TRNG DI HC NONG LAM TP HCM KHOA CONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME Nhóm thực hiện: Nhóm 31 GVHD: TS Nguyễn Minh Xuân Hồng DANH SÁCH THÀNH VIÊN Họ tên MSSV LÊ THỊ MỸ DUYÊN 17125058 LÊ THỊ THÙY DIỆU 17125042 HUỲNH THỊ TÚ HẢO 17125080 CHẾ MỸ LINH 17125132 NGUYỄN MINH HƯNG 17125105 TRẦN NGỌC THIỆN 17125275 ĐẶNG THỊ BẢO CHÂU 16125114 LÊ THỊ VÂN ANH 18125005 MỤC LỤC Bài KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME .5 Tính đặc hiệu enzyme Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme .7 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Ảnh hưởng chất hoạt hóa chất ức chế đến hoạt tính enzyme .12 Bài 2: ENZYME BROMELINE 15 Bài 3: ENZYME PECTINASE 17 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp so màu .17 Ứng dụng pestinase nước ép trái 19 BÀI KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME I Tính đặc hiệu enzyme Nguyên tắc - Tính đặc hiệu enzyme thể điểm: Mõi enzyme tác dụng lên chất định Chẳng hạn amylase thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide - Saccharide không cho phản ứng vưới Fehling vị phân tử khơng có nhóm cetose aldehyde tự Phản ứng dương tính saccharose thủy phân thành fructose glucose Hóa chất - Dung dịch saccharose 1% - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch Fehling ( tỉ lệ trộn Fehling :1) - Dung dịch amylase ❖ Cho ống nghiệm, ống 0.5 ml dung dịch amylase Thêm ml dung dịch tinh bột 1% vào ống nghiệm thứ 1ml dung dịch saccharose 1% vào ống thứ Đặt ống nhiệt độ phịng 5- 10 phút Sau đem cho vào ống ml dung dịch Fehling ( pha) lắc đều, đem ngâm vào nước nóng đến hai ống chuyển màu ngừng Nhận xét - Ống nghiêm chứa dung dịch tinh bột chuyển sang màu đỏ gạch trước Trong ống nghiệm chứa dung dịch saccharose xuất màu đỏ nhạt - Sau để ống nghiệm nhiệt độ phòng thời gian, màu đỏ gạch dần đậm lên ống nghiệm Giải thích - Khi cho enzyme vào dung dịch chứa tinh bột, tinh bột bị thủy phân tạo lượng nhỏ đường khử sau bị enzyme phân cắt thành lượng dextrin, nhỏ Fehling vào ngâm nước nóng q trình phân cắt ngày mạnh tạo nhiều dextrin mà màu đỏ gạch xuất ngày đậm Do Dextrin hỗn hợp polyme đơn vị D- glucose liên kết liên kết glycosidic α- (1 → 4) α- (1 → 6) nên phản ứng với thước thử Fehling cho kết tủa đỏ gạch - Ống nghiệm chứa dung dịch Saccharose cho enyme vào nhiệt độ phòng khơng thể phân cắt khơng có tính khử ( khơng chứa liên kết 1- glucoside) enzyme phân cắt nhiệt độ thường không tượng với thuốc thử Fehling Tuy nhiên để ông nghiệm nhiệt độ sôi, enzyme phân cắt lượng nhr saccharose thành đường khử Vì thời gian chuyển sang màu đỏ gạch nhỏ lâu nhạt ống chứa tinh bột II Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme Nguyên tắc: - Ở nhiệt độ 0C: vận tốc xúc tác enzyme thấp, không đáng kể, enzyme bảo quản tốt nhiệt độ - Ở nhiệt độ từ 30 - 50C: enzyme hoạt động mạnh - Ở nhiệt độ từ 60 - 80C: enzyme khả hoạt động - Ở nhiệt độ 100C: enzyme bắt đầu tác dụng Hóa chất: - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch enzyme amylase - Dung dịch đệm pH7 - Dung dịch glugol Tiến hành: Chuẩn bị: Dụng cụ Số lượng Ống nghiệm Bếp đun Nồi ( đun cách thủy) Pipep 1ml Pipep 5ml 1 Giá để ống