Tài liệu thực tập Vi sinh

KHOA Y – ĐẠI HỌC TRÀ VINH TÀI LIỆU THỰC TẬP VI SINH DÀNH CHO Y2 BỘ MÔN VI SINH HỌC TÀI LIỆU LƯU HÀNH NỘI BỘ - 2020 MỤC LỤC NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN CÁCH LẤY VI KHUẨN ĐỂ CẤY VÀ LÀM PHẾT NHUỘM VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ BÀI 2: CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG 10 BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM 14 BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM 17 BÀI 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG 23 BÀI 6: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 NGƢỜI BIÊN SOẠN PGS, TS, BS Võ Thị Chi Mai NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM  Sinh viên đến thực tập phịng thí nghiệm vi sinh phải: - Cắt móng tay ngắn - Cắt tóc ngắn kẹp tóc thật gọn gàng - Trước vào phịng thí nghiệm, mặc áo chồng theo qui định Khoa - Đúng Trễ 10 phút, xem vắng không phép Vắng học phải cho phép người quản lý lab điều phối viên - Khơng tự ý chuyển nhóm học, có việc bận cần chuyển nhóm với sinh viên khác để tránh tải sinh viên – dụng cụ  Khi đến thực tập, sinh viên chịu trách nhiệm dụng cụ sử dụng buổi học Hễ bị hay làm hư hỏng phải mua trả lại  Các đồ dùng mang theo: - Vở thực tập, bút viết, khăn giấy  Để tránh lây nhiễm nguy hiểm: - Không để cặp-ba lô lên bàn thực tập - Không ăn uống học Không đùa giỡn phịng thí nghiệm - Đặt đồ dùng chỗ qui định (thí dụ: pipette để vào bình đựng thuốc sát trùng; lam kính dùng để vào thố đựng nước sát trùng; vòng cấy, kim cấy cắm giá; lọ thuốc nhuộm để vị trí giá nhuộm) - Phải đốt vòng/kim cấy trước sau dùng Khơng để vịng/kim cấy chưa đốt lên mặt bàn - Phải cẩn thận cầm lam kính làm phết vi khuẩn cịn sống - Khơng mang dụng cụ khỏi phịng thí nghiệm - Nếu đánh rơi vãi vật nhiễm trùng phải đổ dung dịch sát trùng lên Nếu bị tai nạn phải báo cho cán phụ trách - Giữ gìn phịng thí nghiệm - Khơng được: vẽ, viết lên tường/lên bàn, nhổ lên sàn, nhổ vào bồn rửa, vứt rác bừa bãi - Phải theo dẫn giảng viên  Sau buổi thực tập, sinh viên phải kiểm tra dụng cụ, cất kính hiển vi, phun cồn 70o khử khuẩn mặt bàn thực tập Rửa tay nước xà phòng  Sinh viên phải đọc kỹ thực tập trước buổi thực tập để khỏi thu kết tốt  Vắng buổi thực tập sinh viên không thi cuối khóa PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN I KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Cách tìm vi trường:  Nhỏ giọt dầu soi kính lên tiêu bản, đặt lam kính lên giá để vật  Xoay vật kính dầu (vật kính 100X) nấc  Nhẹ nhàng hạ vật kính xuống cho vật kính xuống sát tiêu nhúng vào giọt dầu Tránh hạ vật kính xuống thấp làm vỡ tiêu  Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp: - Nâng kính tụ quang lên hết mức - Mở hết chắn sáng - Bỏ lọc sáng (nếu có)  Nhìn vào thị kính, dùng tay xoay ốc sơ cấp (ốc lớn) thấy vi trường dừng  Chuyển sang điều chỉnh ốc thứ cấp (ốc nhỏ) hình ảnh rõ nét Cách quan sát tiêu bản:  Mắt nhìn vào thị kính  Một tay điều chỉnh ốc thứ cấp hình ảnh ln rõ nét  Một tay điều chỉnh hai ốc chỉnh biên độ để di chuyển vị trí quan sát  Cần quan sát mẫu vật tiêu cách theo đường zig-zag  Nhận xét chi tiết quan sát được: - Chọn nơi vi khuẩn khơng q dày - Xác định hình thể vi khuẩn - Cách bắt màu nhuộm - Cách xếp vi khuẩn - Đối với tiêu nhuộm từ bệnh phẩm, cần ý đến tế bào khác vi khuẩn: bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân, tế bào biểu mô Vi khuẩn nằm hay ngồi tế bào? tế bào cịn nguyên vẹn hay bị biến dạng? Giữ gìn bảo quản kính hiển vi: Sau sử dụng: - Nâng vật kính lên để tách vật kính khỏi tiêu Lấy tiêu khỏi giá để vật - Xoay vật kính dầu tới vị trí dễ lau Dùng giấy lau kính đặc biệt phịng thí nghiệm phát lau dầu vật kính nhúng dầu Lưu ý: không sử dụng loại giấy khác để lau vật kính dầu - Xoay vật kính 10x vào nấc điều chỉnh vật kính xuống mức thấp - Điều chỉnh ốc chỉnh biên độ vị trí - Cầm kính hiển vi hai tay: tay cầm thân kính, tay đỡ bệ kính, đem cất vào vị trí tủ kính CÁCH LẤY VI KHUẨN ĐỂ CẤY VÀ LÀM PHẾT NHUỘM Hình 1: Cách cầm mở ống nghiệm - Cầm ống nghiệm có vi khuẩn tay trái; giữ ống nằm ngang nghiêng 450 Tay phải cầm vòng cấy cầm bút Hơ đầu vịng cấy nóng đỏ đèn cồn - Mở nút gòn/nắp ống nghiệm cách cặp vào ngón út lịng bàn tay phải - Sát trùng miệng ống nghiệm mở nút cách xoay lửa Đưa vòng cấy vào, lấy lượng nhỏ vi khuẩn để cấy làm phết nhuộm - Hơ nóng lại đầu ống nghiệm đậy lại đặt lên giá ống nghiệm - Sau làm phết, đốt đầu vòng cấy để diệt hết vi khuẩn cịn sót lại Đặt thẳng đứng vịng cấy vơ trùng vào giá Hình 2: Cách lấy vi khuẩn từ canh thang VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN Kim cấy vòng cấy: - Kim cấy vòng cấy làm sợi dây kim loại chrome/platin - Phải đốt vòng/kim cấy trước sau lấy vi khuẩn Phải để vòng/kim cấy đứng thẳng lửa đèn cồn, từ phần nguội kéo dần phần nóng lửa Các ống mơi trường: - Phải hơ nóng miệng ống sau mở trước đậy nút ống nghiệm Nút phải kẹp ngón tay út, tránh chạm vào vật khác Khi mở nút ống nghiệm, nghiêng góc khoảng 450 để tránh vi khuẩn từ mơi trường bên ngồi rơi thẳng vào ống nghiệm - Việc lấy vi khuẩn từ ống môi trường thực bên cạnh lửa đèn cồn Đĩa Petri: Môi trường thạch cấy đựng đĩa Petri Khi cấy nắp, không mở toang hết nắp đĩa Petri BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ I Mục tiêu: 1) Nhuộm Gram: Thực kỹ thuật Lý giải kết 2) Chứng minh diện vi khuẩn: Quán triệt tầm quan trọng việc rửa tay 3) Kháng sinh đồ: Thực kỹ thuật định tính đo nhạy cảm kháng sinh