NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH Trần Thị Thảo Nguyên NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh-2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH Trần Thị Thảo Nguyên NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ CHIẾN PHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh-2014 LỜI CẢM ƠN Có thành ngày hơm nay, xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: • Cán hướng dẫn: TS Lê Chiến Phương tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn kinh nghiệm quý báu suốt q trình thực luận văn • Ban giám hiệu trường ĐHSP TP.HCM, quý thầy cô môn vi sinh vật giảng dạy, hướng dẫn để tơi có kiến thức ngày hơm • Các anh chị em phịng thí nghiệm Biến đổi sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn • Các bạn học viên cao học niên khóa 2012-2014 ngành Vi sinh vật giúp đỡ, động viên, đóng góp ý kiến cho tơi thời gian thực luận văn • Cuối xin cám ơn ba mẹ người thân u động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Một lần xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, tháng 09, năm 2014 Trần Thị Thảo Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tác giả luận văn Trần Thị Thảo Nguyên MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục sơ đồ Danh mục đồ thị MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Thực phẩm chức 1.2 Nguyên liệu sử dụng đề tài 1.2.1 Bã đậu nành (Okara) 1.2.2 Cám gạo 1.2.3 Chất xơ vai trò chất xơ bã đậu nành cám gạo 1.2.4 Những nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành cám gạo 1.3 Các chủng vi sinh vật sử dụng đề tài 11 1.3.1 Nấm Linh chi 11 1.3.2 Bacillus amyloliquefaciens Bacillus natto 16 1.4 Sấy chân không 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Hóa chất 23 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 25 2.1.3 Các môi trường nghiên cứu sử dụng 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 26 2.2.2 Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm 38 2.2.3 Phân tích tiêu dinh dưỡng sản phẩm 41 2.2.4 Phương pháp định tính số HCSH nấm sợi Linh chi 51 2.2.5 Phương pháp định lượng Ba tổng số bào tử Ba sản phẩm 52 2.2.6 Phương pháp kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm 53 2.2.7 Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm 54 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 56 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57 3.1 Kết nghiên cứu vi sinh vật 57 3.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa nấm sợi Linh chi 57 3.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Ba, Bn 58 3.1.3 Kết xác định hoạt tính hệ enzyme vi sinh vật sử dụng đề tài theo thời gian 62 3.2 Kết chế biến sản phẩm 66 3.2.1 Kết thủy phân xơ hỗn hợp bã đậu nành cám enzyme tơ nấm Linh chi 66 3.2.2 Kết khảo sát khả thủy phân protein, tinh bột chất bã đậu nành cám gạo enzyme Ba 67 3.2.3 Kết phân tích tiêu dinh dưỡng sản phẩm 71 3.2.4 Kết định tính số HCSH nấm sợi Linh chi sản phẩm 72 3.2.5 Kết định lượng Ba tổng số bào tử Ba sản phẩm 74 3.2.6 Hoạt tính enzyme có 1g sản phẩm 75 3.2.7 Kết kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm 75 3.2.8 Kết đánh giá cảm quan sản phẩm 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ba Bacillus amyloliquefaciens Bn Bacillus natto CMC Carboxymethyl cellulose CMCase Enzyme carboxymethyl cellulase CP Môi trường cá peptone CFU/ml (g) Số đơn vị khuẩn lạc 1ml 1g mẫu DNS Acid 2-hydroxy-3,5 dinitrobenzoic HCSH Hoạt chất sinh học MPN Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn NL Nguyên liệu NNH3 Đạm ammoniac Nformol Nitơ formol NtsOD Nitơ tổng số SP Mật độ quang học Sản phẩm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần bã đậu nành (100g)……………………………………6 Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng cám gạo…………………………… Bảng 1.3 Điều kiện cần thiết cho phát triển nấm Linh chi………… 13 Bảng 1.4 