nghiệm Cách tiến hành: ➢ Ở nhiệt độ 30C : - Lấy ống nghiệm • Ống 1: dùng pipep 5ml hút hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào ống nghiệm • Ống 2: dùng pipep 1ml hút 0,1 ml dung dịch amylase pha lỗng cho vào ống nghiệm, sau hút 0,5 ml dung dịch pH cho vào ống nghiệm, lắc - Để hai ống nghiệm ngồi nhiệt độ phịng khoảng phút - Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc Cứ sau phút: nhỏ giọt lugol lên mặt kiếng, sau nhỏ vào giọt hỗn hợp Khi thấy màu xanh khơng xuất dừng lại ➢ Ở nhiệt độ 60C: - Lấy ống nghiệm • Ống 1: dùng pipep 5ml hút hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào ống nghiệm • Ống 2: dùng pipep 1ml hút 0,1 ml dung dịch amylase pha lỗng cho vào ống nghiệm, sau hút 0,5 ml dung dịch pH cho vào ống nghiệm, lắc - Đem ống nghiệm đun cách thủy nhiệt độ 60C khoảng phút - Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc - Cứ sau phút: nhỏ giọt lugol lên mặt kiếng, sau nhỏ vào giọt hỗn hợp Khi thấy màu xanh khơng xuất dừng lại ➢ Ở nhiệt độ 90C: - Lấy ống nghiệm • Ống 1: dùng pipep 5ml hút hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào ống nghiệm • Ống 2: dùng pipep 1ml hút 0,1 ml dung dịch amylase pha lỗng cho vào ống nghiệm, sau hút 0,5 ml dung dịch pH cho vào ống nghiệm, lắc - Đem ống nghiệm đun cách thủy nhiệt độ 90C khoảng phút - Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc - Cứ sau phút: nhỏ giọt lugol lên mặt kiếng, sau nhỏ vào giọt hỗn hợp Khi thấy màu xanh không xuất dừng lại Kết quả: - Ở nhiệt độ phịng ( 30C) nhóm có thời gian thủy giải enzyme amylase 11 phút - Ở nhiệt độ 60C nhóm có thời gian thủy giải enzyme amylase 32 phút - Ở nhiệt độ 90C C nhóm có thời gian thủy giải enzyme amylase phút Nhận xét giải thích: - - - - III 1) Ở nhiệt độ 60C thời gian thủy giải amylase lâu nhiệt độ cao enzyme bị biến tính dẫn đến khả hoạt động nên thời gian thủy phân kéo dài đến 32 phút Ở nhiệt độ 90C thời gian thủy giải amylase nhanh Theo lý thuyết thời gian thủy giải amylase lâu 90C enzyme bắt đầu tác dụng, kết nhóm có với thời gian nhanh thao tác q trình làm thí nghiệm như: nhiệt độ khơng đảm bảo q trình đun, thao tác thí nghiệm nhóm chậm nên nhiệt độ dung dịch giảm dần ( trình trộn dung dịch lại với nhau) sau lấy khỏi bếp đun Ở nhiệt độ 30C thời gian thủy giải amylase tương đối nhanh khoảng nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động mạnh Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Nguyên tắc Hoạt tính enzyme thể vùng pH tương đối hẹp pH tối ưu pH tối ưu số enzyme pepsin 1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0… Mức độ ion hóa enzyme phụ thuộc vào mơi trường Enzyme có hoạt tính cao dạng tích điện dương hay tích điện âm trạng thái đẳng điện 2) Hóa chất • • • Dung dịch tinh bột 1% Dung dịch amylase Dung dịch lugol (KI=2,65g; I2= 0,05g; nước cất vừa đủ 100ml) Tiến hành Lấy ống nghiệm cho vào: • • • Ống nghiệm 1: ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm pH Ống nghiệm 2: ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm pH Ống nghiệm 3: 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm pH Sau cho vào ống nghiệm ml dung dịch enzyme amylase pha