II CHUẨN BỊ TIÊU BẢN VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM Chuẩn bị lam kính: Miếng lam kính dùng để phết vi khuẩn phải khô Hơ qua đèn cồn để nguội Tránh chạm ngón tay vào mặt kính Cách gắn vi khuẩn vào miếng lam: - Vẽ lam kính vịng trịn đường kính cm - Lấy vịng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng trải mỏng diện tích vịng vẽ Nếu lấy vi khuẩn từ mơi trường đặc phải nhỏ giọt nước lên lam trước cho vi khuẩn vào trải - Để khơ ngồi khơng khí - Cố định phết vi khuẩn cách hơ qua lửa III PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Đây phương pháp nhuộm vi khuẩn học Nhuộm Gram gọi phương pháp nhuộm kép cách nhuộm dùng loại phẩm nhuộm tương phản màu sắc, tím Gentian đỏ Safranin Giúp phân biệt vi khuẩn Gram dương Gram âm Nguyên tắc: Dùng cồn ethanol tẩy màu hợp chất “Tím Gentian – Iode” Vi khuẩn Gram dương khơng bị màu tím Vi khuẩn Gram âm bị cồn tẩy màu nên bắt màu nhuộm thứ nhì đỏ Safranin Vật liệu: 2.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli 2.2 Lam kính 2.3 Bộ thuốc nhuộm Gram gồm: * Tím gentian * Lugol * Ethanol 950 * Đỏ Safranin Kỹ thuật: Làm phết vi khuẩn theo hướng dẫn - Phủ phẩm tím Gentian lên phết vi khuẩn 30 giây - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa - Phủ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn 30 giây - Rửa nước - Tẩy ethanol 10 giây - Rửa nước - Phủ Safranin lên phết vi khuẩn 30 giây - Rửa nước Thấm khô lam tiêu - Nhỏ giọt dầu soi lên phết nhuộm Quan sát qua kinh hiển vi với vật kính dầu Ghi nhận kết quan sát vi thể Sau xem, cho lam tiêu vào thố đựng nước sát trùng IV CHỨNG MINH SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN Vật liệu: Đĩa thạch dinh dưỡng (Nutrient agar, NA); bút lông Kỹ thuật: Ghi tên nhóm, tổ, ngày tháng mặt ngồi đáy đĩa thạch 2.1 Mở nắp đĩa NA Đặt bậu cửa sổ / mặt bàn / bồn rửa, vòng 15 phút 2.2 Ở đĩa NA khác, vạch đường bên ngồi mặt đáy đĩa để chia đơi thành phần A B Ấn nhẹ ngón tay lên mặt thạch: phần A dấu ngón trước rửa tay; phần B dấu ngón sau rửa tay 2.3 Đậy nắp đĩa NA Đặt ngược đĩa thạch đáy lên trên, nắp dưới, cho vào tủ ủ 370C 24 sau đọc kết Đọc kết quả: Quan sát vi khuẩn mọc NA mắt trần Đếm số khúm vi khuẩn mọc Ghi kết đĩa NA đặt khơng khí đĩa NA cấy dấu ngón tay Các lồi vi khuẩn thường tạo nên loại khuẩn lạc khác về: - Hình dạng: bờ viền, bề mặt - Kích thước: đường kính (mm) - Màu sắc; độ trong/đục Sự khác tượng trưng cho lồi vi khuẩn khác Kết luận: có lồi vi khuẩn diện đĩa thạch? V KHÁNG SINH ĐỒ Kháng sinh đồ phương pháp tìm độ nhạy cảm vi khuẩn loại kháng sinh Có phương pháp chính: - Định tính: phương pháp đĩa giấy tẩm kháng sinh khuếch tán thạch theo Kirby-Bauer - Định lượng: tìm nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh vi khuẩn (MIC, minimum inhibitory concentration) Kháng sinh đồ theo phƣơng pháp khuếch tán thạch Nguyên tắc: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp khuếch tán mặt thạch ngăn chặn phát triển vi khuẩn Vịng vơ khuẩn (khơng có vi khuẩn mọc) thể vi khuẩn bị ức chế thuốc kháng sinh Kích thước đường kính vịng vơ khuẩn khác tùy thuộc loại vi khuẩn loại kháng sinh, phản ánh mức độ: nhạy cảm, trung gian, đề kháng Trường hợp khơng có vòng ức chế, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh Vật liệu: 2.1 Đĩa kháng sinh: Là đĩa giấy đường kính 6mm tẩm hàm lượng dung dịch kháng sinh theo tiêu chuẩn Đĩa kháng sinh cất giữ ống có chứa chất chống ẩm, nhiệt độ từ – 80C Khi chuẩn bị dùng lấy để ổn định nhiệt độ phịng khoảng 30 phút Có nhiều loại kháng sinh Các tiêu chí lựa chọn kháng sinh thử nghiệm hướng dẫn chi tiết Các tiêu chí là: - Chọn kháng sinh đại diện cho nhóm có hoạt phổ - Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm - Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn - Tùy theo chiến lược sách sử dụng kháng sinh vùng miền 2.2 Môi trường: Thường dùng môi trường Muller Hinton Agar (MHA) Chỉnh pH môi trường từ 7,2 đến 7,4 Môi trường chế vào đĩa Petri với bề dày thạch mm 2.3 Dung dịch chuẩn độ đục: Kích thước mầm cấy phải đạt từ 1x108 CFU/mL đến 2x108 CFU/mL (Colony Forming Unit) Ta dùng quang phổ kế so sánh độ đục ống vi khuẩn với độ đục 0,5 ống McFarland để chuẩn hóa kích thước mầm cấy Dung dịch chuẩn độ đục McFarland dung dịch muối BaSO4 2.4 Chuẩn bị mầm cấy: Vi khuẩn thử nghiệm Staphylococcus aureus Escherichia coli khiết Chọn – khúm cấy vào ống có chứa – ml môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) BHI (Brain Heart Infusion) Chỉnh độ đục ống vi khuẩn Dùng vòng 15 phút sau chuẩn độ đục 2.5 Vật liệu khác: que gòn vô khuẩn, kẹp nhỏ, thố nước sát trùng Kỹ thuật: 3.1 Dùng que gòn tẩm canh cấy khuẩn, ép que lên thành ống nghiệm cho 3.2 Hé nắp đĩa thạch MHA, trải vi khuẩn lên mặt thạch cách vừa đánh nhẹ vừa xoay que gòn lên khắp mặt thạch lần Để đảm bảo trải vi khuẩn, xoay đĩa thạch lần 600, đánh xoay que gòn khắp mặt thạch từ trái qua, từ xuống Bước cuối kéo que gòn vịng theo rìa mặt thạch Bỏ que gịn vào thố nước sát trùng 3.3 Chờ mặt thạch khô (khoảng 10 phút) 3.4 Hơ kẹp qua lửa, để nguội gắp đĩa kháng sinh, đặt nhẹ lên mặt thạch Các đĩa kháng sinh phải cách mép hộp thạch khoảng 1,5 cm cách khoảng cm Ấn nhẹ cho đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch Không chạm kẹp vào thạch 3.5 Đậy nắp đem đĩa MHA ủ 350C 18-24 3.6 Thực hành: - Nhóm làm kháng sinh đồ với S aureus: đặt đĩa kháng sinh Penicillin, Cefoxitin, Imipenem, Amikacin, Azithromycin, Cotrim - Nhóm làm kháng sinh