XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HIẾU KHÍ HOÀN TOÀN CÁC VẬT LIỆU NHỰATRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC - PHƯƠNG PHÁP ĐO NHU CẦU OXY TRONG THIẾT BỊ ĐO TIÊUHAO OXY KHÉP KÍN

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11318:2016 ISO 14851:1999 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HIẾU KHÍ HỒN TỒN CÁC VẬT LIỆU NHỰA TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC - PHƯƠNG PHÁP ĐO NHU CẦU OXY TRONG THIẾT BỊ ĐO TIÊU HAO OXY KHÉP KÍN Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium Method by measuring the oxygen demand in a closed respirometer Lời nói đầu TCVN 11318:2016 hoàn toàn tương đương với ISO 14851:1999 đính kỹ thuật 1:2005 TCVN 11318:2016 Tổng cục Môi trường biên soạn, Bộ Tài nguyên Môi trường đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Do việc sử dụng chất dẻo ngày gia tăng, dẫn đến việc thu hồi thải bỏ vật liệu trở thành vấn đề lớn Vì ưu tiên hàng đầu nên việc thu hồi cần phải đẩy mạnh, nhiên thu hồi hoàn tồn chất dẻo việc khó khăn Ví dụ, rác chất dẻo chủ yếu từ hàng hóa tiêu dùng khó để thu hồi hồn tồn Các ví dụ khác chất dẻo khó thu hồi lưới đánh cá, màng phủ nông nghiệp polyme tan nước Các vật liệu chất dẻo có xu hướng bị rị rỉ khỏi hệ thống xử lý nước khép kín vào mơi trường Hiện nay, chất dẻo có khả phân hủy sinh học lên lựa chọn mà có khả giải vấn đề môi trường Vật liệu chất dẻo sản phẩm bao gói đưa đến khu xử lý tạo compost có khả phân hủy sinh học tiềm ẩn Bởi vậy, việc xác định khả phân hủy sinh học tiềm ẩn vật liệu quan trọng đưa dẫn khả phân hủy sinh học môi trường tự nhiên XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HIẾU KHÍ HỒN TỒN CÁC VẬT LIỆU NHỰA TRONG MƠI TRƯỜNG NƯỚC - PHƯƠNG PHÁP ĐO NHU CẦU OXY Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium - Method by measuring the oxygen demand in a closed respirometer CẢNH BÁO Trong nước thải, bùn hoạt hóa, đất compost tồn sinh vật gây bệnh, cần có biện pháp đề phịng thích hợp, xử lý chất Nên cẩn thận với chất thử có độc tính chất chưa biết rõ tính chất Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định mức độ phân hủy sinh học hiếu khí vật liệu chất dẻo, bao gồm vật liệu có chứa phụ gia, cách đo nhu cầu oxy hơ hấp kế kín Vật liệu thử cho tiếp xúc môi trường nước điều kiện thử nghiệm với vật liệu cấy lấy từ bùn hoạt hóa, compost đất Nếu sử dụng bùn hoạt hóa khơng thích ứng làm vật liệu cấy phép thử mơ q trình phân hủy sinh học xảy môi trường nước tự nhiên; sử dụng vật liệu cấy cho tiếp xúc trước trộn sẵn sử dụng phương pháp để kiểm tra khả phân hủy sinh học tiềm ẩn vật liệu thử Các điều kiện sử dụng tiêu chuẩn không cần thiết phải giống với điều kiện tối ưu để trình phân hủy sinh học tối đa xảy ra, tiêu chuẩn xây dựng để xác định khả phân hủy sinh học tiềm ẩn vật liệu chất dẻo đưa dẫn khả phân hủy sinh học vật liệu môi trường tự nhiên Phương pháp giúp cho việc đánh giá khả phân hủy sinh học cải thiện cách tính tốn cân cacbon (tùy chọn, xem phụ lục E) Phương pháp áp dụng cho vật liệu sau: - Polyme tổng hợp và/hoặc tự nhiên, polyme đồng trùng hợp (copolyme) hỗn hợp hai; - Vật liệu chất dẻo có phụ gia chất hóa dẻo, chất màu hợp chất khác; - Polyme tan nước; - Vật liệu mà điều kiện phép thử khơng ức chế vi sinh vật có vật liệu cấy Có thể xác định ảnh hưởng ức chế cách sử dụng phương pháp kiểm soát ức chế phương pháp thích hợp khác (ví dụ xem ISO 8192[3]) Nếu vật liệu thử ức chế vi sinh vật vật liệu cấy sử dụng loại vật liệu cấy khác sử dụng vật liệu cấy phơi nhiễm trước với nồng độ thử thấp Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6634:2000 (ISO 8245:1999), Chất lượng nước - Hướng dẫn xác định cacbon hữu tổng số (TOC) cacbon hữu hòa tan (DOC) TCVN 6827:2001 (ISO 9408:1999), Chất lượng nước - Đánh giá phân hủy sinh học hiếu khí hồn tồn hợp chất hữu mơi trường nước cách xác định nhu cầu oxy máy đo hơ hấp kín TCVN 6981:2001 (ISO 10634:1995), Chất lượng nước - Hướng dẫn chuẩn bị xử lý hợp chất hữu tan nước để đánh giá phân hủy sinh học môi trường nước ISO/TR 15462:1997, Water quality - Selection of tests for biodegradability (Chất lượng nước - Lựa chọn phép thử phân hủy sinh học) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau 3.1 Phân hủy sinh học hiếu khí hồn toàn (ultimate aerobic biodegradation) Phân hủy hợp chất hữu vi sinh vật có mặt oxy, tạo thành cacbon dioxit, nước muối khoáng nguyên tố có mặt (q trình khống hóa) cộng với sinh khối 3.2 Bùn hoạt hóa (activated sludge) Sinh khối tạo thành trình xử lý hiếu khí nước thải phát triển vi khuẩn vi sinh vật khác có mặt oxy hòa tan 3.3 Hàm lượng chất rắn lơ lửng bùn hoạt tính (concentration of suspended solids in an activated sludge) Lượng chất rắn thu cách lọc ly tâm thể tích bùn hoạt hóa biết sấy khô khoảng 105 °C đến khối lượng khơng đổi 3.4 Nhu cầu oxy sinh hóa (biochemical oxygen demand) BOD Nồng độ khối lượng oxy hòa tan bị tiêu tốn điều kiện xác định trình oxy hóa sinh học hiếu khí hợp chất hóa học chất hữu nước, biểu thị miligam oxy tiêu tốn miligam gam hợp chất thử 3.5 Nhu cầu oxy lý thuyết (theoretical oxygen demand) ThOD Lượng oxy lý thuyết tối đa cần để oxy hóa hồn tồn hợp chất hóa học, tính theo cơng thức phân tử, biểu thị miligam oxy tiêu tốn miligam gam hợp chất thử 3.6 Tổng số Cacbon hữu (total organic carbon) TOC Tất cacbon có hợp chất hữu cơ, hòa tan lơ lửng nước 3.7 Cacbon hữu hòa tan (dissolved organic carbon) DOC Phần cacbon hữu nước mà loại bỏ q trình phân tách pha quy định, ví dụ cách ly tâm 15 40.000 m.s -2 cách lọc qua màng