loãng Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme ảnh hưởng pH cách xác định thời gian thủy giải amylase (tương tự thí nghiệm 2) Vẽ đường biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải (phút) pH Nhận xét, giải thích Kết Thời gian thủy giải amylase thu ống • Ống 1-pH=4: phút 52 giây • Ống pH=6: phút giây 10 pH=6 pH=6 Ống 3: phút 59 giây pH =8 Vẽ đường biểu diễn biến thiên thời gian thủy giải (phút) pH 11 Nhận xét giải thích • Tại pH=6, thời gian thủy giải amylase ngắn nhất, đồng nghĩa với việc amylase hoạt động mạnh pH=6; pH =4 pH=8, thời gian thủy giải cao suy amylase hoạt động pH • Mỗi enzyme có pH tối ưu riêng, giá trị pH tối ưu enzyme phản ứng mạnh Enzyme amylase có pH tối ưu 5.6-6.9 Vì có hoạt tính mạnh pH=6 IV Ảnh hưởng chất hoạt hóa chất ức chế đến hoạt tính enzyme Chất hoạt hóa chất có khả làm tăng cường tác dụng enzyme Chúng có chất hóa học khác Thí nghiệm ion Cl- α-amylase, glutathion nhiều protease thực vật, cystein nhiều loại enzyme, làm giảm lực enzyme chất làm enzyme khả kết hợp với chất Thí dụ ion Ag2+, Hg2+, Pb2+,… chất ức chế hầu hết enzyme 1) Nguyên tắc: Amylase nước bọt (α-amylase) tăng hoạt động mơi trường có NaCl, ngược lại CuSO4 ức chế tác dụng enzyme Trong ống nghiệm có chứa α-amylase tinh bột Nếu ta cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, nước vào ống thứ sau thời gian tác dụng ta thấy: Ống 1: tinh bột thủy giải hồn tồn Ổng 2: khơng có thủy phân tinh bột Ống 3: tinh bột thủy giải đến dextrin 2) Hóa chất - Dung dịch tinh bột 1% - Dung dịch amylase pha loãng - Dung dịch NaCl 10% - Dung dịch CuSO4 10% 3) Tiến hành: 12 Để pha 1ml dung dịch NaCl 10% ta lấy 0,1ml NaCl 0,9ml nước Lấy ống nghiệm, cho vào: - Ống 1: 0,5ml dung dịch amylase pha loãng 0,5ml NaCl 1% Ống 2: 0,5ml dung dịch amylase pha loãng 0,5ml CuSO4 1% Ống 3: 0,5ml dung dịch amylase pha loãng 0,5ml nước cất Tiếp tục cho vào ống 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, lắc Để ống nhiệt độ phòng khoảng 3-5 phút Sau cho 1-2 giọt thuốc thử lugol iod Nhận xét giải thích Kết : Hình 4: Ba ống nghiệm sau cho thuốc thử lugol - - Nhận xét giải thích Ống 1: Chỉ xuất màu thuốc thử, không xuất màu xanh tím đặc trưng chứng tỏ tinh bột bị enzyme amylase thủy phân hoàn toàn nên cho lugol vào mơi trường có màu lugol Như vậy, xuất NaCl thí nghiệm chất xúc tác đẩy nhanh trình thủy phân tinh bột enzyme amylase nên tinh bột bị thủy phân hồn tồn thời gian ngắn Vì vậy, NaCl chất hoạt hóa Ống 2: Có màu xanh tím chứng tỏ tinh bột khơng bị thủy phân nên cho thuốc thử lugol vào mơi trường có màu xanh tím đặc trưng (Vì nhiệt độ phịng tinh bột có phân tử amylozo dạng xoắn theo kiểu lị xo có lỗ rỗng nên tinh bột hấp thụ iod lugol cho màu xanh tím đặc trưng) Như vậy, xuất CuSO4 13 - thí nghiệm ức chế trình thủy phân tinh bột enzyme amylase Vì vậy, CuSO4 chất ức chế Ống 3: Có màu thuốc thử Tinh bột bị thủy phân phần thành dextrin enzyme amylase cần thời gian để thủy phân tinh bột nên màu xanh tím bị màu dần sau xuất Thời gian diễn phản ứng lâu ống có xảy Vì nước khơng phải chất xúc tác chất ức chế 14 Bài 2: ENZYME BROMELINE Ứng dụng enzyme bromelin làm mềm thịt Bromeline protease có nguồn gốc thực