đồ với E coli: đặt Ampicillin, Amoxicillin-clavulanate, Imipenem, Ceftriaxone, Amikacin, Cotrim (= trimethoprim-sulfamethoxazole) Đọc kết kháng sinh đồ: 4.1 Xung quanh đĩa kháng sinh khơng có vịng vơ khuẩn Kết luận: Vi khuẩn đề kháng với loại kháng sinh 4.2 Xung quanh đĩa kháng sinh có vịng vơ khuẩn, nơi tác động kháng sinh vi khuẩn không mọc Trong trường hợp này, ta đo đường kính vịng vơ khuẩn so sánh với đường kính chuẩn theo bảng hướng dẫn Có mức độ ảnh hưởng kháng sinh vi khuẩn thử nghiệm:  Nhạy cảm (S, susceptible); Trung gian (I, intermediate); Đề kháng (R, resitant) 4.3 Bảng hướng dẫn theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm Mỹ (CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute 2017): - Đối với Staphylococcus aureus: Tên kháng sinh S Penicillin 10 IU ≥ 29 mm Cefoxitin 30 mcg ≥ 22 Ciprofloxacin 5mcg ≥ 21 Azithromycin 15 mcg ≥ 18 Amikacin 30 mcg ≥ 17 Cotrim 1,25/23,75 mcg ≥ 16 I 16-20 14-17 15-16 11-15 R ≤ 28 mm ≤ 21 ≤ 15 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 10 - Đối với Escherichia coli: Tên kháng sinh Ampicillin 10 mcg Amox-clav 20/10 mcg Imipenem 10 mcg Ceftriaxone 30 mcg Amikacin 30 mcg Cotrim 1,25/23,75 mcg I 14-16 14-17 20-22 20-22 15-16 11-15 R ≤ 13 mm ≤ 13 ≤ 19 ≤ 19 ≤ 14 ≤ 10 S ≥ 17 mm ≥ 18 ≥ 23 ≥ 23 ≥ 17 ≥ 16 5.2 Cách tiến hành Dùng que gịn vơ trùng lấy vi khuẩn Streptococcus tiêu huyết  canh cấy trải lên mặt thạch máu Chờ mặt thạch khơ, đặt lên đĩa Taxo A đĩa giấy tẩm 0,04 đơn vị bacitracin Ủ 35oC/18-24 bình nến 5.3 Đọc kết Xung quanh đĩa giấy tẩm kháng sinh bacitracin có vịng vơ khuẩn  thử nghiệm Taxo A dương tính Kết luận vi khuẩn Streptococcus pyogenes THỬ NGHIỆM CAMP (Christie, Atkins Munch – Peterson) 6.1 Nguyên tắc Streptococci tiêu huyết  nhóm B (Streptococcus agalactiae) tiết yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với -lysin S aureus 6.2 Cách tiến hành  Cấy đường thẳng dòng vi khuẩn S aureus có sinh -lysin  Sau vạch đường cấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  (không phải nhóm A) thẳng góc với đường cấy S aureus cách 1-2 mm  Ủ 35oC/18 Hoặc 35oC/6 bình nến 6.3 Đọc kết Nếu thấy vùng tiêu huyết S aureus nơi tiếp cận Streptococci rộng hơn, sáng hơn, có dạng cánh cung/vảy cá  thử nghiệm CAMP dương tính Đó yếu tố CAMP Streptococcus agalactiae làm gia tăng vùng tiêu huyết S aureus THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM OPTOCHIN (TAXO P) 7.1 Nguyên tắc Pneumococcus nhạy cảm với optochin, thử nghiệm áp dụng để phân biệt Pneumococcus với Streptococci tiêu huyết  khác (ví dụ Streptococcus viridans) 7.2 Cách tiến hành Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  canh cấy trải lên mặt thạch máu Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa Taxo P đĩa giấy tẩm g optochin Ủ 35oC/18 bình nến 7.3 Đọc kết Xung quanh đĩa optochin xuất vịng vơ khuẩn với đường kính  14 mm  thử nghiệm Taxo P dương tính Kết luận: Streptococcus pneumoniae Lưu ý: Nếu đường kính vịng vơ khuẩn < 14 mm cần tiến hành làm thử nghiệm tan muối mật để xác định Pneumococcus 13 BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM Mục tiêu học tập: 1) Liệt kê tính chất dùng phân biệt Họ Vi khuẩn đường ruột với trực khuẩn Gram âm khác 2) Nhận định khúm lên men không lên men lactose thạch phân lập Mac Conkey 3) Thực thử nghiệm oxidase, xác định tính di động, khả lên men đường, đọc phản ứng IMViC trực khuẩn Gram âm VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROBACTERIACEAE) A ĐẠI CƢƠNG I TÍNH CHẤT: Đây vi khuẩn tìm thấy ruột người động vật, có đất cối Một số ký sinh, số khác hoại sinh Vi khuẩn đường ruột có tính chất chung sau: - Trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi - Đa số di động nhờ tiên mao (flagella) xung quanh thân, số không di động (Shigella, Klebsiella) - Lên men đường glucose (sinh không) - Khử nitrate thành nitrite - Không sản xuất enzyme oxidase Những vi khuẩn đường ruột thường gây bệnh cho người là: - Các nhóm E coli gây tiêu chảy: EPEC (enteropathogenic E coli): chủ yếu gây bệnh tr em ETEC (enterotoxigenic E coli): gây bệnh tiết độc tố ruột loại dễ bị hủy nhiệt (LT) loại bền với nhiệt (ST) EIEC (enteroinvasive E coli): gây bệnh xâm lấn tế bào EHEC (enterohemorrhagic E coli): gây bệnh tiết độc tố verotoxin EAEC (enteroadherent E coli): có khả bám dính bề mặt niêm mạc ruột - Shigella: Gây bệnh lỵ trực khuẩn, có bốn nhóm: Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga-like toxin) Nhóm C: S boydii: khơng tiết độc tố Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga - Salmonella: Có 2200 týp huyết khác Việc xác định týp dựa vào công thức kháng nguyên O, H K Hiện nay, dựa vào nghiên cứu DNA, người ta chia Salmonella làm lồi: Salmonella enterica Salmonella bongori Salmonella enterica có phụ lồi (subspecies) Phụ lồi I, cịn gọi Salmonella enterica subsp enterica, có tác nhân gây bệnh quan trọng: - Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi gây sốt thương hàn Salmonella enterica subsp enterica serotype Choleraesuis gây nhiễm khuẩn huyết áp-xe khu trú quan nội tạng Salmonella enterica subsp enterica serotype Paratyphi gây sốt phó thương hàn - Yersinia: Y pestis: gây bệnh dịch hạch Y enterocolitica: nhiễm khuẩn tiêu hóa, triệu chứng giống Shigella Y pseudotuberculosis: nhiễm khuẩn huyết, viêm hạch màng treo ruột - 14 II CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG CHO TRỰC KHUẨN GRAM ÂM Môi trƣờng vận chuyển: Dùng để chuyên chở bệnh phẩm, chứa chất dinh dưỡng (chỉ có muối đệm) đủ để vi khuẩn sống không phát triển Loại thường dùng CaryBlair Môi trƣờng phân lập: - Môi trường không ngăn chận: không chứa chất ức chế Ví dụ: thạch máu (BA), thạch dinh dưỡng (NA), canh thang BHI - Mơi trường phân biệt có chọn lọc: tùy theo thành phần ức chế có mơi trường, phân biệt thành:  Môi trường phân biệt - chọn lọc Ví dụ: thạch MC (MacConkey), thạch EMB (Eosin Methylene Blue)  Môi trường phân biệt - chọn lọc vừa Ví dụ: thạch SS (Salmonella-Shigella), thạch Deoxycholate-Citrate, Hektoen Enteric  Môi trường phân biệt - chọn lọc cao Ví dụ: thạch Brilliant Green Bile Lactose… Mơi trƣờng phong phú: Dùng để tăng sinh loại vi khuẩn cần tìm Ví dụ: canh GN (Gram negative), canh Selenite F… Mơi trƣờng xác định tính chất sinh hóa vi khuẩn: Một số môi trường sử dụng gồm: KIA (Kligler’s iron agar), TSI (triple sugar iron agar), SIM, MR-VP, citrate, … Phản ứng định danh đơn giản trực khuẩn Gram âm: IMViC = Indole, MR, VP, Citrate Kết cấy trực khuẩn Gram âm vào KIA, TSI Kligler s iron agar (KIA) mơi trường có đường: glucose lactose Mơi trường cịn chứa đỏ phenol làm chất thị pH để xem có lên men hay khơng, sulfate sắt để tìm H2S làm đen môi trường Nồng độ glucose 1/10 nồng độ lactose Nồng độ acid thấp sinh glucose, đó, phần thạch nghiêng (slant) bị oxid hóa mau chóng, lactose khơng lên men thạch nghiêng trở lại tính kiềm (đỏ) Trái lại, trương lực oxygen thấp phần thạch đứng (butt), tác dụng acid trì khơng trở lại tính kiềm Do đó, ống có phần thạch đứng acid (vàng) phần thạch nghiêng kiềm (đỏ) dấu hiệu có lên men glucose mà thơi Nếu lactose sử dụng hai phần thạch đứng nghiêng vàng Sự sản xuất gas từ glucose ghi nhận bọt khí, hay bể nát cột thạch Pseudomonas lồi khơng lên men đường mọc mặt thạch không làm biến màu ống môi trường Môi trường TSI (Triple Sugar Iron) khác KIA chỗ có thêm đường saccharose (sucrose) Sucrose có nồng độ lactose, nghĩa gấp 10 glucose; sử dụng sucrose giống lactose, ghi nhận acid hóa phần thạch đứng thạch nghiêng Mơi trường giúp ta tìm vi khuẩn lên men lactose chậm (nhiều ngày), người ta thấy đa số vi khuẩn đường ruột lên men lactose chậm lên men sucrose sau ngày Thử nghiệm tìm H2S, indole, di động Môi trường sử dụng ống SIM, loại thạch mềm (bán lỏng, semisolid) - Sinh hydrogen sulfite (H2S): vi khuẩn khử sulfite sử dụng hợp chất chứa lưu huỳnh (thiosulfate) tạo H2S Chất phản ứng với ion sắt môi trường thành kết tủa FeS màu đen - Sinh indole: vi khuẩn có enzyme tryptophanase khử tryptophan peptone mơi trường tạo sản phẩm có gốc indole Sản phẩm kết hợp nhân benzene thuốc thử thành phức chất quinone màu đỏ - Tính di động: vi khuẩn di động làm đục hết mơi trường; lồi khơng di động mọc theo đường kim cấy 15 Phản ứng MR (methyl red) Phân biệt mức độ lên men đường glucose vi khuẩn - Vi khuẩn lên men glucose mạnh tạo nên sản phẩm cuối phức hợp acid bền, làm môi trường chuyển sang pH acid < 4,4 khiến cho thuốc thử methyl red có màu đỏ Kết luận: MR dương tính - Vi khuẩn lên men glucose yếu tính acid khơng đủ làm đỏ thuốc thử; pH > methyl red có màu vàng Kết luận: MR âm tính Phản ứng VP (Voges-Proskauer) Giúp phát sản phẩm trung gian acetoin tạo trình lên men glucose Với thuốc thử cho vào, acetoin bị oxid hóa thành diacetyl kết hợp với thuốc thử thành phức hợp màu đỏ: phản ứng dương tính Phản ứng VP âm tính có màu thuốc thử Thử nghiệm citrate Giúp nhận biết khả vi khuẩn sử dụng citrate làm nguồn carbon Vi khuẩn sử dung citrate sử dụng muối ammonium làm nguồn đạm Môi trường nuôi có chứa sodium citrate muối ammonium Cả khả làm kiềm hóa mơi trường, biến chất thị màu bromothymol blue từ xanh lục thành xanh dương Phản ứng citrate dương tính: màu xanh dương Phản ứng âm tính: mơi trường khơng đổi màu xanh lục vi khuẩn không mọc B THỰC HÀNH Nhuộm Gram trực khuẩn đường ruột mọc đĩa thạch MC Thực phản ứng oxidase a Nguyên tắc: thử nghiệm cytochrome oxidase dùng số thuốc nhuộm pphenylenediamine dihydrochloride để làm chất tiếp nhận electron thay oxygen Ở khử, thuốc nhuộm không màu, nhiên, có diện cytochrome oxidase oxygen khí trời p-phenylenediamine bị oxid hóa thành lập indophenol blue b Cách làm: dùng vòng cấy lấy khúm vi khuẩn trải lên đĩa giấy oxidase tẩm dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% c Đọc kết quả: Phản ứng dương: đĩa giấy có màu tím đen khoảng 10 - 20 giây Phản ứng âm: khơng có đổi màu Lý giải phản ứng ống thạch KIA, ống SIM Đọc phản ứng dãy sinh hóa E coli, Shigella sonnei, Proteus mirabilis Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa Cho biết chất ức chế thành phần môi trường phân biệt-chọn lọc thường dùng: MC, EMB, SS 16 BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM Mục tiêu: 1/ Mơ tả kỹ thuật thích đáng để thu thập loại bệnh phẩm khác 2/ Ghi nhớ bệnh phẩm khơng dùng ni cấy kỵ khí 3/ Biết cách bảo quản chuyển loại bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm 4/ Thực đắn kỹ thuật đơn giản lấy gởi bệnh phẩm máu, đàm, mủ, phân, nước tiểu đến xét nghiệm vi sinh MỞ ĐẦU Phẩm chất bệnh phẩm định thông tin chẩn đoán Hậu việc thu thập chuyển bệnh phẩm không cách:  không phân lập tác nhân gây bệnh  phân lập vi khuẩn tạp nhiễm vi khuẩn thường trú cho thuốc không HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM       Lấy bệnh phẩm lúc bệnh giai đoạn cấp tính trước cho kháng sinh tốt Cẩn thận không làm nhiễm bề mặt vật chứa phiếu xét nghiệm Vật chứa phải thích hợp, tiệt trùng, có nút/nắp đậy, khơng rị rỉ Tránh