lọc có đường kính lỗ từ 0,2 μm đến 0,45 μm 3.8 Giai đoạn thích ứng (lag phase) Thời gian, tính ngày, từ bắt đầu phép thử đạt thích nghi và/hoặc chọn lọc thích nghi vi sinh vật phân hủy mức độ phân hủy sinh học hợp chất hóa học chất hữu đạt khoảng 10 % mức độ phân hủy sinh học tối đa 3.9 Mức phân hủy sinh học tối đa (maximum level of biodegradation) Mức độ phân hủy sinh học, tính phần trăm, hợp chất hóa học chất hữu phép thử mà mức khơng có phân hủy sinh học khơng cịn xảy thêm 3.10 Giai đoạn phân hủy sinh học (biodegradation phase) Thời gian, tính ngày, từ kết thúc giai đoạn thích ứng phép thử đạt khoảng 90 % mức phân hủy sinh học tối đa 3.11 Giai đoạn ổn định (plateau phase) Thời gian, tính ngày, từ kết thúc giai đoạn phân hủy sinh học kết thúc phép thử 3.12 Tiếp xúc trước (pre-exposure) Quá trình tiếp xúc trước vật liệu cấy với hợp chất hóa học chất hữu cần thử để tăng khả vật liệu cấy phân hủy sinh học vật liệu thử cách làm thích nghi và/hoặc chọn lọc vi sinh vật 3.13 Làm thích nghi trước (pre-conditioning) Quá trình tiếp xúc trước vật liệu cấy điều kiện phép thử sau khơng có mặt hợp chất hóa học chất hữu cần thử để cải thiện tính phép thử cách cho vi sinh vật thích nghi trước với điều kiện phép thử Nguyên tắc Khả phân hủy sinh học vật liệu chất dẻo xác định cách sử dụng vi sinh vật hiếu khí mơi trường nước Hỗn hợp thử gồm môi trường vô cơ, vật liệu thử hữu (nguồn cacbon lượng nhất) có nồng độ cacbon hữu từ 100 mg/l đến 2000 mg/l vật liệu cấy bùn hoạt hóa huyền phù đất hoạt tính compost Hỗn hợp khuấy trộn bình thử kín hơ hấp kế khoảng thời gian không tháng Lượng cacbon dioxit sinh hấp thụ chất hấp thụ thích hợp khoảng khơng bên bình thử Lượng oxy tiêu tốn (BOD) xác định cách đo lượng oxy cần thiết để trì thể tích khí khơng đổi bình thử máy đo hơ hấp cách đo tự động thủ công thay đổi thể tích áp suất (hoặc kết hợp hai) Ví dụ máy đo hơ hấp thích hợp nêu Phụ lục C Có thể sử dụng loại chai kín hai pha mơ tả ISO 10708[4] (xem Phụ lục D) Mức phân hủy sinh học, biểu thị phần trăm, xác định cách so sánh BOD với nhu cầu oxy lý thuyết (ThOD) Phải tính tới ảnh hưởng q trình nitrat hóa đến lượng BOD Kết thử mức phân hủy sinh học tối đa xác định từ giai đoạn ổn định đồ thị phân hủy sinh học Ngồi ra, tính tốn cân cacbon để cung cấp thơng tin bổ sung cho trình phân hủy sinh học (xem phụ lục E) Khác với TCVN 6827 (ISO 9408), sử dụng cho hợp chất hữu khác nhau, tiêu chuẩn sử dụng để xác định khả phân hủy sinh học vật liệu chất dẻo Các yêu cầu đặc biệt tác động đến việc lựa chọn vật liệu cấy môi trường thử có khả cải thiện đánh giá khả phân hủy sinh học thơng qua việc tính cân cacbon Mơi trường thử Q trình ủ phải thực bóng tối ánh sáng khuếch tán, khơng gian khép kín khơng chứa ức chế vi sinh vật trì nhiệt độ khơng đổi, tốt từ 20 °C đến 25 °C, dao động khoảng ± °C nhiệt độ thích hợp khác phụ thuộc vào vật liệu cấy sử dụng mơi trường cần đánh giá CHÚ THÍCH Đối với vật liệu cấy compost, sử dụng nhiệt độ cao phù hợp Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích 6.1 Nước cất nước khử ion, khơng có độc tố (được biệt đồng) có hàm lượng DOC nhỏ mg/l 6.2 Mơi trường thử Tùy thuộc vào mục đích phép thử, sử dụng mơi trường thử khác Ví dụ, mơ mơi trường tự nhiên sử dụng môi trường thử chuẩn (6.2.1) Nếu vật liệu thử sử dụng nồng độ cao sử dụng môi trường thử tối ưu (6.2.2) với lượng đệm nồng độ chất dinh dưỡng cao 6.2.1 Mơi trường thử chuẩn 6.2.1.1 Dung dịch A Hịa tan Kali dihydro photphat khan (KH2PO4) 8,5 g Dikali hydro photphat khan (K2HPO4) 21,75 g Dinatri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 33,4 g Amoni clorua (NH4CI) 0,5 g nước (6.1) cho thêm nước đến 000 ml CHÚ THÍCH Có thể kiểm tra thành phần xác dung dịch cách đo pH, giá trị phải 7,4 6.2.1.2 Dung dịch B Hòa tan 22,5 g magie sunphat heptahydrat (MgSO4.7H2O) nước (6.1) thêm nước đến 000 ml 6.2.1.3 Dung dịch C Hòa tan 36,4 g canxi clorua dihydrat (CaCI2.2H2O) nước (6.1) thêm nước đến 000 ml 6.2.1.4 Dung dịch D Hòa tan 0,25 g sắt (III) clorua hexahydrat (FeCI 3.6H2O) nước (6.1) thêm nước đến 000 ml Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng để tránh kết tủa, thêm giọt axit clohydric đậm đặc (HCI) giọt dung dịch nước etylendiamintetraaxetic axit 0,4 g/l (EDTA) 6.2.1.5 Chuẩn bị Để chuẩn bị lít mơi trường thử thêm vào khoảng 500 ml nước (6.1) - 10 ml dung dịch A; - ml dung dịch từ B đến D Cho thêm nước (6.1) đến 000 ml 6.2.2 Môi trường thử tối ưu Môi trường thử tạo đệm cao chứa nhiều chất dinh dưỡng vô Cần phải giữ pH không thay đổi hệ thống suốt trình thử nồng độ vật liệu thử cao Môi trường chứa khoảng 2400 mg/l photpho 50 mg/l nitơ thích hợp với vật liệu thử có nồng độ cao, lên đến 2000 mg/l cacbon hữu Nếu sử dụng vật liệu thử có nồng độ cao tăng hàm lượng nitơ lên để giữ tỷ lệ C:N khoảng 40:1 6.2.2.1 Dung dịch A Hòa tan Kali dihydro photphat khan (KH2PO4) 37,5 g Dinatri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 87,3 g Amoni clorua (NH4CI) 2,0 g nước (6.1) cho thêm nước đến 000 ml 6.2.2.2 Dung dịch B Hòa tan 22,5 g magle sunphat heptahydrat (MgSO4.7H2O) nước (6.1) thêm nước đến 000ml 6.2.2.3 Dung dịch C Hòa tan 36,4 g canxi clorua dihydrat (CaCI2.2H2O) nước (6.1) thêm nước đến 000 ml 6.2.2.4 Dung dịch D Hòa tan 0,25 g sắt (III) clorua hexahydrat (FeCI 3.6H2O) nước (6.1) thêm nước đến 000 ml 6.2.2.5 Dung dịch E (dung dịch vết nguyên tố, tùy chọn) Hòa tan 10 ml dung dịch nước HCl (25 %, 7,7 mol/l) theo thứ tự sau: 70 mg ZnCI2, 100 mg MnCI2.4H2O, mg H3BO3, 190 mg CoCI2.6H2O, mg CuCI2.2H2O, 240 mg NiCI2.6H2O, 36 