Lần đầu tiên, thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không (Piper betel L.) thu hái tại tỉnh An Giang được khảo sát. Tinh dầu lá trầu không được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệu suất 0,4%. Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá trầu không được xác định là Eugenol và 3-Allyl-6-methoxyphenol với hàm lượng 12,36%.
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG (PIPER BETEL L.) VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Phan Hồi Phong*, Huỳnh Chí Hiếu, Nguyễn Tuấn Anh Trường Đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh * Tác giả liên lạc: phanphong5695@yahoo.com TĨM TẮT Lần đầu tiên, thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Trầu không (Piper betel L.) thu hái tỉnh An Giang khảo sát Tinh dầu trầu không ly trích thành cơng phương pháp chưng cất lôi nước đạt hiệu suất 0,4% Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS), thành phần hóa học tinh dầu trầu không xác định Eugenol 3-Allyl-6-methoxyphenol với hàm lượng 12,36% Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu đánh giá phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ nhạy cảm kháng sinh (MIC) Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật cho thấy tinh dầu Trầu khơng có khả ức chế tăng trưởng chủng vi sinh vật: B subtillis, E, coli, Salmonella Staphylococcus aureus với giá trị MIC trung gian (I), kháng (R) nhạy cảm (S) Từ khóa: Tinh dầu trầu không, Piper betel L., chưng cất lôi nước, GC – MS, hoạt tính kháng khuẩn STUDY EFFECTS OF EXTRACTING ESSENTIAL OIL FROM LEAF OF BETEL (PIPER BETEL L.) AND ANTI-MICROBIAL ACTIVITY Phan Hoai Phong*, Huynh Chi Hieu, Nguyen Tuan Anh Ho Chi Minh City University of Technology *Corresponding authour: phanphong5695@yahoo.com ABSTRACT Chemical composition and anti-microbial activity of essential oil from leaves of Piper betel L collected from An Giang province has been investigated Highest yield of oil (0.4%) of P betel L leaves was successfully extracted by steam distillation By using gas chromatography – mass spectrometry analysis (GC – MS), we have confirmed that the main component of P betel L essential oil is Eugenol and 3-Allyl-6-methoxyphenol, with content up to 12,36% The in vitro anti – microbial activity was evaluated by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) method The results showed that the essential oil from betel leaves inhibited the growth of microorganisms species: B subtillis, E, coli, Salmonella and Staphilococcus aureus with the MIC values of intermediate (I), resistant (R), susceptible (S), respectively Keywords: Betel oil, Piper betel L., antimicrobial activity TỔNG QUAN Trong trình nghiên cứu kháng sinh thực vật, người ta đặt biệt quan tâm đến tinh dầu Tinh dầu có nhiều đặc tính dược học, có khả kháng khuẩn, kháng nấm Việc nghiên cứu tách chiết tinh dầu hợp chất ngồi tinh dầu có dược tính cao đồng thời thử hoạt tính sinh học tinh dầu trầu khơng việc làm cần thiết góp phần vào việc đánh giá hiệu áp dụng hợp chất thiên nhiên lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Và đặc biệt khả kháng vi khuẩn đường ruột tinh dầu trầu khơng ứng dụng việc bảo quản thực phẩm, tiềm to lớn để sản xuất thuốc kháng sinh từ tinh dầu trầu không Việc thay thuốc kháng sinh tổng hợp truyền thống kháng sinh từ thực vật tinh dầu trầu không làm tăng giá trị kinh tế trầu không khu vực miền nam nói riêng Việt Nam nói chung, góp phần vào phát triển cộng nghiệp