tạp nhiễm vi khuẩn thường trú Dùng dụng cụ kỹ thuật vô khuẩn để không đưa vi sinh vật bên vào quan làm thủ thuật can thiệp Vùng da lành: lau trước với cồn 70o vùng da rộng, sau bơi povidone iodine khoảng 3cm tập trung chỗ chích rút bệnh phẩm (máu, ổ áp xe) Chờ khô thuốc sát trùng lấy bệnh phẩm Lau lại với cồn sau lấy bệnh phẩm Lấy đủ chất thử Ghi nhãn lọ bệnh phẩm: họ tên, tuổi bệnh nhân; số nhập viện; ngày lấy chất thử; khoa gửi bệnh phẩm Ghi phiếu xét nghiệm: + loại chất thử; chẩn đoán; yêu cầu xét nghiệm; tên bác sĩ yêu cầu CHỌN LỰA CHẤT THỬ Vết phỏng, Loét nằm lâu, Loét dãn tĩnh mạch, Ap xe quanh hậu môn, Tổn thương hoại tử, Tổn thương nha chu: tốt mẫu mơ/mẫu sinh thiết, dịch hút, dùng que gịn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ Không nuôi cấy: chất tiết mở thông đại tràng, sản dịch, chất nôn, đầu ống thông Foley Khơng ni cấy kỵ khí: phết ngốy mũi hầu, họng dịch súc rửa phế quản-phế nang (không bảo vệ) chất hút qua nội khí quản hay mở thơng khí quản đàm ho khạc phết niệu đạo nước tiểu tiểu bình thường đặt ống thơng phân hay bệnh phẩm trực tràng sản dịch, phết âm hộ, phết cổ tử cung dịch tuyến tiền liệt, tinh dịch Chọn vị trí thích hợp để lấy bệnh phẩm cấy kỵ khí Tốt mẫu mơ/mẫu sinh thiết, đặt mơi trường chun chở kỵ khí Hoặc dùng ống tiêm rút dịch, cho vào ống nghiệm chân không hay môi trường chun chở kỵ khí Nếu dùng que gịn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ cắm vào môi trường chuyên chở kỵ khí 17 HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM Máu : a Thời gian số lần: Sốt thường theo sau nhiễm khuẩn huyết 30 – 90 phút, thời gian lấy máu tốt lúc xuất lạnh run; sau bắt đầu tăng thân nhiệt Riêng trường hợp sốt liên tục (như viêm nội tâm mạc, viêm nội mạch, nhiễm trùng khơng kiểm sốt được, giai đoạn sớm sốt thương hàn, nhiễm brucella) thời điểm lấy máu không quan trọng Cấy máu lần đủ Ít nên cấy máu lần để loại trừ hay xác định chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết Cấy máu nhiều lần không cung cấp thêm nhiều thông tin Nếu đủ điều kiện lần lấy máu nên cấy hiếu khí kỵ khí + Nhiễm khuẩn huyết cấp tính: 2-3 lần vị trí khác + Viêm nội tâm mạc cấp tính: lần cách 1-2 vị trí khác + Viêm nội tâm mạc bán cấp: viêm nội tâm mạc cấp tính Nếu sau 24 mẫu đầu âm tính cấy thêm mẫu khác + Viêm nội tâm mạc dùng kháng sinh trước nhập viện 1–2 tuần: mẫu máu ngày ngày b Lượng máu: tỉ lệ máu/môi trưòng 1/5 – 1/10  Tr nhỏ tr em 1-5 mL  Người lớn 10-30 mL Có thể dùng canh cấy tự chế 50 mL chai (tryptic soy broth hay brain heart infusion, thêm 0,025% Sodium Polyanethol Sulfonate) chai cấy máu bán sẵn Lưu ý: SPS ức chế vài cầu khuẩn meningococcus, gonococcus,… Chai cấy máu bán thị trường Bactec, Bact/Alert mơi trường ni cấy bổ dưỡng cịn chứa chất hấp phụ kháng sinh dùng c Cách lấy máu: Sát trùng da chỗ lấy máu cách Sát trùng nắp cao su chai cấy máu Chờ khơ Chích lấy máu tĩnh mạch hay động mạch Hệ thần kinh trung ƣơng: a Dịch não tủy: Do bác sĩ chuyên khoa chọc hút đốt sống lưng L3- L4 L4-L5 Đảm bảo thao tác vô trùng Rút mL dịch não tủy cho vào 3-4 lọ gởi lọ đục đến xét nghiệm vi sinh Các lọ để thử sinh hóa tế bào Nếu lượng dịch không đủ, bác sĩ điều trị phải cân nhắc theo thứ tự ưu tiên xét nghiệm Xử lý mẫu thường dẫn đến kết âm giả điều có hại chọc hút lại cho có đủ thể tích  1mL để cấy vi khuẩn, virus  mL để cấy vi nấm vi khuẩn lao b Áp xe não, mô sinh thiết: Lấy mẫu phẫu thuật Phải có cấy kỵ khí Đƣờng tiêu hóa: a Phân: Lấy khoảng 1mL phân hay cỡ hạt bắp vào lọ khô, hay lọ vơ trùng có nắp đậy Chọn chỗ phân dính đàm nhầy lẫn máu, có Trường hợp khơng gửi được: < giờ, giữ nhiệt độ phòng < 24 giờ, giữ 4oC Nếu lâu hơn, cho phân vào môi trường chuyên chở để nhiệt độ phịng Khơng gửi cấy phân bệnh nhân nằm viện ngày khơng có chẩn đốn viêm dày-ruột Nên nghĩ đến viêm ruột Clostridium difficile bệnh nhân nội trú tiêu lỏng phân mềm > lần 24 b Ngoáy trực tràng: Cho đầu que gòn vào qua khỏi thắt hậu mơn cm, xoay que gịn để lấy mẫu khe hậu mơn Khơng dùng ngốy trực tràng để soi tươi tìm vi khuẩn dịch tả 18 c Hút dịch dày - Nước súc rửa dày để tìm vi khuẩn lao: Làm thủ thuật sáng sớm sau thức dậy Luồn ống thông dày bôi trơn qua miệng hay mũi xuống tới dày rửa với 25– 50 mL nước cất vô trùng để lạnh - Hút tá tràng tìm Giardia, ấu trùng giun đũa ấu trùng giun lươn e Sinh thiết thực quản (Candida, CMV, HSV), dày (H pylori), tá tràng, ruột non (Giardia, Cryptosporidium, Microsporidium), trực tràng (E histolytica, B coli, HSV) Sinh dục nữ: Chủ yếu để định bệnh lây qua đường tình dục, N gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, …, liên cầu nhóm B, nấm Candida Nếu nghĩ nhiễm khuẩn khơng tác nhân cần phải cấy kỵ khí a Dịch ối: Hút qua thủ thuật chọc ối / mổ lấy thai / ống thông tử cung b Nang Bartholin: sát trùng da hút qua ống tuyến c Cổ ngồi: Khơng dùng chất bơi trơn đặt mỏ vịt Lau chất tiết chất nhày Xoay que gịn vơ trùng để lấy chất tiết từ cổ Nếu khơng thấy chất tiết đưa que qua ống cổ tử cung d Nội mạc: Lấy chất hút qua cổ tử cung hay sinh thiết nội mạc đường nội soi Gửi cấy kỵ khí e Âm đạo: Dùng mỏ vịt khơng bơi trơn dùng nước cất vô trùng rửa chất tiết, dùng que vô trùng lấy chất tiết niêm mạc vòm âm đạo để cấy soi f Niệu đạo: Chỉ lấy bệnh phẩm sau bệnh nhân tiểu Sinh dục nam: a Mào tinh hoàn: dùng kim ống tiêm để chọc hút b Tuyến tiền liệt: Rửa quy đầu với xà nước Xoa tuyến qua đường trực tràng Lấy chất tiết ống nghiệm que gịn vơ trùng Đồng thời lấy nước tiểu