mg Na2M2O4.2H2O, 33 mg Na2WO4.2H20 26 mg Na2SeO3.5H2O cho thêm nước đến 1000 ml (6.1) 6.2.2.6 Dung dịch F (dung dịch vitamin, tùy chọn) Hòa tan vào 100 ml nước (6.1) 0,6 mg biotin, 2,0 mg niaxinamin, 2,0 mg p-aminobenzoat, 1,0 mg axit pantotenic, 10,0 mg pyridoxal hydroclorua, 5,0 mg cyanocobalamin, 2,0 mg axit folic, 5,0 mg riboflavin, 5,0 mg DL-thioctic axit 1,0 mg thiamine dichlorid sử dụng dung dịch 15 mg chất chiết men 100 ml nước (6.1) Lọc dung dịch qua thiết bị lọc màng để khử trùng (xem 7.4) CHÚ THÍCH Dung dịch E F tùy chọn không yêu cầu sử dụng nồng độ vật liệu cấy vừa đủ, ví dụ bùn hoạt hóa, đất compost Nên chuẩn bị phần ml bảo quản lạnh sử dụng 6.2.2.7 Chuẩn bị Để chuẩn bị lít mơi trường thử thêm vào khoảng 800 ml nước (6.1) - 100 ml dung dịch A; - ml dung dịch từ B đến D, tùy chọn E F Cho thêm nước (6.1) đến 1000 ml đo pH CHÚ THÍCH Có thể kiểm tra thành phần xác dung dịch cách đo pH, giá trị phải 7,0 ± 0,2 6.3 Dung dịch pyrophotphat Hòa tan 2,66 g natri pyrophotphat khan (Na4P2O7) nước (6.1) cho thêm nước đến 000 ml 6.4 Chất hấp thụ cacbon dioxit, hạt xút chất hấp thụ khác thích hợp Thiết bị, dụng cụ Tất thiết bị thử phải đặc biệt vật liệu vơ độc tố Sử dụng thiết bị thí nghiệm thơng thường thiết bị, dụng cụ sau: 7.1 Hơ hấp kế kín, gồm bình thử (bình thủy tinh) có lắp cánh khuấy tất thiết bị cần thiết khác, đặt phịng kín có nhiệt độ khơng đổi thiết bị, dụng cụ ổn nhiệt (như bể cách thủy) Ví dụ xem Phụ lục C CHÚ THÍCH Bất kỳ máy đo hơ hấp có khả xác định nhu cầu oxy sinh hóa với độ xác thích hợp phù hợp, ưu tiên thiết bị tự động đo bổ sung oxy tiêu tốn, khơng làm thiếu hụt oxy không xảy ức chế hoạt động vi sinh vật suốt trình phân hủy Thay sử dụng máy đo hơ hấp thơng thường sử dụng loại chai kín hai pha (xem Phụ lục D) 7.2 Thiết bị phân tích xác định cacbon hữu tổng số (TOC) cacbon hữu hòa tan (DOC) [xem TCVN 6634 (ISO 8245)] 7.3 Thiết bị phân tích xác định nồng độ nitrat nitrit CHÚ THÍCH Nên tiến hành phép thử định tính trước để định có xảy q trình nitrat hóa Nếu có chứng nitrat/nitrit mơi trường cần phải xác định định lượng phương pháp thích hợp (ví dụ sắc ký ion) 7.4 Thiết bị ly tâm thiết bị có màng lọc (cỡ lỗ 0,45 μm) khơng hấp phụ giải phóng cacbon hữu 7.5 Cân phân tích (loại sử dụng phịng thí nghiệm) 7.6 Thiết bị đo pH (loại sử dụng phịng thí nghiệm) Cách tiến hành 8.1 Vật liệu thử Vật liệu thử phải vật liệu có khối lượng biết chứa lượng cacbon đủ để tạo lượng BOD mà xác định xác máy đo hơ hấp sử dụng Tính lượng ThOD theo cơng thức hóa học xác định kỹ thuật phân tích nguyên tố (xem Phụ lục A) tính lượng TOC [theo TCVN 6634 (ISO 8245)] sử dụng nồng độ vật liệu thử 100 mg/l, tương đương với lượng ThOD khoảng 170 mg/l lượng TOC khoảng 60 mg/l Chỉ sử dụng nồng độ thấp máy đo hơ hấp có độ nhạy phù hợp Lượng vật liệu thử tối đa bị giới hạn lượng oxy cung cấp cho máy đo hô hấp môi trường thử sử dụng Khi sử dụng môi trường thử tối ưu (6.2.2), nồng độ vật liệu thử phải mức cho lượng TOC không vượt 2000 mg/l, nghĩa tỷ lệ C:N khoảng 40:1 Nếu sử dụng nồng độ cao phải tăng lượng nitơ mơi trường thử CHÚ THÍCH Nếu mơ q trình phân hủy sinh học mơi trường tự nhiên nên sử dụng môi trường tiêu chuẩn nồng độ vật liệu thử 100 mg/l CHÚ THÍCH Nên ưu tiên sử dụng vật liệu thử dạng bột sử dụng vật liệu dạng màng, mảnh nhỏ hay hạt định hình Kích thước hình dạng vật liệu thử ảnh hưởng đến khả phân hủy sinh học chúng Nếu để so sánh loại vật liệu chất dẻo khác nên sử dụng vật liệu có hình dạng tương tự Nếu vật liệu thử có dạng bột phải sử dụng hạt nhỏ biết trước phân bố kích thước nên sử dụng phân bố kích thước hạt với đường kính tối đa 250 μm Tương tự vậy, kích thước thiết bị sử dụng phụ thuộc vào thể loại vật liệu thử Phải đảm bảo chắn khơng có thay đổi học không mong muốn xảy điều kiện phép thử, ví dụ cấu khuấy Việc gia công, chế biến vật liệu thử khơng có ảnh hưởng đáng kể đến phân hủy vật liệu (ví dụ trường hợp sử dụng vật liệu dạng bột hỗn hợp) Có thể xác định hàm lượng hydro, oxy, nitơ, photpho lưu huỳnh khối lượng phân tử vật liệu thử phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (ví dụ xem ASTM D 3536-91[1]) tiêu chuẩn khác thích hợp Ưu tiên thử nghiệm vật liệu chất dẻo khơng có phụ gia chất hóa dẻo Khi vật liệu chứa chất phụ gia cần phải có thơng tin khả phân hủy sinh học chất phụ gia để đánh giá khả phân hủy sinh học vật liệu polyme Để biết thêm thơng tin chi tiết cách xử lý hợp chất tan nước, xem TCVN 6918 (ISO 10634) 8.2 Vật liệu đối chứng Sử dụng anilin và/hoặc polyme có khả phân hủy sinh học tốt làm vật liệu đối chứng [ví dụ bột cellulose vi tinh thể, giấy lọc xenlulo khơng tàn poly (β-hydroxybutyrat)] Nếu có thể, thể loại kích thước, lượng TOC vật liệu đối chứng phải có khả so sánh với hình dạng kích thước lượng TOC vật liệu thử Có thể sử dụng polyme khơng phân hủy sinh học (ví dụ polyetylen) có thể loại với vật liệu thử làm vật liệu đối chứng âm 8.3 Chuẩn bị vật liệu cấy Bùn hoạt hóa từ trạm xử lý nước thải, xử lý chủ yếu nước thải sinh hoạt nguồn phù hợp để cung cấp vật liệu cấy Bùn lấy từ môi trường hiếu khí hoạt động có sẵn khắp vùng diện tích địa lý rộng lớn, nhiều loại vật liệu chất dẻo cần thử nghiệm Ngồi ra, sử dụng đất và/hoặc huyền phù compost cho trình cấy với số loại vật liệu chất dẻo hoạt động nấm đóng vai trị quan trọng q trình phân hủy sinh học Khi xác định trình phân hủy sinh học hệ thống xử lý chất thải cụ thể lấy vật liệu cấy từ mơi trường Vật liệu cấy chuẩn bị từ nguồn mô tả 8.3.1 8.3.2 từ hỗn hợp nguồn để thu quần thể vi sinh vật đa dạng đơng đúc, đủ để tác động đến q trình phân hủy sinh học Nếu q trình hơ hấp nội sinh vật liệu cấy lớn phải ổn định vật liệu cấy cách làm thống khí trước sử dụng Hài hòa nhiệt độ thử với vật liệu cấy sử dụng (xem thích Điều 5) CHÚ THÍCH Việc xác định đơn vị cụm khuẩn (cfu) vật liệu cấy sử dụng hữu ích Hỗn hợp thử nên chứa khoảng từ 103 đến 106 cfu/ml 8.3.1 Vật liệu cấy lấy từ trạm xử lý nước thải Lấy mẫu bùn hoạt hóa thu thập từ trạm xử lý nước thải vận hành khu thí nghiệm xử lý nước thải sinh hoạt Trộn giữ mẫu điều kiện hiếu khí tốt sử dụng ngày (tối thiểu 72 h) Trước sử dụng, xác định nồng độ chất rắn lơ lửng (ví dụ theo ISO 11923[5]) Nếu cần thiết, đặc bùn cách để lắng cho thể tích bùn thêm vào cho phép thử nhỏ Thêm lượng phù hợp để thu hàm lượng chất rắn lơ lửng hỗn hợp cuối từ 30 mg/l đến 1000mg/l CHÚ THÍCH Khi q trình phân hủy sinh học môi trường tự nhiên mô tiến hành xác định cân cacbon (xem Phụ lục E) nên sử dụng vật liệu cấy có hàm lượng chất rắn lơ lửng 30 mg/l Vì chất rắn cản trở việc xác định cân cacbon nên phải tuân theo quy trình chuẩn bị vật liệu cấy sau Lấy 500 ml bùn hoạt hóa làm đồng với độ trung bình bình trộn máy trộn phù hợp tốc độ cao Để hỗn hợp lắng chất lỏng phía chứa lượng không đáng kể chất lơ lửng không lâu 30 Gạn lượng chất lỏng phía cho vào bình thử để có nồng độ % (V/V) đến % (V/V) môi trường thử Tránh gạn hạt bùn CHÚ THÍCH Vật liệu cấy để làm thích nghi trước khơng sử dụng vật liệu cấy phơi nhiễm trước, trường hợp phép thử mơ đặc tính phân hủy sinh học môi trường tự nhiên Tùy vào mục đích phép thử, sử dụng vật liệu cấy phơi nhiễm trước miễn báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ điều (ví dụ phần trăm phân hủy sinh học = X %, sử dụng vật liệu cấy phơi nhiễm trước) phương pháp phơi nhiễm trước phải nêu chi tiết báo cáo thử nghiệm Vật liệu cấy phơi nhiễm trước lấy từ phép thử phân hủy sinh học phịng thí nghiệm phù hợp (xem ISO/TR 15462) thực điều kiện khác từ mẫu thử lấy từ địa điểm mà có điều kiện mơi trường tương đương (ví dụ khu vực bị nhiễm trạm xử lý chất thải công nghiệp) 8.3.2 Vật liệu cấy lấy từ đất và/hoặc compost Hòa 10 g đất màu mỡ compost lấy từ bãi compost xử lý chất thải hữu 100 ml môi trường thử (6.2.1 6.2.2) dung dịch pyrophotphat (6.3) mà thường sử dụng lĩnh vực vi sinh vật đất Để lắng dung dịch khoảng 30 Gạn lọc chất lỏng bên qua phễu lọc thô cho thêm vật liệu cấy vào bình thử để đạt nồng độ môi trường thử từ % (V/V) đến % (V/V) Nếu cần sử dụng lượng vật liệu cấy nhiều điều dẫn đến vấn đề việc hình thành cân cacbon Việc sử dụng compost làm gia tăng số lượng nấm có bình thử cải thiện q trình phân hủy sinh học vật liệu chất dẻo Trong trường hợp cần phải nêu rõ trạng thái compost sử dụng báo cáo thử nghiệm (ví dụ compost ngấu, compost lấy từ pha nóng khoảng 50 °C) Khi cần phải có nồng độ vật liệu cấy cao hịa lượng đất compost nhiều vào mơi trường thử pha lỗng đến nồng độ thích hợp cho q trình ủ 8.4 Thử Chuẩn bị số lượng bình thử cho phép thử phải có: a) Hai bình thử dùng để chứa vật liệu thử (ký hiệu Fr); b) Hai bình thử dùng để chứa mẫu trắng (ký hiệu FB); c) Một bình thử dùng để kiểm tra hoạt tính vật liệu cấy sử dụng vật liệu đối chứng (ký hiệu F C) Và có yêu cầu: d) Một bình thử dùng để kiểm tra khả phân hủy không sinh học thay đổi khơng sinh học vật liệu thử, ví dụ phương pháp thủy phân (ký hiệu F s) Dung dịch thử bình Fs phải tiệt trùng, ví dụ hấp nồi hấp bổ sung thêm hợp chất vơ thích hợp để ngăn chặn hoạt tính vi sinh vật Ví dụ sử dụng ml/I dung dịch có chứa 10 g/l thủy ngân (II) clorua (HgCl2) Nếu có u cầu q trình thử bổ sung thêm lượng tương tự chất độc e) Một bình dùng làm đối chứng âm (ký hiệu FN), sử dụng polyme không phân hủy sinh học (ví dụ polyetylen) có kích thước hình dạng với vật liệu thử f) Một bình dùng để kiểm tra tác động ức chế vật liệu thử đến hoạt động vi sinh vật (ký hiệu Fl) Đảm bảo tỷ lệ cacbon vật liệu thử vật liệu đối chứng với nitơ mơi trường C:N = 40:1 Bổ sung thêm nitơ có yêu cầu Cho đủ lượng môi trường thử (6.2) vật liệu cấy (8.3) vào bình thử theo quy định Bảng Đo pH bình thử điều chỉnh đến giá trị cần thiết Cho chất hấp thụ cacbon dioxit (6.4) vào ngăn chứa chất hấp thụ máy đo hô hấp (xem Phụ lục C) Thêm vật liệu thử (xem 8.1), vật liệu đối chứng vật liệu đối chứng âm tính (xem 8.2) tương ứng vào bình quy định Bảng Nếu tiến hành cân cacbon (xem Phụ lục E) lấy lượng biết trước mơi trường thử cấy từ bình từ bình riêng bổ sung để xác định DOC sinh khối thời điểm bắt đầu kết thúc trình ủ Lưu ý đến thể tích lấy điều chỉnh thể tích cuối tính tốn kết thử Đặt bình thử vào mơi trường có nhiệt độ khơng đổi (xem Điều 5) để tất bình đạt đến nhiệt độ mong muốn Đậy kín bình, đặt chúng vào hơ hấp kế, thực kết nối cần thiết bắt đầu khuấy Ghi lại số đọc áp kế (nếu điều chỉnh tay) kiểm tra chắn thiết bị ghi lượng oxy tiêu tốn hoạt động tốt (đối với hô hấp kế tự động) Ngồi sử dụng bình kín hai pha mô tả Phụ lục D Bảng - Phân bố vật liệu thử vật liệu đối chứng Bình thử Vật liệu thử Vật liệu đối chứng Vật liệu cấy FT Mẫu thử + - + FT Mẫu thử + - + FB Mẫu trắng FB Mẫu trắng FC Kiểm tra vật liệu cấy Fs Kiểm tra phân hủy (không sinh học (tùy chọn) Fl Kiểm tra ức chế (tùy chọn) Fs Kiểm tra âm tính (tùy chọn) - - + - - + - + + + - - + + + - + + Khi mức BOD khơng đổi trì (đạt đến giai đoạn ổn định) khơng có thêm phân hủy sinh học xảy phép thử coi hoàn thành Thời gian tối đa tháng Trong trường hợp thời gian thử dài phải lưu ý đặc biệt đến hệ thống thiết bị (ví dụ độ kín khít bình thử hệ thống kết nối) Tại thời điểm kết thúc phép