Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 4A (2021): 9-17 DOI:10.22144/ctu.jvn.2021.109 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NANO-HYDROXYAPATITE TỪ XƯƠNG CÁ NGỪ (Thunnus tonggol) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TƯƠNG THÍCH SINH HỌC Nguyễn Trí1, Nguyễn Thị Mai Phương2, Nguyễn Thị Thùy Vân1, Nguyễn Phụng Anh1, Dương Huỳnh Thanh Linh1, Nguyễn Thị Hồng Nơ1, Phan Hồng Phương2, Đoàn Văn Hồng Thiện3 Huỳnh Kỳ Phương Hạ2* Viện Cơng nghệ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Cần Thơ *Người chịu trách nhiệm viết: Huỳnh Kỳ Phương Hạ (email: hkpha@hcmut.edu.vn) Thông tin chung: Ngày nhận bài: 26/02/2021 Ngày nhận sửa: 03/04/2021 Ngày duyệt đăng: 20/08/2021 Title: Fabrication of nanohydroxyapatite from Thunnus tonggol bone and its biocompatibility Từ khóa: Cá ngừ, nano-hydroxyapatite, tương thích sinh học, xương cá Keywords: Thunnus tonggol, nanohydroxyapatite, biocompatibility, fish bone ABSTRACT In this paper, the effects of hydrothermal and calcination conditions on the structure of nano-hydroxyapatite synthesized from Thunnus tonggol bone were studied The characteristics of samples were determined by various techniques such as X-ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), field emission scanning electron microscopy (FE-SEM), transmission electron microscopy (TEM), and optical X-ray fluorescence spectroscopy (XRF) XRD results showed that the hydrothermal and calcination conditions affect the crystallinity and purity of nano-hydroxyapatite product The suitable conditions for the synthesis of nano-hydroxyapatite have been proposed such as hydrothermal at 120°C in hours and calcination at 800°C in hour Under the conditions, the hydroxyapatite had the nanoparticle size in a range of 30– 100 nm, and reached a BET surface area of 15.8 m2/g, a pore volume of 0.018 cm3/g, and a pore diameter of 23.0 Å The molar ratio of Ca/P in the nanohydroxyapatite was 1.67, which would be the expected ratio for hydroxyapatite The nano-hydroxyapatite product has high crystallinity and biological compatibility when tested in Simulated Body Fluid (SBF) TÓM TẮT Trong báo này, ảnh hưởng điều kiện thủy nhiệt nung đến cấu trúc nano-hydroxyapatite tổng hợp từ xương cá ngừ phương pháp thủy nhiệt nghiên cứu Các tính chất lý hóa sản phẩm nanohydroxyapatite xác định phương pháp phân tích đại nhiễu xạ tia X (XRD), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM), hiển vi điện tử truyền qua (TEM) quang phổ huỳnh quang tia X (XRF) Kết phổ XRD cho thấy điều kiện thủy nhiệt nung ảnh hưởng đến độ kết tinh độ tinh khiết hydroxyapatite Các điều kiện thích hợp để tổng hợp nano-hydroxyapatite xác định cụ thể thủy nhiệt 120°C nung 800°C Ở điều kiện phù hợp, nano-hydroxyapatite thu có kích thước hạt 30–100 nm đạt diện tích bề mặt BET 15,8 m2/g, thể tích lỗ xốp 0,018 cm3/g, đường kính lỗ xốp 23,0 Å Tỷ lệ mole Ca/P nano-hydroxyapatite tổng hợp 1,67 tỉ lệ xác định theo lý thuyết hydroxyapatite Sản phẩm nano-hydroxyapatite có độ kết tinh tương thích sinh học cao thử nghiệm môi trường thể người giả lập (SBF - Simulated Body Fluid) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 4A (2021): 9-17 sót lại bề mặt chất hữu có xương xử lý NaOH H2O2, cơng đoạn làm tăng chi phí cho q trình sản xuất HA, rào cản lớn cho việc ứng dụng triển khai vào thực tiễn Gần đây, nghiên cứu thủy phân xương cá ngừ enzyme nhiệt độ thấp (45oC) thu nhận sản phẩm có giá trị protein thực nhóm chúng tơi (2020) Bã rắn thải từ trình thủy phân có tiềm cho việc tổng hợp HA Nguyên liệu để tổng hợp HA nguồn bã thải rắn giàu canxi tạo tác động kép vừa tiết kiệm kiệm chi phí lượng vừa tạo HA độ kết tinh độ tinh cao Do vậy, nghiên cứu này, bã rắn thải từ trình thủy phân enzyme thu nhận protein tiến hành nghiên cứu tổng hợp nanohydroxyapatite phương pháp thủy nhiệt để đánh giá tiềm ứng dụng thực tiễn, sản phẩm HA thu quy trình tốt xác định tính chất lý hóa đặc trưng khả tương thích sinh học GIỚI THIỆU Hiện nay, nano-hydroxyapatite (HA) ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác như: làm chất độn (Nunes et al., 1997), sửa chữa xương tái tạo mô xương (Heise et al., 1990) chất mang thuốc để chữa trị thoái hóa xương (Bagambisa et al., 1993) y sinh; làm xúc tác, vật liệu trao đổi ion, cảm biến, gốm sứ sinh học công nghiệp xử lý mơi trường (Favier et al., 2001) HA trích xuất từ vật liệu có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp từ hóa chất So với HA có nguồn gốc tự nhiên, HA tổng hợp từ hóa chất phức tạp khơng an tồn mặt sinh học (không thể sử dụng làm vật liệu y sinh) (Panda et al., 2014) Do đó, nhà nghiên cứu lựa chọn nguồn tự nhiên để tổng hợp HA xương cá (Chakraborty & RoyChowdhury, 2013), xương bò (Luna Zaragoza et al., 2009), xương heo (Lü et al., 2007) Phân tích thành phần hóa học sản phẩm sản phẩm từ nguồn nguyên liệu nguồn cung cấp calcium phong phú (Chakraborty & RoyChowdhury, 2013; Lü et al., 2007; Luna Zaragoza et al., 2009; Panda et al., 2014) Tổng hợp HA từ nguồn phế thải không đạt hiệu kinh tế mà cịn thân thiện với mơi trường Theo nhận định Gumisiriza et al (Gumisiriza et al., 2009), thành phần chất thải rắn (xương) chiếm 30 – 40% tổng lượng chất thải từ trình chế biến cá Trong năm gần đây, HA tổng hợp từ xương vảy cá nhằm thay cho HA tổng hợp tính chất hóa học tương tự đạt phương pháp tổng hợp đơn giản, rẻ tiền HA chứng minh nguồn nguyên liệu từ cá an toàn dồi (Hoyer et al., 2012; Venkatesan et al., 2012) HA tổng hợp có tỷ lệ Ca/P gần giống tỷ lệ Ca/P xương người (chiếm đến 97% 70% xương) nên đánh giá có tính tương thích sinh học cao HA với tỷ lệ cân đối calcium phosphor hấp thụ trực tiếp vào xương mà khơng cần chuyển hóa thêm, khơng cần dùng vitamin D để tăng cường hiệu suất hấp thụ calcium sản phẩm bổ sung calcium thông thường khác Đến nay, nhiều loài cá sử dụng để chế tạo HA, cá hồi (Hoyer et al., 2012), cá chép, cá cơm nhật bản, cá ngừ (Chaves et al., 2012), cá thu, cá thằn lằn, cá chình cá dẹt (Hamada et al., 1995), cá mòi (Chaves et al., 2012; Hasan et al., 2020); cá lóc (Hariani et al., 2020),… Nhìn chung, trình tổng hợp hydroxylapatite từ phụ phẩm xương cá trải qua công đoạn xử lý nguyên liệu ban đầu nấu chín nung nhằm tách hết thịt mơ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Tổng hợp nano canxi hydroxyapatite Nguyên liệu: Bã rắn xương cá ngừ thu hồi từ trình thủy phân enzyme alcalase với nồng độ enzyme 2,3 %kl, thời gian thủy phân nhiệt độ 45°C H3PO4 (Xilong, 85%), NH4OH (Xilong, 25-28%), ethanol (Xilong, 95%) nước cất Quy trình tổng hợp: Xương cá ngừ sau trình thủy phân rửa nước lần để loại bỏ tạp chất cịn sót lại Sau đó, xương sấy khơ 60oC 24 Sau đó, đem xương khơ nghiền mịn thành dạng bột đảm bảo kích thước hạt phải nhỏ 0,25 mm Cuối cùng, lấy mẫu đem phân tích XRF để xác định thành phần nguyên tố xương trước làm tiền chất tổng