trước sau xoa tuyến c Niệu đạo: Lấy bệnh phẩm sau bệnh nhân tiểu hay Đưa que lấy bệnh phẫm niệu-sinh dục vào niệu đạo 2-4 cm Xoay giữ giây rút d Tổn thương sinh dục: sang thương dương vật âm hộ Rửa bề mặt nước muối sinh lý Cạo sang thương xuất dịch Dùng gạc lau dịch chất cặn An sang thương dịch chảy Hút dịch với kim cỡ 25-27 Dùng que vô trùng chà mạnh sang thương (tìm Herpesvirus, Haemophilus ducreyi) Mắt: bác sĩ chuyên khoa lấy mẫu a Lưu ý: Lấy mẫu tìm virus Chlamydia trước bơi tê chỗ Tìm Chlamydia, dùng que alginate calcium Tìm virus, dùng que gịn/đầu Dacron (khơng dùng que có cán gỗ) Cấy lên mơi trường thích hợp làm phết giừơng gửi đến phòng xét nghiệm b Kết mạc: Lấy mẫu bên lành để phân biệt vi khuẩn gây bệnh với vi khuẩn thường trú 19 Dùng que thấm nước muối sinh lý vô trùng lăn kết mạc Cấy lên thạch máu / thạch nâu Làm phết lam c Cạo kết mạc: Bôi gây tê chỗ Dùng dao bay Kimura vô trùng Cấy làm phết d Cạo giác mạc: Thực làm phết kết mạc Bơi tê chỗ Giữ mí mắt mở Cạo nhiều chỗ loét Cấy làm phết nhuộm e Dịch nội nhãn: dùng kim hút Cấy làm phết nhuộm Đƣờng hơ hấp: Liên hệ với phịng xét nghiệm trước thu thập bệnh phẩm cần cách xử lý mơi trường đặc biệt để tìm Corynebacterium diphtheriae, Arcanobacterium haemolyticum, Bordetella pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Legionella, Chlamydia, Mycoplasma 7a Đƣờng hô hấp dƣới: 7a1 Đàm khạc: dặn bệnh nhân súc miệng với nước Hướng dẫn bệnh nhân nghiệm pháp hít thở thì: hít sâu-thở chậm; hít sâu-thở mạnh; hít sâu-ho Nếu cần, giúp long đàm cách vỗ lưng bệnh nhân Trường hợp bệnh nhi/người không tự ho được, phải hút đàm Bệnh phẩm tốt: quang trường < 10 tế bào vảy,  25 bạch cầu đa nhân trung tính, đọc vật kính x10 (tương đương độ phóng đại x100) 7a2 Đàm gây ho: chải niêm mạc miệng, lưỡi, lợi; súc kỹ với nước Hít khoảng 25 mL nước muối ưu trương (3-10%) qua khí dung kế 7a3 Hút từ thủ thuật mở thơng khí quản / ống nội khí quản 7a4 Bệnh phẩm từ nội soi phế quản: bác sĩ chuyên khoa lấy Rửa, chải phế quản Súc rửa phế quản-phế nang Sinh thiết qua phế quản Súc rửa phế quản-phế nang: + Bơm vào lượt 5-20 mL nứơc muối khơng chứa chất kìm khuẩn + Hút nước muối vào vật chứa trước bơm lượt khác Giữ lượt nước muối vị trí chung lọ Chải phế quản: Bác sĩ điều trị luồn ống thông nịng (nịng ngồi đậy nút Carbowax) vào ống nội soi phế quản Bàn chải đưa qua khỏi đầu nòng để gom chất tiết (0,0010,01 mL) từ tiểu phế quản xa Cho bàn chải vào vật chứa có mL nước muối vơ trùng / dung dịch lactate Ringer Sinh thiết qua phế quản: lấy bệnh phẩm kìm qua kênh sinh thiết ống nội soi phế quản Cho bệnh phẩm vào lọ có nước muối sinh lý 7a5 Chất hút phổi: dùng kim ống tiêm hướng dẫn kỹ thuật chụp cắt lớp 7a6 Sinh thiết phổi: lấy lúc mổ khoảng 1-3 cm2 mô, đựng lọ vô trùng formalin Tìm nấm phổi tốt mơ sinh thiết / chất hút Hoặc thu thập mẫu đàm 3-5 mL vào sáng sớm 7b Đƣờng hô hấp trên: - Miệng: lấy hết chất tiết cặn bã bề mặt sang thương bỏ đi; dùng que gòn thứ nhì chà mạnh sang thương, tránh chỗ mơ lành - Phết mũi: que gòn thấm nước muối sinh lý lấy chất nhày lỗ mũi (đưa vào cm) Tìm người lành mang MRSA streptococci - Súc mũi: cấy virus Ngửa cổ bệnh nhân Nhỏ nước muối sinh lý vào lỗ mũi Hút lấy nước rửa - Ngốy mũi-hầu: tìm N meningitidis B pertussis Đưa que alginate calcium vào vùng hầu sau qua đường mũi Xoay que giây Cấy lập tức/ cho vào mơi trường chun chở - Hút mũi-hầu: tìm Streptococcus nhóm A, N meningitidis, C diphtheriae B pertussis - Chất hút xoang: rút ống tiêm chất hút từ xoang hàm, trán, nơi khác - Dịch chọc màng nhĩ: để chẩn đoán nhiễm khuẩn tai điều trị thất bại + Lau tai với chất tẩy nhẹ 20 + Dùng ống tiêm hút chất thử qua trống tai + Nếu trống vỡ, lấy chất tiết que vô trùng qua mỏ vịt - Họng: tìm Streptococcus nhóm A, N gonorrhoeae, A haemolyticum Đè lưỡi Lấy mẫu que gòn vùng hầu sau, hạch hạnh nhân vùng viêm loét Tránh má, lưỡi, tiểu thiệt môi Các dịch vô trùng khác: dịch ổ bụng, nước báng, mật, khớp, màng tim, màng bụng, màng phổi bao khớp Tìm vi khuẩn: 1-5 mL Tìm vi khuẩn lao, vi nấm: > 10 mL Da mô mềm: - Phỏng: sinh thiết mô sâu lấy nhiều chỗ - Vết thương nông: dùng kim lấy chất hút chỗ sâu sang thương tốt que gòn - Nấm da: rửa vùng nhiễm nước vô trùng Cạo bề mặt da bờ sang thương Không rút máu - Loét / nốt cục: + Sát trùng da, bỏ cặn bã  Nạo đáy chỗ loét hay nốt cục 10 Vết thƣơng sâu: - Vết cắn / chấn thương: hút mủ vết thương - Xương: lấy bệnh phẩm mổ - Vết thương sâu / Ap xe: dùng kim hút phần sâu sang thương, tránh tạp nhiễm bề mặt vết thương 11 Nƣớc tiểu: + Rửa lỗ tiểu với xà phòng nước Lấy nước tiểu dòng lần tiểu sáng sớm + Rút nước tiểu xương mu + Nội soi bàng quang:  Bệnh nhân uống nhiều nước đến bàng quang đầy  Rửa lỗ tiểu với xà phòng nước  Luồn ống nội soi bàng quang  Lấy 5-10 mL nước tiểu Ghi nhãn “nước tiểu lấy qua ống thơng”  Dùng nước muối sinh lý kích thích bàng quang Hút nước rửa ghi nhãn “nước rửa bàng quang”  Đưa ống thông đến niệu đạo hay đến bể thận  Mở khóa ống nội soi Bỏ 5-10 mL Lấy mẫu bên (5-10 mL mẫu) Ghi nhãn: nước tiểu thận trái / thận phải 1, 2, 3, 12 Những chất thử khác: 12a Ống thông tĩnh mạch: lấy cm đầu xa ống thông 12b Nha khoa: viêm họng Vincent, viêm quanh chóp, viêm nha chu, viêm lợi + Lau bờ lợi bề mặt lợi + Lấy chất thử sang thương lợi dụng cụ nạo cao CHUYỂN BỆNH PHẨM Tốt gởi bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm Hoặc sớm tốt Nếu không gửi được, giữ bệnh phẩm 2-8oC Ngoại trừ:  chai cấy máu, để 35-37oC  