vật Bromeline có nhiều phần khác dứa: quả, chồi, thân, vỏ,… Nguyên tắc: Bromeline enzyme giúp thủy phân protein (có thịt cá) thành axit amin có tác dụng tốt việc tiêu hóa phân giải lượng calo thừa thể Hóa chất: - Nước dứa - Dung dịch enzyme protease - Nước cất Tiến hành: Thịt heo cắt thành lát mỏng giống theo chiều dọc để quan sát sớ thịt Chia thịt làm phần: Dĩa 1: Bổ sung 20 ml nước dứa, ngâm Dĩa 2: Bổ sung 20 ml enzyme protease pha loãng 10 lần, ngâm Dĩa 3: Khơng xử lí (đối chứng), bổ sung 20 ml nước, ngâm Sau giờ, đun nóng thịt đĩa phút 1000C Quan sát, đánh giá so sánh mùi vị, cấu trúc thịt mẫu Thảo luận: 15 a) Kết quả: Hình ảnh thịt trước sau hồn thành thí nghiệm - Dĩa (nước dứa): Thịt có vị chua nhất, dai nhất, mềm, dễ rã - Dĩa (enzyme protease): Thịt có vị chua, thơm, có độ dai - Dĩa (đối chứng): Thịt có vị ngọt, thịt dai b) Nhận xét giải thích: - Dĩa 1: Thịt mềm dứa có enzyme bromelain có khả phân cắt liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành đoạn nhỏ gọi peptide - Dĩa 2: Thịt mềm enzyme protese có tác dụng thủy phân protein có thịt làm mềm cấu trúc thịt - Dĩa 3: Thịt dai, thơm mùi thịt khơng có tác dụng enzyme Kết luận: Enzyme bromeline dứa có tác dụng làm mềm thịt tăng hương vị thơm ngon, ứng dụng rộng rãi chế biến thực phẩm: nhà nấu, cơng nghiệp,… Bên cạnh đó, enzyme protease có tác dụng làm mềm thịt tăng hương vị, có tác dụng 16 thấp enzyme bromline Vì thế, tùy vào mục đích sử dụng, nhu cầu người, công ty mà sử dụng loại enzyme phù hợp để kết tốt BÀI 3: ENZYME PECTINASE ➢ Enzyme Pectinase loại enzyme tìm thấy thành tế bào thực vật Enzyme chuyển hóa pectin thành pectic acid cách xúc tác trình khử ester nhóm methoxyl pectin ➢ Pectinase phần thiếu ngành công nghiệp nước ép trái ứng dụng công nghệ sinh học khác, chúng giúp chất lượng nước ép trong, đồng ổn định sản xuất với quy mơ lớn Chúng cịn sử dụng dinh dưỡng trẻ em, chiết xuất dầu, nước cam đóng hộp, chiết xuất đường từ chà I Xác định hoạt tính pectinase phương pháp so màu 1) Nguyên tắc: Là phương pháp dựa việc so sánh cường độ màu dung dịch nghiên cứu với dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Phương pháp thời gian phương pháp hóa học khác Nguyên tắc phương pháp xác định lượng acid galacturonic tạo nhờ thủy phân enzyme peptinase Cơ chất pectin không tạo kết tủa ZnSO4 2) Dụng cụ hóa chất: ❖ Hóa chất − Dung dịch enzyme pectinase 1% − Dung dịch pectin 1% − Nước cất − Dung dịch ZnSO4 15% − Dung dịch Anthrone 0,2% acid sulfuric đậm đặc 17 ❖ Dụng cụ thí nghiệm − Ống nghiệm − Pipet − Cốc đựng − Máy đo mật độ quang 3) Cách tiến hành: Cho 2ml dung dịch pectin 1% vào ống nghiệm cho 1ml dung dịch enzyme 1%, lắc để nhiệt độ phòng 60 phút Sau 60 phút, thêm 2ml ZnSO4 15% vào ống nghiệm, sau đem lọc qua giấy lọc Dung dịch lọc đem pha loãng lần để làm phản ứng với Anthrone Lấy 5ml dung dịch Anthrone cho vào ống nghiệm, sau cho 2,5ml dung dịch lọc pha loãng, lắc mạnh 10 phút Tiếp tục cho vào nồi cách thủy 70°C/12 phút lấy làm nguội đến nhiệt độ phòng Pha loãng 10 lần tiến hành đo giá trị OD bước sóng X = 585 nm Làm ống nghiệm đối chứng cách thay dung dịch enzyme nước cất tiến hành đo giá trị OD 