thử, đo pH xác định nồng độ nitrat nitrit bình thử FT (xem thích) lấy lượng mẫu bảo quản thích hợp Sử dụng giá trị để hiệu chỉnh mức độ phân hủy sinh học tính tốn q trình nitrat hóa (xem Phụ lục B) CHÚ THÍCH Allylthiourea ức chế q trình nitrat hóa thời gian ủ ngắn phân hủy sinh học Do bổ sung allylthiourea để ngăn chặn q trình nitrat hóa không khuyến nghị Tuy nhiên, kinh nghiệm với nồng độ vật liệu cấy thấp [khoảng % (V/V)] q trình nitrat hóa khơng xảy cho dù thời gian ủ có kéo dài, khơng cần sử dụng chất ức chế Tính tốn biểu thị kết 9.1 Tính tốn Đọc giá trị lượng oxy tiêu tốn bình thử phương pháp nhà sản xuất đưa tùy theo loại máy đo hơ hấp sử dụng Tính nhu cầu oxy sinh hóa (BOD s) vật liệu thử, chênh lệch lượng oxy tiêu tốn bình chứa vật liệu thử FT bình chứa mẫu trắng FB chia cho nồng độ vật liệu thử, theo công thức (1): BODs  BODt  BODBt BO pTC Trong BODs lượng BOD cụ thể vật liệu thử, tính miligam gam vật liệu thử; BODt lượng BOD bình thử chứa vật liệu thử FT vào thời điểm t, tính miligam lít; BODBt lượng BOD bình thử chứa mẫu trắng FB vào thời điểm t, tính miligam lít; pTC nồng độ vật liệu thử hỗn hợp phản ứng bình thử FT, tính gam lít Tính phần trăm phân hủy sinh học Dt tỷ lệ lượng cầu oxy sinh hóa cụ thể với lượng cầu oxy theo lý thuyết (ThOD, tính miligam gam vật liệu thử) theo cơng thức (2): Dt  BODs 100 ThOD Tương tự trên, tính lượng BOD phần trăm phân hủy sinh học vật liệu đối chứng FC có, bình thử kiểm tra phân hủy khơng sinh học Fs bình thử kiểm tra ức chế Fl kiểm tra âm tính FN CHÚ THÍCH Để tính tốn ThOD, xem Phụ lục A Nếu nồng độ xác nitrit nitrat xác định phải lưu ý đến nhu cầu oxy q trình nitrat hóa (xem Phụ lục B) Nếu tính cân cacbon xem thông tin nêu Phụ lục E 9.2 Biểu thị giải thích kết Lập bảng giá trị BOD đo giá trị phần trăm phân hủy sinh học tương ứng với thời điểm đo bình thử Đối với bình thử, vẽ đồ thị đường cong lượng BOD đường cong phần trăm phân hủy sinh học theo thời gian Nếu thu kết so sánh hai bình thử tiến hành đồng thời vẽ đường cong trung bình Mức phân hủy sinh học tối đa xác định giá trị trung bình giai đoạn ổn định đường cong phân hủy sinh học giá trị cao nhất, ví dụ đường cong xuống lên chậm giai đoạn ổn định, mô tả mức độ phân hủy sinh học vật liệu thử Nếu cân cacbon xác định kết xác định mô tả tổng mức độ phân hủy sinh học Khả thấm ướt hình dạng miếng vật liệu thử ảnh hưởng đến kết phải tính đến điều so sánh kết thu từ vật liệu chất dẻo có cấu trúc hóa học giống Thơng tin độc tính vật liệu thử hữu ích việc giải thích kết thử khả phân hủy sinh học thấp 10 Độ tin cậy kết Phép thử coi có tin cậy a) Mức độ phân hủy sinh học vật liệu đối chứng (bình kiểm tra vật liệu cấy FC) lớn 60 % thời điểm kết thúc phép thử; b) Giá trị BOD bình chứa mẫu trắng FB thời điểm kết thúc phép thử không vượt giá trị giới hạn thu theo kinh nghiệm (giá trị phụ thuộc lượng vật liệu cấy, ví dụ thử nghiệm liên phịng trường hợp có 30 mg/l vật liệu khơ giá trị khoảng 60 mg/l) Nếu bình Fl (kiểm tra ức chế, có) phần trăm phân hủy sinh học < 25 % không quan sát rõ phân hủy vật liệu thử coi vật liệu thử gây ức chế Nếu bình Fs (kiểm tra phân hủy khơng sinh học, có) quan sát rõ lượng BOD (> 10 %) trình phân hủy khơng sinh học xảy Nếu có bình FN (kiểm tra âm tính) khơng quan sát có BOD Nếu tiêu chí khơng đạt lặp lại phép thử cách sử dụng lượng vật liệu cấy làm thích nghi trước cho tiếp xúc trước 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin sau đây: a) viện dẫn tiêu chuẩn này; b) tất thông tin cần thiết để nhận biết vật liệu thử vật liệu đối chứng, gồm TOC, ThOD, thành phần cơng thức hóa học (nếu biết), hình dạng, thể loại hàm lượng/nồng độ mẫu thử; c) thơng số thử chính, gồm thể tích thử, mơi trường thử sử dụng, nhiệt độ ủ pH cuối; d) nguồn lượng vật liệu cấy sử dụng, bao gồm chi tiết việc phơi nhiễm trước trạng thái compost sử dụng; e) kỹ thuật phân tích sử dụng gồm nguyên tắc máy đo hô hấp phương pháp xác định TOC nitrat/nitrit; f) tất kết thử thu vật liệu thử vật liệu đối chứng (dạng bảng biểu đồ thị) bao gồm lượng BOD đo được, giá trị phần trăm phân hủy sinh học đồ thị thông số theo thời gian nồng độ nitrat/nitrit; g) khoảng thời gian giai đoạn thích ứng giai đoạn phân hủy sinh học, mức phân hủy sinh học tối đa tổng thời gian thử; thông tin tùy chọn sau, có thực xác định: h) kết trình kiểm tra phân hủy không sinh học F s, kiểm tra ức chế Fl kiểm tra âm tính FN; i) kết việc xác định cân cacbon, bao gồm như: 1) lượng cacbon vật liệu thử bị oxy hóa thành cacbon đioxit, ước lượng từ mức độ phân hủy sinh học dựa BOD, 2) lượng tăng DOC mơi trường thử q trình ủ gây chất hịa tan nước, 3) lượng tăng cacbon hữu sinh khối trình thử, 4) hàm lượng cacbon polyme tồn dư thời điểm kết thúc phép thử, 5) tổng số lượng cacbon đo được, biểu thị phần trăm cacbon đưa vào thông qua vật liệu thử; j) đơn vị cụm khuẩn (cfu/g) có hỗn hợp thử cấy; k) liệu có liên quan (ví dụ khối lượng phân tử ban đầu mẫu thử, khối lượng phân tử polyme tồn dư); Phụ lục A (tham khảo) Nhu cầu oxy theo lý thuyết (ThOD) A.1 Tính lượng ThOD Nhu cầu oxy theo lý thuyết (ThOD) chất CcHhClclNnSsPpNanaOo có khối lượng phân tử tương đối Mr, tính biết cấu tạo nguyên tố xác định cách phân tích ngun tố, sử dụng cơng thức sau: ThOD  16[2c  0,5(h  cl  3n )  3s  2,5 p  0,5na  o ] Mr Cách tính giả định cacbon chuyển hóa thành CO2, hydro thành H2O, photpho thành P2O5, lưu huỳnh thành trạng thái oxy hóa +6 halogen sinh dạng hợp chất hydro Sự oxy hóa N, P S phải kiểm tra phép phân tích Việc tính tốn giả định lượng nitơ giải phóng