bệnh phẩm tìm Neisseria, tìm vi khuẩn kỵ khí: để nhiệt độ phịng  dịch não tủy tìm vi khuẩn: để nhiệt độ phòng  phân: cấy vi khuẩn, cho vào mơi trưịng chun chở tìm ký sinh trùng, cho vào chất bảo quản 21 Môi trƣờng chuyên chở Không cần chất bảo quản Giữ 4oC Giữ nhiệt độ phịng Mơ tử thiết, Rửa phế quản, Dịch não tủy tìm vi khuẩn, Dịch Thơng tĩnh mạch, Dịch não tủy khớp tìm virus, Sinh thiết phổi, Dịch màng tim, Đàm, Nước tiểu thơng / dịng Cấy trực tiếp lên môi trường Cạo giác mạc, Cấy máu, Bordetella spp., Bệnh phẩm tìm lậu cầu, Dịch kính Môi trường chuyên chở Sinh thiết vết phỏng, Bệnh Stuart’s, Amies, Cary-Blair phẩm tai ngồi, Bệnh phẩm tìm Campylobacter spp., Shigella spp., Vibrio spp., Yersinia spp Tủy xương, Que cổ tử cung, Que kết mạc, Que tai trong, Bệnh phẩm quan sinh dục, Que mũi-hầu, Bệnh phẩm hô hấp trên, Bệnh phẩm tìm Bordetella spp., Corynebacterium spp., Neisseria spp., Salmonella spp Chuyên chở kỵ khí Dịch bụng, Dịch ối, túi cùng, Mật, Tổn thương sâu, Mô phẫu thuật, Chất hút phổi, xoang, nội khí quản, Nước tiểu rút xương mu, Bệnh phẩm tìm Actinomyces spp 22 BÀI 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG Mục tiêu: 1/ Phân biệt hóa chất dùng khử trùng theo cơng dụng 2/ Biết sử dụng hóa chất chế tác động chúng để trùng phù hợp 3/ Biết cách sử dụng lò hấp ướt, tủ an tồn sinh học tia cực tím I ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ Sự trùng / phƣơng pháp khử trùng / kỹ thuật vô khuẩn: chung việc áp dụng biện pháp tiệt trùng tẩy uế để chống lại tình trạng nhiễm trùng hay nguy lây nhiễm Sự tiệt trùng (sterilization): tiến trình tiêu diệt hay loại bỏ dạng sống vi sinh vật chất liệu hay đồ vật Sự tẩy uế (disinfection): tiến trình làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh đến mức chúng khơng cịn nguy hại Chất sát trùng (antiseptic): tác nhân hóa học dùng ngồi da để diệt vi sinh vật hay ức chế tăng trưởng chúng mà không gây hại mô sống Chất tẩy uế (disinfectant): tác nhân hóa học dùng diệt trùng đồ vật Hầu hết chất tẩy uế không diệt nha bào Chất làm (sanitizer): tác nhân hóa học đặc biệt dùng rửa dụng cụ nhà bếp để làm giảm số lượng vi khuẩn cho đáp ứng tiêu chuẩn y tế cơng cộng Q trình làm đơn giản đề cập đến việc rửa thật kỹ với xà phòng hay chất tẩy Chất kìm khuẩn (bacteriostatic agent): tác nhân ức chế tăng trưởng vi khuẩn Chất diệt mầm bệnh (germicide): tác nhân giết vi sinh vật nhanh chóng; có chất giết số vi sinh vật ức chế tăng trưởng số vi sinh vật khác Chất diệt khuẩn (bactericide): tác nhân giết vi khuẩn Hầu hết không giết nha bào Chất diệt virus (viricide): tác nhân bất hoạt virus Chất diệt vi nấm (fungicide): tác nhân giết vi nấm Chất diệt nha bào (sporocide): tác nhân giết nha bào vi khuẩn bào tử vi nấm II TÁC ĐỘNG BẤT LỢI CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG LÊN VI SINH VẬT Các yếu tố môi trường tác động tăng trưởng vi sinh vật gồm loại: vật lý, hóa học, sinh học Qui luật tác động: Về mặt tử suất, vi sinh vật bị xử lý tác nhân kháng trùng tuân theo qui luật làm giảm thiểu số lượng chúng yếu tố tự nhiên Quan sát ảnh hưởng nhiệt, nhiệt độ đó, 20% dân số vi khuẩn chết phút có 20% dân số sống sót chết vào phút thứ nhì Chúng ta rút qui luật thứ “Một tỉ lệ định vi sinh vật chết khoảng thời gian định” Tổng số vi sinh vật diện lúc bắt đầu việc tẩy uế có ảnh hưởng đến thời gian cần thiết để loại bỏ chúng Qui luật thứ nhì “Số lƣợng vi sinh vật ít, thời gian cần thiết để đạt tính vơ trùng ngắn” Vận dụng qui luật này, thường phải rửa đồ vật trước đưa tiệt trùng Những tác nhân kháng trùng ảnh hưởng cách khác biệt loài vi sinh vật khác Hơn nữa, ảnh hưởng khác biệt giai đoạn tăng trưởng khác loài vi sinh vật Giai đoạn nhạy cảm hầu hết vi sinh vật thời kỳ tăng trưởng lũy thừa Từ thực tế này, xác định qui luật thứ ba “Vi sinh vật nhạy cảm khác yếu tố kiểm soát tăng trƣởng chúng” 23 Cơ chế tác động: Tác động bất lợi yếu tố môi trường thường gây tổn hại cấu trúc quan trọng cho sống tế bào, dẫn đến phá hủy chức hoạt động làm cho tế bào chết Chỉ tế bào vi sinh vật thay đổi sinh lý hay di truyền để thích nghi sống sót Các tác hại thể sau: 1/ Phá hủy thành tế bào 2/ Thay đổi tính thấm màng tế bào 3/ Thay đổi tính keo nguyên sinh chất (biến tính protein) 4/ Kìm hãm hoạt tính enzyme 5/ Phá hủy trình sinh tổng hợp III CÁC PHƢƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG Các phƣơng pháp hóa học: Hóa chất tiệt trùng thơng thường ethylene oxide, dùng dạng khí để tiệt trùng đồ vật dễ bị hủy nhiệt Formol hydrogen peroxide dùng tiệt trùng màng lọc khơng khí tủ an toàn sinh học Gluteraldehyde, diệt nha bào vòng 3-10 giờ, dùng cho y cụ dụng cụ nội soi khơng ăn mịn thấu kính, kim loại, hay cao su Peracetic acid, hiệu chất hữu cơ, dùng tiệt trùng bề mặt dụng cụ phẫu thuật Việc sử dụng gluteraldehyde hay peracetic acid gọi trình tiệt trùng lạnh Chúng giết vi sinh vật cách làm biến tính protein acid nucleic Chúng diệt tất vi sinh vật nha bào Nhóm hóa chất dùng để tiệt trùng dụng cụ không chịu nhiệt Sau tiệt trùng, cần loại bỏ cho hết hóa chất trước sử dụng Các phƣơng pháp vật lý: Gồm: thiêu đốt, nhiệt ẩm, nhiệt khơ, lọc, xạ ion hóa (gamma) Sức nóng khơng tác nhân diệt trùng phổ biến hiệu mà r tiền dễ kiểm sốt Sức nóng diệt trùng cách làm biến tính enzyme vi sinh vật Khi sử dụng phương tiện phải lưu ý đến nhiệt độ thấp thời gian tối thiểu giết tất vi sinh vật Trong kỹ nghệ đóng hộp người ta cịn tính giá trị D tức số phút mà 90% dân số vi khuẩn bị