thực phẩm, y dược hóa học mỹ phẩm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 178 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Lá trầu không (Piper betle L.) thu mua xã vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy Long Kiến, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang Từ đó, xác định hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu đường kính vịng kháng Phương pháp Phương pháp chưng cất lôi tinh dầu khuẩn (mm) nước dựa nguyên lý Phương pháp tính tốn q trình chưng cất hỗn hợp khơng tan Kết đường kính vịng vơ khuẩn thu lẫn vào nước tinh dầu Khi hỗn qua lần thí nghiệm lặp lại tính trung bình hợp gia nhiệt, hai chất bay Mức độ nhạy cảm vi khuẩn với dịch Nếu áp suất nước cộng với áp chiết phân loại dựa theo đường kính suất tinh dầu với áp suất mơi trường vịng vơ khuẩn (Celikel Kavas, 2008): hỗn hợp sơi tinh dầu lấy - Đường kính vịng vơ khuẩn < mm: vơi nước không nhạy Xác định thành phần hoá học tinh dầu - Đường kính vịng vơ khuẩn từ – 14 mm: Thành phần hố học tinh dầu trầu khơng nhạy xác định phương pháp sắc ký - Đường kính vịng vơ khuẩn 15 – 19 mm: ghép khối phổ GC – MS nhạy Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng - Đường kính vịng vơ khuẩn > 20 mm: cực nhạy khuẩn Các hợp chất kháng khuẩn có tinh dầu khuếch tán vào môi trường thạch KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN tác động lên vi sinh vật thị Nếu tinh Kết dầu có khả tiêu diệt vi khuẩn xuất Bảng Các yếu tố tối ưu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước Tác động học Lá già Xay nhuyễn Hàm lượng tinh dầu thu (%) Nguyên liệu Thời gian chưng cất Lượng nước Khối lượng mẫu Nồng độ muối 500 ml 200 g 10% Thời gian ngâm V tinh dầu thu (ml) Hàm lượng tinh dầu (%) 30 phút 0,800 0,400 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly tinh dầu trầu khơng phương pháp chưng cất lơi nước Hình Đồ thị yếu tố tối ưu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 179 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Định lượng định tính tinh dầu trầu khơng Bảng Định lượng định tính tinh dầu trầu khơng Chỉ số hóa học, vật lý Kết trung bình Hàm lượng tinh dầu 0,4% Tỷ trọng trầu không 0,959 6,919 Chỉ số acid Chỉ số savon hóa 15,895 Chỉ số ester hóa 8,976 Tỷ lệ tinh dầu:cồn tuyệt đối 1:10,5 o Tỷ lệ tinh dầu:cồn 90 1:16,7 Chỉ số ethanol Tỷ lệ tinh dầu:cồn 80o 1:25,2 o Tỷ lệ tinh dầu:cồn 70 1:44,3 Kết xác định thành phần hoá học tinh xác định phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS dầu Thành phần hoá học tinh dầu trầu khơng Hình Kết phân tích thành phần hàm lượng tương đối hợp chất mẫu tinh dầu trầu không phương pháp GC – MS 180 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Từ kết GC – MS cho thấy thành phần phenol nên tinh dầu có nhiệt độ sơi, tỷ hố học tinh dầu trầu khơng khu trọng chiết suất cao Các dẫn xuất phenol vực An Giang hợp chất thuộc nhóm có mặt tinh dầu có tác dụng sinh terpene (4-terpineol, γ-muurolene, δ- học tốt tác dụng kháng khuẩn, kháng cadinene, tau.- muurolol, α-cadinol) nấm, chống oxy hóa, độc tính tế bào, (Roy hợp chất dẫn xuất phenol and Vijayalaxmi, 2013, Bhanu P.et al., phenol, hỗn hợp eugenol, 3-Allul-6- 2010) methoxyphenol, 3-Allyl-6-methoxyphenyl Hoạt tính kháng Salmonella tinh dầu acetat Tổng hàm lượng tất cấu tử trầu không thu phương pháp chiếm gần 90% lượng tinh dầu ly trích chưng cất lơi nước Trong đó, hỗn hợp Eugenol, 3-allul-6- Kết hoạt tính kháng Salmonella tinh methoxyphenol lượng nhỏ α.