XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN BỐ SINH HỌC CỦA PACLITAXEL TỪ CHẾ PHẨM THUỐC TIÊM SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THANH HÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN BỐ SINH HỌC CỦA PACLITAXEL TỪ CHẾ PHẨM THUỐC TIÊM SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THANH HÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN BỐ SINH HỌC CỦA PACLITAXEL TỪ CHẾ PHẨM THUỐC TIÊM SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ MINH TRÍ PGS.TS NGUYỄN THIỆN HẢI TP.HỒ CHÍ MINH, Năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Nguyễn Thanh Hà ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ x MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 PACLITAXEL 1.2 ĐỊNH HƯỚNG CẢI TIẾN CÔNG THỨC BÀO CHẾ THUỐC TIÊM PACLITAXEL 1.3 HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN 13 1.4 KIỂM NGHIỆM THUỐC TIÊM DẠNG DUNG DỊCH ĐẬM ĐẶC VÀ 16 BỘT ĐÔNG KHÔ - KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH 1.5 NGHIÊN CỨU TIỀN LÂM SÀNG 17 1.6 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 Chương KẾT QUẢ 48 3.1 XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ THUỐC 48 TIÊM CHỨA PTX VỚI HAI DẠNG BÀO CHẾ DUNG DỊCH ĐẬM ĐẶC VÀ BỘT ĐÔNG KHÔ PHA TIÊM TRUYỀN 3.2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN 60 ĐỊNH CỦA HAI CHẾ PHẨM NGHIÊN CỨU 3.3 NGHIÊN CỨU THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ PHÂN BỐ SINH HỌC TRONG MỘT SỐ MÔ ĐỘNG VẬT THỬ NGHIỆM 69 iii CỦA HAI CHẾ PHẨM BÀO CHẾ CHỨA PTX SO VỚI CHẾ PHẨM ĐỐI CHỨNG Chương BÀN LUẬN 103 4.1 BÀO CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA PTX DẠNG DUNG DỊCH ĐẬM 103 ĐẶC VÀ BỘT ĐÔNG KHÔ 4.2 TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHẾ PHẨM 107 PHA TIÊM CHỨA PTX 4.3 NGHIÊN CỨU THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC VA ĐÁNH GIÁ 108 PHÂN BỐ SINH HỌC TRONG MỘT SỐ MÔ CỦA HAI DẠNG BÀO CHẾ SO VỚI THUỐC ĐỐI CHỨNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT Chữ viết tắt BCS Tiếng Anh Biopharmaceutical classification Tiếng Việt Hệ thống phân loại sinh system dược phẩm LBMW lecithin: butanol: myvacet: nước CMW capmul: myvacet: nước CyD Cylodextrin HP- β-CyD Hydroxylpropyl-β- Cylodextrin PVP K30 Polyvinylpyrrolidone K30 Polysorbate Polyoxyethylene sorbitan monooleate HPMC Hydroxypropyl methylcellulose API Active Pharmaceutical Ingredients Dược chất FPP Finished Pharmaceutical Product Thành phẩm MTD Maximal tolerated dose Liều dung nạp tối đa LD50 Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% thú thử nghiệm LD100 Lethal Dose 100 Liều gây chết 100% thú thử nghiệm LDo Lethal Dose Liều thử nghiệm AUC Area under curve Diện tích đường cong Tmax Thời gian để đạt nồng độ tối đa Cmax Nồng độ tối đa huyết tương AS Analyst substance Chất chuẩn IS Internal substance Nội chuẩn v HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao M Khối lượng phân tử N Số đĩa lý thuyết k’ Hệ số dung lượng As Hệ số bất đối LLE Liquid–Liquid Extraction Chiết lỏng – lỏng LLOQ Lower Limit of Quantitation Giới hạn định lượng PTX Paclitaxel CAR Carbamazepin DZP Diazepam RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối Rt Retention time Thời gian lưu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn RH Relative humidity Độ ẩm tương đối K/E Kolliphor/ Ethanol Dung dịch K T80/E Tween 80/ Ethanol Dung dịch T A Acid citric vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Giới hạn tạp chất chế phẩm PTX dùng đường tiêm Bảng 1.2 Các yếu tố dung môi tá dược khảo sát bào chế dạng 11 đông khô Bảng 1.3 Một số hệ đệm dùng công thức đơng khơ 12 Bảng 1.4 Tính chất lý hóa số dẫn xuất CyD dược phẩm 14 Bảng 1.5 Một số chế phẩm thuốc tiêm có chứa cyclodextrin 15 Bảng 1.6 Phân loại vùng điều kiện bảo quản 17 Bảng 1.7 Thông số áp dụng thẩm định quy trình định lượng