Thành phần hoạt chất hoạt tính dược lý nấm Linh chi……………………………………………………………… 14 Bảng 2.1 Đường glucose chuẩn…………………………………………… 33 Bảng 2.2 Đường chuẩn tyrosine…………………………………………….36 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase………………… 38 Bảng 2.4 Chỉ tiêu giới hạn vi sinh ngũ cốc sản phẩm chế biến từ ngũ cốc………………………………………………………… 54 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Ba Bn……………………………59 Bảng 3.2 Kết mật độ tế bào theo thời gian…………………………… 60 Bảng 3.3 Sự biến thiên hoạt tính CMCase nấm sợi Linh chi theo thời gian………………………………………………………………62 Bảng 3.4 Sự biến thiên hoạt tính protease Ba, Bn theo thời gian………63 Bảng 3.5 Sự biến thiên hoạt tính amylase Ba, Bn theo thời gian………65 Bảng 3.6 Kết khảo sát khả thủy phân xơ…………………………67 Bảng 3.7 Kết khảo sát khả thủy phân protein……………………68 Bảng 3.8 Kết khảo sát khả thủy phân tinh bột……………………69 Bảng 3.9 Kết phân tích tiêu dinh dưỡng sản phẩm…………………71 Bảng 3.10 Kết định lượng Ba tổng số bào tử Ba sản phẩm… 74 Bảng 3.11 Hoạt tính enzyme có 1g sản phẩm……………………… 75 Bảng 3.12 Kết kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm……………….75 Bảng 3.13 Kết khảo sát…………………………………………………76 Bảng 3.14 Các tham số đặc trưng………………………………………… 76 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Bã đậu nành dạng bột……………………………………… …… Hình 1.2 Cám gạo…………………………………………………………….6 Hình 1.3 Lớp cám hạt lúa…………………………….……………… Hình 1.4 Cellulose……………………………………………………………8 Hình 1.5 Hemicellulose………………………………………………………9 Hình 1.6 Pectin……………………………………………………………….9 Hình 1.7 Sự thủy phân polysaccharide…………………………………11 Hình 1.8 Nấm Linh chi…………………………………………………… 11 Hình 1.9 Chu trình sống Linh chi………………………………………12 Hình 1.10 Hình thái Ba …………………………………………………… 17 Hình 1.11 Hình thái Bn …………………………………………………… 17 Hình 1.12.Cấu trúc bề mặt Bacillus………….………………………… 18 Hình 3.1 Hệ sợi nấm Linh chi môi trường thạch………………………57 Hình 3.2 Hình thái sợi nấm Linh chi tiêu phịng ẩm (100x)………57 Hình 3.3 Khả thủy phân cellulose…………………………………….57 Hình 3.4 Khuẩn lạc Ba (trái),Bn (phải)…………………………………….58 Hình 3.5 Tế bào Ba (trái),Bn (phải)……………………………… .58 Hình 3.6 Khả thủy phân casein Ba (trái), Bn (phải)………….61 Hình 3.7 Khả thủy phân fibrin Ba (trái), Bn (phải)………… 62 Hình 3.8 Khả thủy phân tinh bột Ba (trái), Bn (phải)……… 62 Hình 3.9 Bịch chất sau ngày nuôi tơ nấm Linh chi……………………66 Hình 3.10 Mặt cắt đơi khối chất sau ngày nuôi tơ nấm Linh chi …… 66 Hình 3.11 Định tính saponin……………………………………………… 73 Hình 3.12 Định tính steroid…………………………………………………73 Hình 3.13 Định tính alkaloid……………………………………………… 73 Hình 3.14 Định tính triterpenoid……………………………………………74 Hình 3.15 Sản phẩm dạng bột………………………………………………75 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1.Quy trình thu nhận bã đậu nành từ cơng nghệ sản xuất sữa………5 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm……………………………………………36 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng Ba, Bn môi trường sữa đậu nành 60 Đồ thị 3.2 Sự biến thiên hoạt tính CMCase nấm sợi Linh chi theo thời gian 63 Đồ thị 3.3 Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease Ba, Bn theo thời gian 64 Đồ thị 3.4 Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase Ba, Bn theo thời gian 65 Đồ thị 3.5 Hàm lượng Nformol theo thời gian tỉ lệ giống Ba sử dụng 68 Đồ thị 3.6 Hàm lượng tinh bột theo thời gian tỉ lệ giống Ba sử dụng 70 Đồ thị 3.7 Kết phân phối tần suất 76 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Bã đậunành (okara)và cám gạo hai nguồn phụ phế phẩm dồi ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành xay xát gạo nước ta Trong hai loại phụphế phẩm chứa nhiều thành phần dinh dưỡng,theo Vander cộng sự[32], hàm lượng protein bã đậu nành chiếm 25,4-25,8%, xơ thô chiếm 52,8-58,1% lượng lớn lipid carbonhydrate Cám gạo chiếm 65% chất dinh dưỡng gạo 28% carbohydrate,13,3% protein, chất xơ chiếm 