hợp HA Cân g xương cá khô nghiền mịn cho vào beaker 250 mL, thêm vào 50 mL nước cất khuấy nhiệt độ phòng với tốc độ khuấy 300 vòng/phút thời gian 30 phút Tiếp theo, thêm từ từ giọt dung dịch H3PO4 nồng độ 1% vào hỗn hợp, lượng thể tích dung dịch H3PO4 nồng độ 1% thêm vào tùy thuộc vào loại xương cá, đồng thời dùng NH4OH pha loãng % để trì pH = 10 suốt trình phản ứng Lượng phospho bổ sung vào cho tỉ lệ mol Ca/P dung dịch phản ứng 1,8 Dựa vào kết phân tích thành phần (XRF) nguyên tố loại xương ban đầu, lượng dung dịch H3PO4 nồng độ 1% bổ sung vào trình tổng hợp HA 14 mL Trong giai đoạn phản ứng này, hỗn hợp khuấy từ 10 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 4A (2021): 9-17 giữ nhiệt độ phòng thời gian phản ứng tính từ nhỏ giọt H3PO4 cuối Kết thúc phản ứng đem hỗn hợp ủ nhiệt tủ để đảm bảo ổn định cấu trúc sản phẩm HA Nhiệt độ ủ (Th) thời gian ủ (th) tiến hành khảo sát, từ chọn điều kiện ủ phù hợp thông qua kết đánh giá thành phần pha kích thước tinh thể HA thu máy Hitachi S4800 ảnh HRTEM xác định thiết bị JEOL JEM 1400 2.3 Đánh giá khả tương thích sinh học HA Các mẫu HA sau tổng hợp đánh giá khả tương thích sinh học theo phương pháp Kokubo et al (Kokubo & Takadama, 2006) Các mẫu ngâm dung dịch mơ dịch thể người (SBF-Simulated Body Fluid, có thành phần ion tương tự máu thể người) đánh giá thay đổi tính chất lý hóa theo thời gian ngâm Sau ủ nhiệt, gạn lấy phần rắn đem rửa nước cất ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút, thời gian lần ly tâm 15 phút Tiến hành rửa ly tâm nhiều lần pH dung dịch sau lọc đạt giá trị ± 0,2 Tiếp theo, rửa ly tâm lần cuối thực với ethanol 95% Sau ly tâm, mẫu rắn đem sấy khô nhiệt độ 80oC thời gian 12 Mẫu sau sấy đem nung để loại bỏ thành phần hữu liên kết chặt chẽ xương cá để thu nhận sản phẩm HA Nhiệt độ nung (Tc) thời gian nung (tc) tiến hành khảo sát, từ chọn điều kiện nung phù hợp thông qua kết đánh giá thành phần pha kích thước tinh thể HA thu 2.2 Phân tính tính chất HA Lấy mẫu HA tổng hợp điều kiện tốt sau phân tích thành phần, cấu trúc, hình thái cấu trúc bề mặt, ngâm dung dịch SBF pha Tiến hành khảo sát với tỷ lệ ngâm 250 mg HA/500 mL dung dịch SBF thời gian ngâm ngày, ngày, 14 ngày 21 ngày Sau khoảng thời gian ngâm, mẫu bột vật liệu tách rửa với nước cất lần để loại bỏ ion dư thừa sau rửa lại với cồn nguyên chất để loại bỏ hoàn toàn ion tự Mẫu đem sấy khô 80oC 12 đem phân tích xác định tính chất lý hóa so sánh với tính chất mẫu ban đầu Trạng thái pha mẫu sau tổng hợp xác định thông qua nhiễu xạ tia X (XRD) XRD xác định thiết bị XRD Bruker D8 Advance, xạ CuKa Mẫu đo nghiền thành dạng bột mịn, tạo thành bề mặt phẳng có bề dày khoảng 100 Å, sau tiến hành đo nhiệt độ phịng Từ kết XRD, kích thước trung bình tinh thể hạt nano-hydroxyapatite xác định theo công thức Scherrer (1) (Patterson, 1939): D= K.λ β.cosθ Các mẫu HA sau ngâm mơi trường SBF đem phân tích lại tính chất lý hóa so sánh với mẫu trước thử nghiệm với mục đích đánh giá khả tương thích sinh học vật liệu HA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp HA (1) Nhiễu xạ tia X mẫu HA tổng hợp thời gian thủy nhiệt nhiệt khác thể Hình So sánh với nhiễu xạ tia X HA chuẩn (JCPDS 09-0432), mẫu ủ khoảng thời gian từ 6, thể gần toàn đỉnh đặc trưng HA, đặc biệt đỉnh có cường độ cao 2θ = 31,4o Tuy nhiên, mẫu tổng hợp với thời gian thủy nhiệt có đỉnh thể độ sắc nét tách không rõ so với mẫu tổng hợp thời gian giờ, thời gian