóa trị thực nhiều cách khác nhau: 1/ Liên kết đồng hóa trị tạo nhóm phản ứng vật mang enzyme; số trường hợp vật mang cần hoạt hóa sơ bộ; 2/ Các phân tử enzyme sau hấp phụ chất mang nằm lòng phân tử chất mang liên kết với nhờ tính lưỡng chức tính đa chức chất phản ứng Người ta thường dùng aldehyde glutaric để gắn nhóm amin lysine phân tử enzyme Ví dụ, trypsin cố định trypsin điều chế cách dùng aldehyde glutaric 2% để liên kết phân tử enzyme gắn chúng vào aminoethylcellulose b/ Phương pháp “gói” enzyme khn gel Để gói enzyme vào khn gel người ta tiến hành trùng hợp hóa học gel có mặt đồng thời enzyme Sau hồn thành q trình trùng hợp enzyme bị giữ gel Gel có enzyme nghiền nhỏ cách ép qua rây có lỗ nhỏ sấy khô nhiệt độ thấp Dẫn xuất enzyme loại lần Bernfeld (1933) thu cách trùng hợp acrylamide với N,N’-methylenbisacrylamide Phương pháp thường dùng chất trùng hợp thu dễ tạo thành dạng hạt tùy thuộc điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác Sau số phương pháp “gói” enzyme • Các gel hình thành từ polymer tổng hợp acrylamide, hydroxyethyl2-metacrylate, tạo phức cua ethyleneglycol-dimetacrylate, polyvinyl, polyuretan Enzyme hòa tan phân tán dung dịch monomer sau trùng hợp có mặt hay nhiều tác nhân tạo phức cua Gel cắt thành màng đặt giá thể rắn, nghiền thành bột sau loại trừ nước Alginate caraghenan lấy từ rong biển thường có khả tạo gel tốt thuận lợi 133 để bao gói enzyme tế bào ngun vẹn • Các enzyme bị “nhốt” lỗ nhỏ sợi tổng hợp Với cách người ta cho dịch lỏng chảy bên sợi, hạn chế phân cực bề mặt bịt lấp thường gặp với màng Một nhũ tương cellulose triacetate methylene chlorua enzyme dung dịch đệm có chứa glycerol ép qua khuôn lọc áp suất nitơ Các sợi khỏi khuôn nhúng vào bể đơng tụ có chứa toluel, sau làm khô chân không Các sợi bền với acid yếu kiềm yếu, lực ion cao chịu số dung môi hữu Tuy nhiên phương pháp thích hợp enzyme khó bị hoạt tính dung mơi khơng hịa lẫn với nước • Phương pháp gói enzyme bao vi thể (microcapsul) Enzyme gói bao vi thể có màng bán thấm tạo từ polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản khuếch tán enzyme đủ lớn để chất vào sản phẩm phản ứng dễ dàng Có nhiều phương pháp gói enzyme microcapsul Sau phương pháp Cho dung dịch lỗng chứa enzyme monomer ưa nước dung môi hữu khơng hịa lẫn nước để tạo nhũ tương, sau thêm monomer kỵ nước để gây phản ứng trùng hợp tạo màng bao quanh giọt lỏng nhỏ Thường phải thêm vào tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương để điều chỉnh capsul có kích thước mong mun t n 100 àm ãPhng phỏp tin polymer để gói chất xúc tác sinh học Cố định enzyme phương pháp có ưu điểm sau: - Q trình gói đơn giản điều kiện nhẹ nhàng; - Các chất tiền trùng hợp khơng chứa monomer vốn gây ảnh hưởng xấu đến enzyme gói; - Cấu trúc lưới gel điều chỉnh cách dùng tiền polymer có chiều dài chuỗi bất kỳ; - Các tính chất hóa lý gel (như cân tính háo nườc tính kỵ nước, chất ion) định hướng trước cách chọn tiền polymer thích hợp vốn tổng hợp hóa học điều kiện vắng mặt enzyme Dưới ví dụ phương pháp tiền polymer Đó phương pháp tạo liên kết chéo tiền polymer cách chiếu tia cực tím để gói enzyme 134 Khi chiếu tia cực tím gần lên dung dịch có chứa chất tiền polymer enzyme tạo liên kết chéo gốc tiền polymer gel hình thành bao lấy enzyme Sự gói enzyme phương pháp tiến hành điều kiện nhẹ nhàng, tránh thay đổi pH kiềm acid, thời gian lại nhanh, vòng từ 3-5 phút Với phương pháp gói enzyme, tế bào vi sinh vật bào quan c/ Cố định enzyme phương pháp hấp phụ chất mang có khơng có điện tích Với phương pháp enzyme hấp phụ chất có hoạt tính bề mặt than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin, polyacrylamide, nilon, polystyrol v.v số nhựa trao đổi ion, silicagen, thủy tinh Trong trường hợp chất mang khơng có lỗ enzyme đính vào chất mang thành lớp bề mặt; chất mang có lỗ phân tử enzyme xâm nhập vào lỗ Một số đặc tính enzyme cố định Việc cố định làm thay đổi đáng kể nhiều tính chất enzyme độ bền, tính đặc hiệu, đặc điểm động học Thông thường việc cố định làm tăng đáng kể độ bền enzyme Ví dụ, cố định protease