dạng ammoni Biểu thị ThOD miligam gam chất miligam miligam chất A.2 Ví dụ: Poly (axit β-hydroxybutyric) (PHB) Cơng thức rút gọn1): C4H6O2 , c = 4, h = 6, o = 2; khối lượng phân tử Mr = 86 ThOD  16[2 4  0,5 6  2] 86 ThOD = 1,674 mg/mg PHB = 674,4 mg/g PHB A.3 Ví dụ : Hỗn hợp polyetylen/ tinh bột/ glyxerin Thành phần Công thức ThOD mg/g Polyetylen (C2H4)n Tinh bột Glyxerin Lượng thành phần ThOD % mg/bình mg/bình 400 50 500 700 (C6H10O5)n 190 40 400 476 C3H8O3 200 10 100 120 100 000 296 Tổng cộng (Bổ sung footnotes) Phụ lục B (tham khảo) Hiệu chỉnh giá trị BOD ảnh hưởng q trình nitrat hóa B.1 Ảnh hưởng q trình nitrat hóa Giá trị BOD bị ảnh hưởng q trình nitrat hóa Giá trị phải hiệu chỉnh sai sót nghiêm trọng tránh q trình tính tốn mức độ phân hủy sinh học dựa oxy hóa cacbon có vật liệu thử chứa nitơ Các sai lỗi trường hợp chất khơng chứa nitơ thường khơng đáng kể q trình oxy hóa amoni mơi trường xem xét đến cách trừ mẫu trắng Muối amoni hợp chất thử có chứa nitơ bị oxy hóa thành nitrat nitrit q trình ủ phép thử phân hủy sinh học Vì phản ứng xảy (dưới tác động chủng vi khuẩn khác nhau) nên nồng độ nitrit tăng giảm Trong trường hợp giảm nồng độ nitrat cân tạo thành Các phản ứng hóa học từ (B.1) đến (B.3) sau: 2NH4CI + 3O2 = 2HNO2 + 2HCI + 2H2O (B.1) 2HNO2 + O2 = 2HNO3 (B.2) Tổng thể: 2NH4CI + 4O2 = 2HNO3 + 2HCI + 2H2O (B.3) Từ phương trình kết luận - q trình oxy hóa phân tử (28 g) nitơ amoni (thêm NH4CI vào mơi trường vơ cơ) thành nitrit, cần phải có phân tử (96 g) oxy (BODNO2 ) , kết cần 3,43 (96/28) mg oxy cho mg nitơ; q trình oxy hóa phân tử (28 g) nitơ amoni thành nitrat cần phải có phân tử (128 g) oxy ( BODNO2 ), kết cần 4,57 (128/28) mg oxy cho mg nitơ Mức độ q trình nitrat hóa xác định cách đo nồng độ nitrat nitrit tạo thành 1) PHB polyme monome β-hydroxybutyrat Khi polyme hóa (tạo thành este) nước bị loại bỏ, cơng thức phân tử tổng qt PHB tương đương với monome trừ H 2O, bị khử phản ứng hóa học tại thời điểm kết thúc phép thử môi trường thử bình thử FT Nên xác định định tính trước để xem liệu q trình nitrat hóa có xảy hay khơng Nếu có mặt nitrat nitrit cần xác định định lượng Lượng BOD thu từ q trình oxy hóa nitơ thời điểm kết thúc phép thử, BODN tính miligam lít, theo công thức (B.4): BODN ( pNO3 4,57)  ( pNO2 3,43 ) (B.4) Trong pNO3 nồng độ nitơ nitrat đo có bình FT thời điểm kết thúc phép thử, tính miligam lít; pNO2 nồng độ nitơ nitrit đo có bình FT thời điểm kết thúc phép thử, tính miligam lít; 4,57 hệ số thể nhu cầu oxy trình tạo thành nitrat; 3,43 hệ số thể nhu cầu oxy trình tạo thành nitrit Lượng BOD thu từ q trình oxy hóa cacbon thời điểm kết thúc phép thử, BODC tính miligam lít, theo cơng thức (B.5): BODC = BODG - BODN - BODBt (B.5) Trong BODG lượng BOD đo bình FT thời điểm kết thúc phép thử, tính miligam lít; BODBt lượng BOD bình chứa mẫu trắng thời điểm kết thúc phép thử, tính miligam lít BODC tương đương với BODt sử dụng để tính lượng BODs Dt [xem công thức (1) (2) 9.1] B.2 Ví dụ Thử với chất p-aminobenzoic axit etylhexyl este nồng độ 10 mg/l bình FT ThOD 239 mg/l BODt đo thời điểm kết thúc phép thử 199 mg/l BODBt đo mẫu trắng mg/l Dt khơng hiệu chỉnh q trình nitrat hóa 80% Nitrat thời điểm kết thúc phép thử 15 mg/l pNO3 = 3,5 mg/l Nitrit thời điểm kết thúc phép thử mg/l pNO2 = 0,3 mg/l BODN thời điểm kết thúc phép thử 17 mg/I BODC 174 mg/l D2 hiệu chỉnh trình nitơ hóa 73% Phụ lục C (tham khảo) Nguyên tắc hoạt động máy đo hơ hấp kín Máy đo hô hấp cài đặt môi trường có kiểm sốt nhiệt độ (ví dụ bể cách thủy) bao gồm bình thử nghiệm, bình có khuấy từ cốc chứa khoảng không bên có chất hấp thụ CO2, thiết bị sản xuất oxy theo phương pháp điện phân, máy khuấy từ cho bình thiết bị kiểm tra thiết bị ghi để bên (máy in, thiết bị vẽ đồ thị máy tính) Đổ hỗn hợp thử vào phần ba thể tích bình thử nghiệm Khuấy liên tục để đảm bảo cân oxy pha lỏng pha khí Nếu q trình phân hủy sinh học xảy ra, vi sinh vật tiêu tốn oxy sản sinh cacbon dioxit cacbon dioxit bị hấp thụ hoàn toàn Tổng áp suất bình giảm xuống Khi áp suất giảm trình điện phân oxy khởi động lại Sau đó, áp suất ban đầu thiết lập lại trình điện phân dừng lượng điện sử dụng tương ứng với lượng oxy bị tiêu tốn đo liên tục dùng để xác định lượng oxy tiêu tốn, biểu thị theo mg/l BOD thiết bị ghi CHÚ DẪN Chất hấp thụ CO2 Bể cách thủy Hộp điều khiển Thiết bị sản xuất oxy Máy in, thiết bị vẽ đồ thị máy tính Bình thử Áp kế Thiết bị khuấy Hình C.1 - Giản đồ hơ hấp kế Phụ lục D (tham khảo) Bình kín hai pha sử dụng cho phép thử hơ hấp D.1 Nguyên tắc Thiết bị sử dụng thiết bị thay khơng có máy đo hô hấp Môi trường cấy vật liệu thử vật liệu đối chứng lắc khuấy nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C bình kín có chứa lượng biết mơi trường thử dạng lỏng khơng khí để đảm bảo phân chia oxy ổn định pha lỏng pha khí Q trình phân hủy sinh học sau đo cách đo đặn nồng độ oxy hịa tan pha khí Lượng oxy tổng cộng tăng lên bình thử tính chênh lệch nồng độ oxy tiêu tốn đo bình trắng bình thử, chia cho giá trị bão hịa oxy điều kiện thơng thường nhân với nồng độ oxy tổng cộng ban đầu có pha lỏng pha khí Khả phân hủy sinh học tính lượng oxy tổng cộng thu chia cho lượng cầu oxy theo lý thuyết (ThOD) biểu thị phần trăm D.2 Thiết bị, dụng cụ đặc biệt D.2.1 Chai ủ: chai kín khí, ví dụ bình phản ứng cổ hẹp với dung tích từ 200 ml đến 300 ml có nắp đậy phù hợp (ví dụ nắp thủy tinh nhám, nắp cao su butyl nắp vặn), miễn ngăn ánh sáng (ví dụ làm thủy tinh màu nâu) Nên có kẹp nắp đậy Đánh dấu vào bình Nếu khơng sử dụng điện cực oxy có gắn thiết bị khuấy