mẫu có độ kết tính chưa cao Mặt khác, mẫu tổng hợp với thời gian có xuất đỉnh lạ 2θ = 34,6o đặc trưng cho thành phần pha β−TCP (JCDPS 09−0169) Trong đó, mẫu ủ thể đỉnh HA, khơng có tồn pha khác Kết hợp với kích thước tinh thể trung bình mẫu HA thu thời gian thủy nhiệt 6, Trong đó, d đường kính trung bình tinh thể (nm), K = 0,94; l: bước sóng xạ tia X, l = 0,1541 nm; β FWHM (độ rộng bán) đỉnh XRD góc nhiễu xạ q (radian) Các nguyên liệu xương cá sản phẩm dạng bột xác định thành phần nguyên tố phương pháp quang phổ huỳnh quang tia X thiết bị S2 PUMA – BRUCKER Diện tích bề mặt riêng, thể tích lỗ xốp phân bố đường kính lỗ xốp mẫu xác định phương pháp hấp phụ N2 (BET) thiết bị BET NOVA 2200 E (số liệu xử lý phần mềm Quantan Chrome) Mẫu trước đo xử lý dịng khí N2 (99,999%) nhiệt độ 200oC thời gian Hình thái bề mặt mẫu đánh giá qua ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HR-TEM) Ảnh SEM xác định 11 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 4A (2021): 9-17 31,5, 37,4 37,6 nm, chọn thời gian ủ nhiệt phù hợp để tổng hợp HA Nhiễu xạ tia X mẫu HA nung nhiệt độ khác thời gian nung (Hình 3) cho thấy so với mẫu nung nhiệt độ 800 850oC, hai mẫu nung nhiệt độ 700 750oC đỉnh đặc trưng cho thành phần pha HA xuất chưa sắc nét tách rõ ràng vùng 2q = 30 – 35o, nung nhiệt độ chưa loại hết chất có bề mặt HA Điều chứng tỏ độ tinh khiết HA tăng tăng nhiệt độ nung Ngồi ra, q trình nung làm tăng độ kết tinh tinh thể HA (Juang & Hon, 1996) Trong mẫu nung nhiệt độ 850oC đỉnh xuất rõ, tách rõ ràng lại xuất đỉnh có cường độ yếu 2θ = 31,1o 2θ = 34,4o, đỉnh thể có mặt lượng nhỏ β−TCP (JCDPS 09−0169) Mẫu nung 800oC thể đỉnh đặc trưng rõ ràng trùng với phổ HA chuẩn tách tốt, đồng thời không xuất đỉnh lạ, điều chứng tỏ mẫu HA kết tinh tốt, đơn pha có độ độ tinh khiết cao Kích thước trung bình tinh thể HA mẫu nung nhiệt độ 700, 750, 800 850oC 32,1, 32,6, 37,4 52,2 nm Từ kết trên, chọn nhiệt độ nung phù hợp 800oC Hình Nhiễu xạ tia X mẫu HA tổng hợp với thời gian ủ (th) khác (Th = 120oC, Tc = 800oC tc = giờ); a) th = giờ; b) th = giờ; c) th = Nhiễu xạ tia X mẫu HA tổng hợp nhiệt độ thủy nhiệt khác thời gian thủy nhiệt thể Hình So với nhiễu xạ tia X HA chuẩn (JCPDS 09-0432), phổ thu mẫu thể hết đỉnh đặc trưng HA khoảng 2θ = 20o - 60o đỉnh có cường độ cao 2θ = 31,4o Mẫu thủy nhiệt 120oC thể đỉnh HA mẫu ủ 100oC 140oC có tồn rõ rệt số đỉnh lạ 2θ = 31,1o 2θ = 34,4o với cường độ yếu, chứng tỏ diện lượng nhỏ β−TCP (JCDPS 09−0169) Mặt khác, thay đổi nhiệt độ thủy nhiệt, kích thước tinh thể gần không thay đổi (37,4-37,8 nm) Điều chứng tỏ kích thước tinh thể HA thu phụ thuộc vào nhiệt độ thủy nhiệt Vậy, điều kiện ủ nhiệt phù hợp 120oC cho sản phẩm HA đơn pha độ tinh khiết cao Điều kiện sử dụng để tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nung đến trình tổng hợp HA Hình Nhiễu xạ tia X mẫu HA tổng hợp điều kiện ủ nhiệt phù hợp nung nhiệt độ khác (Th = 120oC, th = giờ, tc = giờ); a) Tc = 700oC; b) Tc = 750oC; c) Tc = 800oC; d) Tc = 850oC Nhiễu xạ tia X mẫu HA nung nhiệt độ 800oC khoảng thời gian khác (Hình 4) cho thấy so với mẫu nung giờ, hai mẫu nung 0,5 1,5 bên cạnh xuất đỉnh đặc trưng cho thành phần pha HA, nhiễu xạ tia X mẫu xuất đỉnh đặc trưng cho pha tạp β−TCP 2θ = 31,1o 2θ = 34,4o (JCDPS 09−0169) với cường độ yếu Xét kích thước tinh thể trung bình cho thấy thời gian nung dài kích thước tinh thể HA tăng tăng khơng nhiều kích thước tinh thể mẫu đạt