-Copaene dầu trầu bảng chiếm hàm lượng cao (12,36%) Có thể qua đường kính vùng ức chế (bao gồm thấy cấu tử chiếm hàm lượng cao đường kính đĩa kháng khuẩn, mm) tinh dầu dẫn xuất Bảng Kết kháng Salmonella tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước Độ pha lỗng tinh dầu Đường kính vịng kháng Nghiệm thức trầu không khuẩn (mm) Kháng sinh Ampicillin A0 38 (ĐC) A1 Nguyên chất 20,000a A2 10-1 16,667a,b -2 A3 10 14,667b,c A4 10-3 12,667c A5 10-4 8,667d *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus aureus tinh dầu trầu tinh dầu trầu không thu bảng qua đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính đĩa giấy kháng sinh, phương pháp chưng cất lôi nước Kết hoạt tính kháng Staphylococcus mm) Bảng Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước Độ pha lỗng tinh dầu Đường kính vịng kháng Nghiệm thức trầu khơng khuẩn (mm) A0 A1 A2 A3 A4 A5 Kháng sinh Ampicillin (ĐC) Nguyên chất 10-1 10-2 10-3 10-4 29 30,000a 24,667b 19,333c 14,667d 7,333e *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 Hoạt tính kháng E.coli tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lơi nước Kết hoạt tính kháng E.coli tinh dầu trầu bảng qua đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính đĩa giấy kháng sinh, mm) 181 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Bảng Kết kháng E.coli tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước Độ pha lỗng tinh dầu Đường kính vịng kháng Nghiệm thức trầu không khuẩn (mm) Kháng sinh Ampicillin A0 25 (ĐC) A1 Nguyên chất 20,667a -1 A2 10 16,000b -2 A3 10 9,000c A4 10-3 7,000c A5 10-4 7,000c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 Hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis tinh dầu trầu bảng tinh dầu trầu không thu qua đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính đĩa giấy kháng sinh, mm) phương pháp chưng cất lơi nước Kết hoạt tính kháng Bacillus subtilis Bảng Kết kháng Bacillus subtilis tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lơi nước Độ pha lỗng tinh dầu Đường kính vịng kháng Nghiệm thức trầu khơng khuẩn (mm) Kháng sinh Ampicillin A0 18 (ĐC) A1 Nguyên chất 27,000a -1 A2 10 23,333b A3 10-2 20,333b A4 10-3 8,667c -4 A5 10 8,667c *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 Thảo luận Kết khảo sát chủng vi khuẩn cho thấy tinh dầu trầu khơng có khả ức chế vi khuẩn gram âm gram dương, đặc biệt chủng vi khuẩn vi khuẩn điển hình hệ vi sinh vật đường ruột Tinh dầu trầu không cho kết kháng tốt với tất loại vi khuẩn thí nghiệm Trong loại vi khuẩn tinh dầu trầu không kháng mạnh Staphylococcus aureus, kháng yếu E.coli So sánh với kết kháng khuẩn tinh dầu lốt (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014) kết kháng khuẩn tinh dầu trầu Hóc Mơn tác giả Huỳnh Kỳ Trân (2017) tinh dầu trầu khơng thực nghiệm có khả kháng mạnh nhạy nhiều so với tinh dầu lốt tinh dầu trầu khơng Hóc Mơn Đây sở thiết thực cho việc nghiên cứu áp dụng tinh dầu trầu không làm hương liệu ngành công nghiệp thực phẩm dược phẩm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Từ trình nghiên cứu ta thu thơng số kỹ thuật cho q trình chưng cất lơi nước quy mơ phịng thí nghiệm: Nguyên liệu: trầu già xay nhuyễn phút Tỷ lệ rắn/lỏng 1:2,5 Nồng độ nước muối: 10% Thời gian ngâm nước muối: 30 phút Thời gian chưng cất: 120 phút kể từ giọt tinh dầu ngưng tụ rơi xuống Tinh dầu trầu không thu có màu vàng nhạt, nhẹ nước, có mùi thơm đặc trưng, vị cay nồng Đã xác định số vật lý hóa học tinh dầu trầu không sau: Hàm lượng tinh dầu: 0,4% Tỷ trọng tinh dầu trầu không: 0,959 Chỉ số acid: 6,919 Chỉ số savon hóa: 15,895 Chỉ số ester hóa: 8,976 182 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Chỉ số ethanol: Tỷ lệ tinh dầu: cồn tuyệt đối = 1:10,5 Tỷ lệ tinh dầu: cồn 90o = 1:16,7 Tỷ lệ tinh dầu: cồn 80o = 1:25,2 Tỷ lệ tinh dầu: cồn 70o = 1:44,3 Thành phần tinh dầu trầu khơng: hỗn hợp Eugenol, 3-Allyl-6-methoxyphenol lượng nhỏ α.