bình nên lắp với máy khuấy từ có khuấy phủ PTFE Có thể dùng bình có dung tích tiêu chuẩn cho độ lệch chuẩn từ thể tích trung bình lơ bình nhỏ ml đo ghi lại dung tích bình đánh số riêng biệt, với độ xác đến ml Cẩn thận bơi vào nắp bình mỡ silicon trơ để dễ dàng đậy mở nắp bình D.2.2 Điện cực oxy, thường gắn thiết bị khuấy đo khoảng từ mg/l đến 10 mg/l với độ xác % Sự ổn định đạt vịng 1,5 Gắn điện cực, ví dụ nắp trơ để vừa kín khít phần cổ thủy tinh có mài nhám bình ủ sử dụng kỹ thuật đo nồng độ oxy nhánh vòng (circular bypass) D.2.3 Máy khuấy từ máy lắc D.3 Cách tiến hành Chuẩn bị chai ủ mô tả 8.4, sử dụng ba chai cho loại FT, FB FC Cho khuấy vào chai sử dụng máy khuấy thay cho máy lắc Chuẩn bị môi trường thử phù hợp, ưu tiên môi trường chuẩn (6.2.1) để thực phép thử hoàn thiện Để đảm bảo việc cung cấp chất dinh dưỡng phù hợp tăng lượng amoni clorua dung dịch A (6.2.11) lên gấp ba lần nghĩa 1,5 g/l Cấy vào môi trường theo 8.3, ưu tiên sử dụng bùn hoạt hóa có hàm lượng chất rắn lơ lửng 30 mg/l, trộn cho thêm hỗn hợp vào chai Thêm lượng hai phần ba thể tích chai (ví dụ 200 ml vào bình dung tích 300 ml) Đặt chai vào thiết bị lắc khuấy chúng ủ nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tuần Trong thời gian này, vi khuẩn sử dụng chất dự trữ chúng vật liệu cấy ổn định Sau để thống khí chai trợ giúp khí nén bão hịa nước máy khuếch tán khơng khí khoảng 15 Đo nồng độ oxy ban đầu Thêm vào chai tương ứng vật liệu thử vật liệu đối chứng mô tả 8.1 8.2 Nồng độ vật liệu thử tối đa phép thử phải khoảng 150 mg/l ThOD tương đương với khoảng 90 mg/l TOC Đậy kín chai tiếp tục trình ủ Sau ủ tuần, kiểm tra nồng độ oxy hịa tan chai Giữ chai nhiệt độ ủ quy định với sai số (± 0,5 °C) trình đo Hiệu chuẩn độ xác điện cực oxy theo hướng dẫn nhà sản xuất Đối với phép đo oxy, lấy từ chai lắc mạnh tay 30 s Đưa chai vào máy khuấy không khuấy Mở nắp chai đưa điện cực oxy vào cổ chai cho nắp điện cực đậy kín chai đầu điện cực nằm sâu bên bề mặt chất lỏng Bắt đầu khuấy tốc độ thích hợp cho phép đo oxy không để tạo thành dịng xốy Sử dụng tốc độ khuấy phép đo hiệu chuẩn điện cực Ghi lại giá trị oxy ổn định, thường thời gian khoảng Chỉ sử dụng bình có nồng độ oxy >1,5 mg/l để tính tốn kết thử Ngồi ra, sử dụng kỹ thuật khác phù hợp để đo nồng độ oxy pha lỏng, sử dụng điện cực oxy nhánh vòng (cicurlar bypass) Sau đo pH bình ghi lại giá trị Nếu pH nhỏ 6,0 điều chỉnh đến khoảng 7,5 với 0,1 mol/l đến 0,5 mol/l dung dịch natri hydroxit Nếu pH lớn 8,0 điều chỉnh đến khoảng 7,5 0,1 mol/l đến 0,5 mol/l axit clohydric Sau tiến hành thống khí mơi trường chai thiết bị khuếch tán không khí 15 đo nồng độ oxy lần mô tả Đậy lại nắp chai, đưa chai vào máy khuấy tiếp tục ủ Hiệu chỉnh giá trị BOD thời điểm kết thúc phép thử q trình nitrat hóa (xem 8.4 phụ lục B) D.4 Tính tốn kết Xác định lượng oxy tương đối thu Ur đo pha lỏng chai, theo công thức (D.1) Ur  CBt  Ct Cs Trong CBt giá trị trung bình nồng độ oxy hịa tan chai chứa mẫu trắng sau ủ thời điểm t, tính miligam lít; Ct nồng độ oxy hòa tan, chai thử sau ủ, thời điểm t, tính miligam lít; Cs giá trị bão hịa oxy hịa tan, tính miligam lít Sử dụng giá trị bão hịa Cs, giá trị trung bình đo sau lần thống khí thống khí lại chai mẫu trắng mẫu thử Giá trị lý thuyết áp suất khí tiêu chuẩn (1013 hPa) 20 °C 9,08 mg/l Xác định lượng oxy tổng Oc (mg/bình) chai từ hàm lượng oxy tối đa pha khí hàm lượng oxy pha lỏng áp suất tiêu chuẩn 20 °C theo công thức (D.2) Oc = (0,28 x Vg) + (0,009 x Vl) (D.2) Trong 0,28 nồng độ oxy khơng khí thơng thường, tính miligam mililit; Vg thể tích khí chai ủ, tính mililit; 0,009 nồng độ oxy nước bão hịa, tính miligam mililit; Vl thể tích chất lỏng chai ủ, tính mililit Thơng thường, Vl không đổi dãy phép thử, trừ mẫu phân tích lấy ra, Vg thay đổi tùy thuộc vào bình thử sử dụng Nếu chênh lệch giữ chai riêng biệt nhỏ sử dụng giá trị Oc khơng đổi Nếu chênh lệch lớn (ví dụ > ml chai tích 200 ml) giá trị Oc phải tính tốn chai Nếu Vl giảm lượng mẫu bị lấy phải tăng Vg lên với tỷ lệ tương ứng Tính lượng oxy thu BOD (mg/bình) từ cơng thức D.3 BOD = Ut x Oc (D.3) Tính tổng lượng EBOD thu (mg/bình) tất thời gian ủ (n) theo công thức D.4 để nhận giá trị BOD thời điểm kết thúc phép thử  BOD BOD  BOD  BODn (D.4) Cuối tính phần trăm phân hủy sinh học mô tả 9.1 Sử dụng công thức phù hợp để xác định loại trừ không sinh học phân hủy sinh học vật liệu đối chứng kiểm tra ức chế Phụ lục E (tham khảo) Ví dụ việc xác định cân cacbon E.1 Nguyên tắc Vật liệu chất dẻo thường có thành phần phức tạp so với hợp chất phân tử thấp Việc xác định riêng giải phóng CO2 BOD thường không đủ để xác định đặc tính chất lượng khả phân hủy sinh học Trong trình phân hủy sinh học, sinh khối hình thành vi sinh vật phần cacbon có vật liệu thử chuyển vào sinh khối khơng bị oxy hóa sinh học Do vậy, thơng số phân tích giải phóng CO2 BOD thường khơng đạt đến 100 % giá trị lý thuyết mong muốn, trường hợp phân hủy sinh học vật liệu thử hoàn toàn phân rã khơng đủ bị suy luận khơng từ kết thử Việc xác định cân cacbon mơ tả phụ lục hữu ích trường hợp xác nhận lại khả phân hủy sinh học hồn tồn Vì cân dựa tổng lượng cacbon thu từ phép đo sau; lượng cacbon có cacbon dioxit, lượng cacbon sinh dạng sinh khối mới, lượng cacbon chuyển vào chất chuyển hóa hữu tan nước, lượng cacbon xác định dạng DOC lượng cacbon lại vật liệu polyme chưa phân hủy Tổng cacbon so sánh với lượng cacbon hữu vật liệu thử đưa vào hệ thống thử E.2 Cách tiến hành Xác định BOD sinh mô tả 8.4 Lấy mẫu môi trường cấy thời điểm bắt đầu, trước cho thêm