4) Kết quả: ➢ OD đối chứng = 1,642 ➢ OD thí nghiệm = 1,956 => ΔOD = OD thí nghiệm – OD đối chứng = 0,314 Vậy, ta tính hoạt tính pectinase 0,09636 Với: ➢ OD: mật độ quang dung dịch sau phản ứng bước sóng X = 585nm ➢ M: thể tích dung dịch phản ứng (ml) 18 Sau cho Anthrone vào dung dịch Sau pha lỗng 5) Giải thích kết luận − Một đơn vị hoạt tính pectinase thủy phân pectin điều kiện chuẩn (pH = 3.9 – 4.1, thời gian 60 phút, nhiệt độ 30°C, thủ phân pectin nồng độ 0,66%, mức độ thủy phân 30%) làm biến đổi 1ml pectin thành acid galacturonic − Với kết thu 0,09636, hoạt tính pectinase sau 60 phút biến đổi 0,09636ml pectin thành acid galcturonic II Ứng dụng pestinase nước ép trái Nguyên tắc: Enzyme pectinase nhóm enzyme thủy phân chất pectin, sản phẩm tạo thành acid galacturonic, galactose, methanol Enzyme pectinase sử dụng rộng rãi sản xuất nước để làm tăng tốc độ lọc hiệu suất ép, đồng thời q trình tồn trữ nước khơng bị đục pectin bị lắng trở lại Dụng cụ hóa chất: ❖ Hóa chất: 19 − Nước ép táo − Dung dịch pectinase 1% − Nước cất ❖ Dụng cụ thí nghiệm: − Cốc đựng − Pipet − Ống nghiệm − Bếp đun − Nhiệt kế − Giấy lọc, phễu lọc − Máy xay − Vải lọc Cách tiến hành: - Cân 50g táo, rửa sạch, xay nhuyễn với 100ml nước cất sau lọc lấy dịch - Dùng pipet hút 18ml dịch cho vào ống nghiệm ống khác - Thêm dung dịch pectinase 1% vào ống nghiệm với thể tích ống 0; 0,5; 1; 1,5 2ml - Sau thêm nước cất vào cho ống đủ 20ml - Để tất ống nghiệm 50-550C 60 phút - Sau lọc qua giấy lọc, đem ống nghiệm chứa dịch sau lọc ngâm nước lạnh 10 phút, so sánh độ đục mẫu giải thích Kết nhận xét: Kết quả: 20 Các ống nghiệm sau ủ 50 độ 60 phút lọc Nhận xét: Ở ống 1, dung dịch sau lọc có màu đậm Ở ống 2; 3; 4; quan sát mắt ống có độ gần Các dung dịch ống 1; 2; 3; 4; có khác thời gian chảy qua giấy lọc tốc độ chảy giảm dần từ ống đến ống 3, dung dịch ống 3; 4; có tốc độ chảy qua giấy lọc gần Giải thích: Q trình lọc giúp cải thiện tiêu độ nước ép, sau trình xử lý dịch ép với enzyme pectinase, mạch pectin bị cắt nhỏ từ làm giảm độ nhớt dịch ép (giải thích cho khác thời gian chảy dung dịch qua giấy lọc) Tốc độ chảy ống 3; 4; giải thích kết hợp enzyme chất (enzyme chất kết hợp với theo tỷ lệ, đến ngưỡng định có tăng nồng độ enzyme tốc độ phản ứng không thay đổi) Nước đục hệ huyền phù phần tử rắn (thịt quả) có kích thước nhỏ, nước quả, có mặt hợp chất polyphenol với pectin tạo nên kết tủa không tan Sự có mặt pectinase thúc đẩy nhanh trình phân giải pectin thành phân tử hịa tan từ cải thiện độ dịch ép 21 Kết luận: Enzyme pectinase có ảnh hưởng đáng kể đến việc làm dịch ép táo 22 ...DANH SÁCH THÀNH VIÊN Họ tên MSSV LÊ THỊ MỸ DUYÊN 17125058 LÊ THỊ THÙY DI? ??U 17125042 HUỲNH THỊ TÚ HẢO 17125080 CHẾ MỸ LINH 17125132 NGUYỄN MINH HƯNG 17125105 TRẦN NGỌC... enzyme tác dụng lên chất định Chẳng hạn amylase thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide - Saccharide không cho phản ứng vưới Fehling vị phân tử khơng có nhóm cetose aldehyde... màu đỏ gạch xuất ngày đậm Do Dextrin hỗn hợp polyme đơn vị D- glucose liên kết liên kết glycosidic α- (1 → 4) α- (1 → 6) nên phản ứng với thước thử Fehling cho kết tủa đỏ gạch - Ống nghiệm chứa