giết chết nhiệt độ cho sẵn -Thiêu đốt biện pháp thường dùng để xử lý chất thải nhiễm trùng Vật liệu nguy hiểm bị thiêu thành tro nhiệt độ 870-980oC Tuy nhiên hạn chế biện pháp diện kim loại nặng tro khí độc thải Hình 1: Lò hấp ướt -Nhiệt ẩm (hơi nước áp suất) dùng tiệt trùng rác nguy hiểm đồ vật chịu nhiệt Dụng cụ phương pháp lò hấp ướt (Hình 1) Hơi nước bão hịa áp suất atmosphere, tức 15 psi (pounds per square inch) khiến cho enzymee protein cấu trúc bị biến tính khơng hồi phục Mơi trường cấy, chất lỏng, dụng cụ thường hấp 15-20 phút 1210C (2500F) Chất thải nhiễm trùng hấp 1320C (2700F) 30 - 60 phút Nhiệt ẩm phương pháp vật lý tiệt trùng đơn giản nhanh -Trong đó, sức nóng khơ giết vi sinh vật tác dụng oxid hóa Sức nóng khơ cần thời gian tiếp xúc lâu (1 rưỡi-2 giờ) nhiệt độ cao (160-1800C) Lị sấy dùng cho mục đích để tiệt trùng thủy tinh, chất dầu, bột 24 Hình 2: Màng lọc -Lọc tiệt trùng dùng cho dung dịch kháng sinh, hóa chất độc, chất đồng vị phóng xạ, vaccine carbohydrate vốn khơng bền với nhiệt Chất lỏng lọc qua màng cellulose acetate hay cellulose nitrate với máy hút chân khơng (Hình 2) Khơng khí lọc màng lọc tiểu hạt khơng khí cơng suất cao (HEPA = high-efficiencyparticulate-air) thiết kế để loại bỏ vật thể lớn 0,3 m khỏi phòng bệnh cách ly, phịng mổ tủ an tồn sinh học (Hình 3) Hình 3: Tủ an tồn sinh học cấp -Bức xạ tác động khác phụ thuộc vào độ dài sóng, cường độ thời gian Bức xạ ion hóa dùng cho thiết bị vi sóng phóng xạ tia gamma ngắn giàu lượng, làm ion hóa nước tạo gốc hydroxyl tác dụng lên thành phần hữu tế bào DNA khiến tế bào chết Chúng tiệt trùng vật dụng lần ống tiêm nhựa, ống thông, găng trước đưa vào sử dụng IV CÁC PHƢƠNG PHÁP TẨY UẾ Các phƣơng pháp hóa học: Hóa chất dùng để hủy diệt dạng sống gọi hóa chất tiệt trùng (chemical sterilants) dùng thời hạn ngắn chất tẩy uế Chất tẩy uế sử dụng cho mô sống (da) gọi chất sát trùng Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng chất tẩy uế như: - Loại vi sinh vật số lượng chúng - Nhiệt độ pH - Nồng độ hóa chất - Lượng chất hữu diện (máu, mủ, nhày) - Bề mặt chất cần tẩy uế - Thời gian tác động 25 - Loại nước cung cấp (cứng hay mềm) Những hóa chất tẩy uế khử trùng cách làm thay đổi tính thấm màng tế bào vi khuẩn làm hoạt tính enzymee thiết yếu cho sống vi sinh vật Chúng diệt vi khuẩn dạng dinh dưỡng đa số virus không diệt hết nha bào Chúng ta dùng hóa chất để tẩy uế giường bệnh, tường, nhà, chăn mền, quần áo; sát trùng da, khử trùng nước Những chất tẩy uế thơng dụng gồm có: - Chất cồn: ethanol isopropanol không diệt nha bào bay nhanh Do đó, chúng dùng làm chất sát trùng da tốt nồng độ 70% hay dùng chất tẩy uế nhiệt kế nút cao su lọ thuốc tiêm - Aldehyde: formaldehyde, gluteraldehyde Chúng khơng thường dùng làm chất tẩy uế bề mặt chúng gây kích thích khó chịu - Halogen: đặc biệt chlorine iodine Nước uống, nước hồ bơi, nước cống tẩy uế dung dịch chlorine Chlorine dùng dạng sodium hypochlorite (NaOCl, thuốc tẩy); khuyến cáo lau chùi mặt bàn vấy máu với nồng độ 1:10 Iodine pha thành phức hợp với cồn hay với polymer trung tính povidone dùng làm chất sát trùng da trước lấy máu hay phẫu thuật - Kim loại nặng: nitrat bạc dùng nhỏ mắt tr sơ sinh phòng ngừa nhiễm lậu cầu Riêng kim loại nặng chứa thủy ngân khơng cịn dùng độc tính thủy ngân mơi trường - Phức hợp nhơm hóa trị dùng tẩy uế bàn làm việc hay bề mặt khác phịng thí nghiệm - Tuy nhiên, chất hữu cơ, máu, bất hoạt kim loại nặng hay phức hợp nhơm hóa trị nên hạn chế tính chúng - Ozone dùng xử lý nước uống số dụng cụ y tế - Cuối cùng, dung dịch phenol, dẫn xuất carbolic acid, chất tẩy uế thơng dụng phịng thí nghiệm Thêm chất tẩy (detergent) vào dung dịch, sản phẩm vừa dùng lau rửa vừa tẩy uế nồng độ 2-5% Các phƣơng pháp vật lý: Ba phương pháp tẩy uế vật lý là: - Đun sôi 1000C 15 phút, tiêu diệt vi khuẩn dạng dinh dưỡng - Thanh trùng theo phương pháp Pasteur: đun nóng đến 630C 30 phút 720C 15 giây để diệt vi sinh vật gây nhiễm thực phẩm mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng, mùi vị Ngày sữa tiệt trùng cách ngược lại, sử dụng nhiệt độ thật cao (UHT) thời gian thật ngắn (ví dụ 1400C giây) - Dùng xạ khơng ion hóa tia cực tím Tia cực tím có độ dài sóng dài lượng thấp, làm hư hại DNA cách tạo cầu nối thymin cạnh Chúng không xuyên thấu tốt vi sinh vật cần phải cho tiếp xúc trực tiếp bề mặt Tia cực tím để tiệt trùng khơng khí, phịng mổ, chế phẩm y tế nước uống (Hình 4) 26 Hình 4: Vùng xạ BÀI 6: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN Theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất chế phẩm nhà trường mua TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Kỹ thuật thực tập vi sinh - khoa Y, Đại học Y Dược TpHCM 2/ Textbook of diagnostic microbiology, 4th ed., 2013 Eds: Connie R Mahon et al., Saunders Elsevier, U.S.A 27 ... mặt bàn thực tập Rửa tay nước xà phòng  Sinh vi? ?n phải đọc kỹ thực tập trước buổi thực tập để khỏi thu kết tốt  Vắng buổi thực tập sinh vi? ?n không thi cuối khóa PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH SỬ... người quản lý lab điều phối vi? ?n - Khơng tự ý chuyển nhóm học, có vi? ??c bận cần chuyển nhóm với sinh vi? ?n khác để tránh tải sinh vi? ?n – dụng cụ  Khi đến thực tập, sinh vi? ?n chịu trách nhiệm dụng... vi sinh vật nhanh chóng; có chất giết số vi sinh vật ức chế tăng trưởng số vi sinh vật khác Chất diệt khuẩn (bactericide): tác nhân giết vi khuẩn Hầu hết không giết nha bào Chất diệt virus (viricide):