21%, lipid 21% nhiều loại vitamin nhóm B, E [36] Do hàm lượng xơ cao thành phần protein, tinh bột bã đậu nành cám gạo thành phần khơng tan, khó tiêu hóa đặc biệt cám gạo chứa lượng lớn lipid dễ bị oxi hóa gây khó khăn việc chế biến bảo quản vậy, chúng chưa tận dụng hiệu mà chủ yếu dùng làm thức ăn cho ngành chăn nuôi Với khả hoạt động mạnh enzyme cellulase từ hệ sợi nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thủy phân cellulose bã đậu nành cám gạo, enzyme amylase protease từ Bacillus amyloliquefaciens (Ba)có thể thủy phân tinh bột protein có nguyên liệu, biến chất khơng tan, khó tiêu hóa thành chất dễ hấp thu, đồng thời chứa enzyme hỗ trợ tiêu hóa (cellulase, amylase, protease), dược chất từhệ sợi nấm Linh chi sinh khối Linh chi vi khuẩn Ba, biến nguồn nguyên liệu rẻ tiền thành sản phẩm dùng làm thực phẩm chức góp phần bảo vệ sức khỏe người, Do đó, việc thực đề tài “Nghiên cứu chế biến thực phẩm chức từ bã đậu nành (okara) cám gạo công nghệ vi sinh” điều cần thiết có ý nghĩa thực tiễn Mục tiêu Tạo thực phẩm dạng bột dùng sử dụng làm thực phẩm chức chứa enzyme hỗ trợ tiêu hóa: amylase, protease, sinh khối Ba; đặc biệt cellulase hoạt chất sinh học (HCSH) có dược tính từ sinh khối tơ nấm Linh chi từ bã đậu nành cám gạo công nghệ vi sinh Nhiệm vụ - Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi sinh khối vi khuẩn Ba, Bacillus natto (Bn) mơi trường dịch thể khảo sát hoạt tính enzyme cellulase nấm sợi Linh Chi, amylase protease Ba, Bn - Khảo sát khả thủy phân cellulose bã đậu nành cám gạo thông qua việc nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi hai nguyên liệu nói - Khảo sát khả thủy phân tinh bột protein bã đậu nành cám việc nuôi vi khuẩn Ba, Bn hai nguyên liệu - Tạo sản phẩm dạng bột - Định tính HCSH sinh khối tơ nấm Linh chi sản phẩm - Định lượng chất sản phẩm: cellulose, protein (NTS, NNH3, NNH2), đường tổng, đường khử - Định lượng vi sinh vật - Xác định hoạt tính enzyme cellulase, amylase, protease - Đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm - Đánh giá cảm quan sản phẩm Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm Linh chi, Ba, Bndo phịng thí nghiệm Cơng nghệ biến đổi Sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp Bã đậu nành mua công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk Cám gạo mua loại cám mịn lấy sau xay, nhà máy xay lúa Bảy Đạm, Long An Ý nghĩa đề tài Tận dụng phụ phế phẩm công nghiệp để chế biến loại sản phẩm có giá trị gia tăng cao, làm thực phẩm chức góp phần bảo vệ sức khỏe người Thời gian, địa điểm thực đề tài Dự kiến thời gian: từ11/2013 đến tháng 08/2014 Địa điểm thực đề tài: phịng thí nghiệm Cơng nghệ biến đổi Sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM 4 Chương TỔNG QUAN 1.1 Thực phẩm chức Một số khái niệm thực phẩm chức năng[35]: Cho đến chưa có tổ chức quốc tế đưa định nghĩa đầy đủ thực phẩm chức năng, có nhiều Hội nghị quốc tế khu vực thực phẩm chức Gần định nghĩa thực phẩm chức đưa nhiều có xu hướng gần thống với - Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (International Food Information Council), định nghĩa: “Thực phẩm chức thực phẩm mang đến lợi ích cho sức khỏe vượt xa dinh dưỡng bản” - Hiệp Hội nghiên cứu thực phẩm Leatherhead (châu Âu): “Thực phẩm chức thực phẩm chế biến từ thức ăn thiên nhiên, sử dụng phần chế độ ăn hàng ngày có khả cho tác dụng sinh lý sử dụng” - Bộ Y tế Việt Nam: Thông thư số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 việc “Hướng dẫn việc quản lý sản phẩm thực phẩm chức năng” đưa định nghĩa: “Thực phẩm chức thực phẩm dùng để hỗ trợ chức phận thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng giảm bớt nguy gây bệnh” Khái quát lại đưa định nghĩa sau: “Thực phẩm chức (TPCN) thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, trì tăng cường) chức phận thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng giảm bớt nguy bệnh tật” 1.2 Nguyên liệu sử dụng đề tài 1.2.1 Bã đậu nành (Okara) 1.2.1.1 Giới thiệu bã đậu nành Bã đậu nành hay gọi okara soy-pulp (okara trở thành thuật ngữ quốc tếđể gọi bã đậu nành) phần bãvà chất dinh dưỡng khác không tan nước lại sau tách khỏi dịch chất tan huyền phù nước, công nghiệp sản Hình 1.1 Bã đậu nành dạng bột xuất sữa đậu nành hay đậu hũ [9] Bã đậu nành có màu trắng hay trắng ngà, thường nằm mặt lưới lọc sữa đậu nành, sau sấy khơ có màu vàng, chứa lượng lớn protein (chiếm khoảng 50% protein tinh chất), carbohydrate, lipid, có calci, sắt, riboflavin [9] Quy trình thu nhận bã đậu nành từ cơng nghệ sản xuất sữa đậu nành Hạt đậu nành Ngâm nước nóng đối lưu (5 phút, 85-900C) Thải bỏ nước Bóc vỏ Nghiền Trích ly Dịch sữa Bã Sấy 15 phút, 150-1700C Sấy rung Bã đậu nành Sơ đồ 1.1 Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa 1.2.1.2 Thành phầnbã đậu nành Ở Việt nam, theo thông tin công ty sữa Vinamilk cung cấp cho Viện Sinh học Nhiệt đới, nơi có cơng nghệ sản xuất sữa đậu nành tận thu bã đậu nành đại nước ngồi bã đậu nành có thành phần sau[19]: Bã đậu nành dạng bột có hàm ẩm: 6,7%; đạm: 36,43%; xơ: 1,99% chất béo: 10,59% Tại cơng ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa lần thu khoảng 50% protein hạt đậu nành Từ 1kg đậu nành thu 1,5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm), chứa khoảng 20% chất khô Bã ướt dạng phế liệu cuối công nghệ sản xuất sữa đậu nành sử dụng cho chăn ni[11] Theo số nghiên cứu ngồi nước thành phần bã đậu nành sau [32],[33]: Bảng 1.1 Thành phầnbã đậu nành(100g) %Protein %Lipid %Carbohydrate %Xơ thô %Tinh bột 19,91 25,4-28,4 8,37 9,3-10,9 9,53 3,8-5,3 2,82 52,8-58,1 1.2.2 Cám gạo 1.2.2.1 Giới thiệu cám gạo Hình 1.2 Cám gạoHình 1.3 Lớp cám hạt lúa[36] Trong qui trình xay xát chế biến gạo, sau thu sản phẩm gạo cịn sản phẩm phụ chiếm khoảng 65% chất dinh dưỡng gạo, có giá trị sử dụng cao giá thành lại thấp cám gạo Cám gạo hỗn hợp lớp vỏ hạt gạo lớp aleurone thường có dạng bột, mềm mịn Hàng năm giới có khoảng 40–45 triệu cám gạo sản suất, 90% nằm châu Á[36], [37] 1.2.2.2 Thành phần dinh dưỡng cám gạo Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng cám gạo[38] Thành phần Calori Tổng số lipid Chất béo bão hịa Chất xơ tiêu hóa Carbohydrate Đường Protein Vitamin E Vitamin B6 Calci Khối lượng/100g 316KJ 21g 4g 21g 28g 0,9g 13,3g 4,9mg 4,1mg 57mg 1.2.3 Chất xơ vai trò chất xơ bã đậu nành cám gạo Chất xơ gồm phần lại tế bào thực vật, polysaccharide, lignin chất liên quan chịu thủy phân enzyme hệ tiêu hóa người Tùy theo độ phân tán nước mà chất xơ chia thành hai loại tan không tan Tất thức ăn có nguồn gốc từ thực vật có hai loại chất xơ Trong bã đậu nành hàm lượng xơ khơng tan chiếm đa số, xơ tan chiếm với hàm lượng thấp Chất xơ cám gạo từ lớp aleurone, lớp vỏ bên ngồi cám gạo từ chất bẩn vỏ gạo (cellulose, lignin silica)[41] Xơ khơng tan:chủ yếu cellulose, ngồi cịn có hemicellulose, lignin, cutin…Chất xơ khơng hịa tan có đặc tính thẩm thấu nước ruột,trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ ngồi • Cellulose: polysaccharide chủ yếu thành tế bào thực vật, cấu tạo β-D glucose-pyranose, thành phần liên kết với liên kết glucose Cellulose không tan nước (cả nước nóng nước lạnh), tan acid kiềm Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose chuyển thành glucose thủy phân điều kiện nhẹ nhàng tạo nên disaccharide cellobiose.Cellulose khơng có ý nghĩa mặt dinh dưỡng người khơng tiêu hóa ống tiêu hóa Hình 1.4 Cellulose[45] • Hemicellulose: nhóm polysaccharide khơng tan nước, tan dung dịch kiềm Hemicellulose thành phần thành tế bào thực vật tồn chủ yếu phần vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu Khi thủy phân hemicellulose thu monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose, galactose) nhóm pentose (như arabinose, xilose)