vật liệu thử thời điểm kết thúc trình ủ Việc lấy mẫu phải tiến hành cẩn thận để thu mẫu thử đại diện Cho mẫu qua lọc màng ly tâm chúng tốc độ khoảng 40 000 m.s-2 Với mẫu, xác định lượng sinh khối chất lọc ly tâm theo phương pháp phù hợp, ví dụ phép đo protein Xác định tính lượng cacbon sinh khối tính tốn chênh lệch từ lượng tăng cacbon hữu sinh khối Xác định theo TCVN 6634 (ISO 8245), DOC chất lọc mẫu tính tốn lượng tăng cacbon hữu Nếu có thể, nhận dạng hợp chất hình thành DOC để xác nhận lại hình thành chất chuyển hóa tan nước Sử dụng tồn lượng mẫu cịn lại để xác định lượng cacbon polyme cặn thời điểm kết thúc phép thử Đây thường quy trình khó khăn làm trực tiếp phân tích riêng polyme (xem phụ lục F) gián tiếp Trong trường hợp trực tiếp, chiết cân polyme cặn tính lượng cacbon từ thành phần biết polyme Một phương pháp xác định gián tiếp rửa, sấy khô, cân phần cặn xác định cacbon hữu tổng (TOC) Sau trừ giá trị cacbon sinh khối (nêu trên) để thu lượng cacbon có polyme cặn Một cách khác cân xác cặn xử lý chúng phương pháp thích hợp để phá hủy sinh khối không phá hủy polyme (điều phải kiểm tra trước) Ví dụ sử dụng natri hypoclorit, loại bỏ phần hòa tan cân lại mẫu Coi tất sinh khối bị loại bỏ tính tốn từ khối lượng thu hàm lượng cặn polyme E.3 Tính cân cacbon Tính lượng cacbon bị oxy hóa sinh học CBOD (mg/I) vật liệu thử đưa vào hệ thống thử (hàm lượng cacon CMAT) từ phần trăm phân hủy sinh học Dt thu phép thử máy đo hô hấp (xem 9.1), theo công thức E.1: CBOD  CMAT Dt C 100 (E.1) Tính tốn lượng tăng cacbon sinh khối bình thử có chứa vật liệu thử CBIO (mg/l) cách so sánh sinh khối thời điểm bắt đầu với thời điểm kết thúc q trình ủ, lưu ý đến lượng cacbon có sinh khối đo ước lượng CB(bắt đầu) CB(kết thúc) theo công thức E.2 CBIO = CB(kết thúc) + CB(bắt đầu) (E.2) Xác định lượng tăng DOC suốt trình ủ DOC (mg/l) cách so sánh nồng độ DOC thời điểm bắt đầu với thời điểm kết thúc theo công thức E.3 CDOC = DOC(kết thúc) + DOC(bắt đầu) (E.3) Xác định lượng cacbon hữu polyme cặn thời điểm kết thúc phép thử POL Tính giá trị chênh lệch lượng cacbon chuyển hóa theo phần trăm cacbon đưa vào C MAT cộng lại để thu cacbon tính tốn CCALC (%) theo cơng thức E.4: CCALC = CBOD + CBIO + CDOC + CPOL (E.4) E.4 Ví dụ: Cân cacbon poly(β-hydroxybutyrat) 2) Cho vật liệu thử: CMAT = 600 mg/l = 334,8 mg/l cacbon Mức độ phân hủy sinh học: Dt = 78 % mg/l CB(bắt đầu) CB(kết thúc) CBIO DOC(bắt đầu) DOC(kết thúc) DOC CBOD 3,2 61,0 57,8 2,0 22,0 20,0 261 6,0 78 % CMAT 17,2 Tính cân cacbon : CCALC = 78 % + 17 % + % = 101 % CMAT (Bổ sung footnotes) Phụ lục F (tham khảo) Ví dụ xác định lượng khối lượng phân tử polyme khơng hịa tan nước cịn lại kết thúc phép thử phân hủy sinh học Sử dụng quy trình đo hàm lượng khối lượng phân tử polyme cịn lại kết thúc nghiên cứu có hữu ích Có thể sử dụng phương pháp sau phương pháp thích hợp khác để phân tích polyme khơng hịa tan nước hịa tan dung môi hữu không trộn lẫn với nước a) Cho hỗn hợp kiểm tra vào phễu chiết, thêm dung mơi hữu thích hợp lắc 10 đến 20 để chiết polyme cịn lại Tách lớp dung mơi hữu khỏi lớp dung dịch Thêm dung môi lặp lại quy trình b) Trộn lẫn phần hữu chiết cho bay dung môi đến khô Hịa tan mẫu chất rắn thể tích nước giải hấp thích hợp c) Sử dụng bơm tiêm vi lượng, tiêm lượng thích hợp vào thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) có cột chứa gel sử dụng sắc ký khí thẩm thấu gel Bắt đầu phân tích ghi phổ d) Xác định lượng polyme có mặt cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn e) Xác định khối lượng phân tử polyme cách bơm vào sắc phổ polyme loại, polyme có cấu trúc tương tự polyme thử mà biết khối lượng phân tử Mối liên hệ thời gian lưu khối lượng phân tử thu từ sắc phổ cuối Tính khối lượng phân tử từ mối liên hệ Khối lượng phân tử polyme thử xác định phương pháp HPLC với detector loại kết hợp quét tia laser góc hẹp (LALLS) số khúc xạ vi sai (RI) Phụ lục G (tham khảo) Thư mục tài liệu tham khảo [1] ASTM D 3536-91, Molecular weight averages and molecular weight distribution by liquid exclusion chromatography (GEL permeation chromatography - GPC) [2] ASTM D 5271-02, Determining the aerobic biodegradation of plastic materials in an activatedsludge wastewater-treatment system [3] ISO 8192:1986, Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge [4] ISO 10708:1997, Water quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds - Determination of biochemical oxygen demand in a two-phase closed bottle test [5] ISO 11923, Water quality - Determination of suspended solids by filtration through glass-fibre filters [6] JIS K 6950:1994, Plastics testing method for aerobic biodegradability by activated sludge 2) Thu thập từ: Puchner (1994) (tài liệu tham khảo [9] phụ lục G) [7] KITANO, M., and YAKABE, Y., Strategy for biodegradability testing in OECD Edited by Y.Doi and K.Fukuda, Biodegradable plastics and polymers, Elsevier, Amsterdam, pp.217-227 [8] PüCHNER, P., MUELLER, W.R., and BARDTKE, D (1995), Assessing the äaeroben und anaeroben bedingungen, Dissertation, Stuttgart University Fakultät für Bauingenleurwesen, Stuttgarter Berichte zur Abfallwirtschaft, 59, Erich Schmidt Verlag, Berlin [10] SAWADA, H (1994), Field testing of biodegradable plastics, Edited by Y.Doi and K.Fukuda, Biodegradable plastics and polymers, Elsevier, Amsterdam, pp.298-312 [11] SPERANDIO, A., and PüCHNER, P (1993), Bestimmung der Gesamtproteine ais BiomasseParameter in wäßrigen Kulturen und auf Trägermaterialien aus Bio-Reaktoren, gwf Wasser, Abwasser, 134, pp.482-485