làm tăng độ bền với nhiệt gấp chục nghìn lần Sau cố định khơng độ bền với nhiệt enzyme tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích enzyme mở rộng Nhiệt độ cao làm cho enzyme bị biến tính, cấu trúc bậc ba enzyme bị phá vỡ enzyme bị hoạt tính Khi enzyme cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang trình biến tính bị ngăn cản, làm cho enzyme chịu nhiệt độ cao Trong trương hợp enzyme thủy phân protein, ví dụ papain trypsin cố định làm ngăn cản phần hoàn toàn tương tự phân Điều có ý nghĩa thực tế giúp làm tăng thời gian làm việc enzyme Sự biến đổi đặc điểm động học enzyme việc cố định gây minh họa qua ví dụ enzyme glutamate dehydrogenase: enzyme cố định màng collagen số Michaelis dành cho acid glutamic tăng lần, tác dụng hoạt hóa ADP tăng lên đáng kể Một nguyên nhân làm biến đổi tính chất enzyme chúng cố định thay đổi phản ứng môi trường Enzyme thường cố định chất mang có điện tích Ví dụ chất trao đổi anion mang điện tích âm bao quanh mơi trường giàu proton, pH lớp nằm kế sát với enzyme cố định thấp so với pH mơi trường dung dịch Điều làm cho đường cong phụ thuộc pH 135 hoạt tính enzyme cố định chất mang anionit, cationit trung tính khác 136 Ứng dụng enzyme cố định / Trong công nghiệp - Từ năm 1969 Wilson xây dựng thành công xưỡng thực nghiệm để sản xuất liên tục glucose glucoamylase cố định; - Từ 1971 người ta thành công việc dùng chimotrypsin cố định carboxymethylcellulose để làm động tụ sữa thay cho renin đắt tiền; - Enzyme rasemase cố định sử dụng để chuyển toàn D- aminoacid thành Laminoacid tương ứng, làm tăng giá trị dinh dưỡng sản phẩm lên gấp đôi - Làm nước trái cách xử lý enzyme phân giải pectin hay thủy phân protein bia protease hồn tồn thực cột chứa enzyme cố định tương ứng - Cố định enzyme glucoisomerase cột hồn tồn có hiệu việc ngăn ngừa chuyển hóa glucose thành fructose, làm cho độ nước giải khát bị giảm Nhờ cố định enzyme glucoisomerase việc thu nhận xirô gluco-fructose ngày trở thành quy trình cơng nghiệp quan trọng phổ biến Độ chịu nhiệt cao enzyme cho phép thực trình sản xuất nhiệt độ 60-70o, làm giảm đáng kể khả nhiễm khuẩn thiết bị enzyme Trong y học - Urease gắn vi tiểu cầu sử dụng có hiệu để loại trừ urea máu thận nhân tạo; Vi tiểu cầu chứa catalase thay cách có hiệu số catalase bị thiếu Đưa vi tiểu cầu có gắn enzyme L-asparaginase vào thể có khả ức chế phát triển số u ác tính phát triển u phụ thuộc vào có mặt L-asparagin Trong phân tích hóa sinh Glucoamylase gắn đồng hóa trị với polystyrol dùng để xác định tự động glucose; Điện cực urease cố định dùng để xác định tự động urea dòng liên tục; 137 Điện cực alcoholoxydoreductase cố định dùng để xác định methanol, ethanol dung dịch nước Cố định enzyme tạo khả nghiên cứu hàng loạt vấn đề lý thuyết enzyme học Vi dụ cố định enzyme sử dụng để ngăn cản phối hợp ngẫu nhiên phần đơn vị enzyme oligomer Sử dụng việc cố định giải vấn đề liệu enzyme dạng phần đơn vị có hoạt tính hay khơng Nếu phần đơn vị trạng thái cố định có hoạt tính qua so sánh hoạt tính enzyme với hoạt tính oligomer cố định thu thơng tin có gía trị vai trị tương tác phần đơn vị việc thực chức enzyme Ngày ta biết rõ phần lớn enzyme nội bào hoạt động môi trường tương tự gel chúng “gói” màng ti thể, lục lạp quan tử khác Vì vậy, enzyme cố định mơ hình tốt để nghiên cứu hoạt động enzyme Kỹ thuật cố định không dùng cho chế phẩm enzyme mà dùng cho tế bào vi sinh vật nguyên vẹn Để cố định tế bào vi sinh vật 138 Filename: Chương 7.doc Directory: D:\DH CNTP\Mon Giang day\Mon Kỹ thuật thực phẩm 3\Soan\Mon KTTP 3\Giao ttrinh in nop Template: C:\Documents and Settings\welcome\Application Data\Microsoft\Templates\Normal.dot Title: Chương 7: Kỹ thuật hóa sinh sử dụng chế phẩm enzyme Subject: Author: User Keywords: Comments: Creation Date: 9/5/2010 11:27:00 PM Change Number: 13 Last Saved On: 3/13/2011 3:07:00 PM Last Saved By: User Total Editing Time: 1,406 Minutes Last Printed On: 10/16/2011 10:55:00 PM As of Last Complete Printing Number of Pages: 25 Number of Words: 5,336 (approx.) Number of Characters: 30,420 (approx.)