-Copaene (12,36%), α.Cadinol (10,97%), 3-Allyl-6-methoxyphenyl acetate (9,68%) Kết khảo sát loại vi khuẩn: Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli, Bacillus subtilis cho thấy tinh dầu trầu khơng có khả ức chế loại vi khuẩn gram (+), gram (-) Trong loại vi khuẩn tinh dầu trầu Kỷ yếu khoa học không kháng khuẩn mạnh Staphylococcus aureus, kháng khuẩn yếu E.coli Cần khảo sát thêm nhiệt độ chưng cất tinh dầu trầu không Khảo sát khả kháng tinh dầu trầu không số loại vi nấm virus khác (như virus Zika, ) Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng để xác định thành phần chất có thân rễ hoa trầu, so sánh với thành phần chất có trầu Từ lựa chọn nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ ngành thực phẩm y dược TÀI LIỆU THAM KHẢO BHANU, P., RAVINDRA, S., PRIYANKA, S., ASHOK, K., PRASHANT, K.M AND NAWA, K.D., 2010 Efficacy of chemically characterized Piper betle L essential oil against fungal and aflatoxin contamination of some edible commodities and its antioxidant activity International Journal of Food Microbiology 142: 114–119 CELIKEL VÀ KAVAS (2008) Antimicrobial properties of some essential oils against some pathogenic microorganisms Czech J Food Sci, 26: 174 – 181 MENON, A N, PADMAKUMARI, K P, JAYALEKSHMY, A (2003), “Essential Oil Composition of Four Major Cultivars of Black Pepper (Piper nigrum L.) III”, Journal Of Essential Oil Research, 15(3), pp 155 – 157 MARCO B.A, 2007 Synthesis and Characterization of Glycosides Springer, Mexico NASCIMENTO D J C., PAULA D V F., DAVID J M., DAVID J P 2012 GUTIERREZ R M., GONZALEZ A M., HOYO-VADILLO C 2013 Alkaloids from Piper: A review of its phytochemistry and pharmacology, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 13, pp 163-193 PARMAR V S., JAIN S C., BISHT K S 1996 Phytochemistry of the genus Piper, Phytochemisrry, vol 46 (4), pp 591-673 RAWAT, A.K.S., TRIPATHL, R.D KHAN, A.J AND BALASUBRAHMANYAM, V.R., 1989 Essential Oil Components as Markers for Identification of Piper betle L Cultivars Biochemical Systematics and Ecology 17(1): 35-38 ROY, U.B AND VIJAYALAXMI, K.K., 2013 Evaluation of Cytotoxic Activity of Piper betle Linn Using Murine and Human Cell Lines InVitro International Journal of Scientific & Engineering Research 4(9): 221–233 SILVA NCC, FERNANDES JÚNIOR A Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity J Venom Anim Toxins incl Trop Dis vol.16 no.3 Botucatu 2010 183 ... khuẩn tinh dầu trầu Kỷ yếu khoa học không kháng khuẩn mạnh Staphylococcus aureus, kháng khuẩn yếu E.coli Cần khảo sát thêm nhiệt độ chưng cất tinh dầu trầu không Khảo sát khả kháng tinh dầu trầu. .. gian ngâm V tinh dầu thu (ml) Hàm lượng tinh dầu (%) 30 phút 0,800 0,400 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly tinh dầu trầu không phương... với tinh dầu lốt tinh dầu trầu khơng Hóc Mơn Đây sở thiết thực cho việc nghiên cứu áp dụng tinh dầu trầu không làm hương liệu ngành công nghiệp thực phẩm dược phẩm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Từ trình nghiên