dược 19 chất dịch sinh học Bảng 1.8 Giá trị AUC0-8h Taxol ® tiêm cho chuột với liều 15 mg/kg Bảng 1.9 Giá trị AUC0-8h (µg/g.giờ) PTX hỗn dịch sau tiêm với 23 23 liều 15 mg/kg Bảng 1.10 Giá trị AUC0-12h PTX hỗn dịch sau tiêm liều với 10 25 mg/kg Bảng 2.1 Thông tin thuốc đối chứng 27 Bảng 2.2 Thông tin động vật thí nghiệm 27 Bảng 2.3 Thơng tin chuẩn đối chiếu 27 Bảng 2.4 Hóa chất, dung mơi 28 Bảng 2.5 Trang thiết bị dùng bào chế kiểm nghiệm 29 Bảng 2.6 Tỷ lệ thành phần công thức khảo sát 31 Bảng 2.7 Thành phần công thức bột đông khô khảo sát 32 Bảng 2.8 Điều kiện bảo quản mẫu, đánh giá độ ổn định thời điểm 38 lấy mẫu Bảng 2.9 Liều tiêm thời điểm lấy máu động vật thí nghiệm 40 Bảng 2.10 Liều tiêm thời điểm lấy mẫu mô động vật thí nghiệm 40 vii Bảng 3.1 Kết định lượng PTX (%) dung dịch (S) sau pha ® loãng từ Stragen dung dịch NaCl 0,9% glucose 5% 48 Bảng 3.2 Kết cảm quan hàm lượng PTX (%) dung dịch sau pha loãng 10 lần từ dung dịch đậm đặc NaCl 0,9% 49 Bảng 3.3 Kết cảm quan hàm lượng PTX (%) dung dịch sau 49 pha loãng 10 lần từ dung dịch đậm đặc glucose 5% Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng acid citric đến cảm quan 50 hàm lượng PTX (%) dung dịch sau pha loãng nồng độ trị liệu NaCl 0,9% Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng acid citric đến cảm quan 51 hàm lượng PTX (%) dung dịch sau pha loãng nồng độ trị liệu glucose 5% Bảng 3.6 Kết cảm quan định lượng PTX (%) dung dịch có 52 acid citric sau pha loãng dung dịch NaCl 0,9% glucose 5% Bảng 3.7 Kết cảm quan, pH, hàm lượng PTX, tạp liên quan, nội 53 độc tố, độ vô khuẩn chế phẩm Bảng 3.8 Tỷ lệ PVP K30 sử dụng 54 Bảng 3.9 Kết đánh giá cảm quan dung dịch đậm đặc 55 Bảng 3.10 Kết pH hàm lượng PTX (%) từ công thức khảo 57 sát Bảng 3.11 Kết khảo sát lặp lại lô bột đông khô pha tiêm 58 Bảng 3.12 Kết cảm quan, pH, hàm lượng PTX, tạp liên quan, nội 60 độc tố, độ vô khuẩn chế phẩm bột đông khô Bảng 3.13 Điều kiện sắc ký phương pháp định lượng PTX tạp 58 liên quan Bảng 3.14 Kết thẩm định tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn mẫu thử dung dịch đậm đặc bột đông khô phương pháp định lượng PTX 61 viii Bảng 3.15 Kết độ phương pháp định lượng PTX chế phẩm 62 Bảng 3.16 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng 63 PTX Bảng 3.17 Điều kiện sắc ký phương pháp định lượng tạp chế 63 phẩm Bảng 3.18 Kết thẩm định tính phù hợp hệ thống tạp chuẩn 10- 65 DAP chuẩn PTX phương pháp định lượng tạp Bảng 3.19 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng tạp 66 Bảng 3.20 Kết pH, đồng khối lượng, hàm lượng nước, định 67 lượng tạp liên quan chế phẩm bột đông khô chứa PTX Bảng 3.21 Kết độ ổn định chế phẩm dung dịch đậm đặc bột 68 đông khô pha tiêm truyền chứa PTX điều kiện bảo quản dài hạn Bảng 3.22 Kết độ ổn định chế phẩm dung dịch đậm đặc đông 69 khô pha tiêm truyền chứa PTX điều kiện lão hóa cấp tốc Bảng 3.23 Kết dữ liệu thăm dò liều thử độc tính cấp dung dịch đậm 70 đặc, bột đông khô pha tiêm truyền chứa PTX thuốc đối chứng Anzatax® Bảng 3.24 Kết thẩm định tính phù hợp hệ thống phương pháp 75 định lượng PTX huyết tương thỏ chuột Bảng 3.25 Kết khảo sát khoảng tuyến tính, LLOQ, độ xác 75 độ Bảng 3.26 Kết thẩm định tỷ lệ thu hồi hiệu suất chiết CAR 76 PTX huyết tương thỏ huyết tương chuột Bảng 3.27 Kết thẩm định độ ổn định PTX huyết tương thỏ 77 chuột Bảng 3.28 Kết thẩm định độ ổn định ngắn hạn dài hạn dung dịch chuẩn 77 PL-63 Bảng PL11.27 Số liệu thẩm định tuyến tính mơ phổi Nồng độ AS IS AS/IS Nồng độ PTX xác định từ đường chuẩn (µg/mL) 0,1018 0,509 3985 20014 199058 184788 0,0200 0,1083 0,0903 0,4883 11,338 4,064 1,018 1,527 2,545 5,09 10,18 15,27 20,36 42461 59951 100485 211675 429150 654508 834886 191970 194552 197101 187873 192103 183056 190977 0,2212 0,3081 0,5098 1,1267 2,2340 3,5755 4,3717 0,9972 1,3893 2,2985 5,0798 10,0719 16,1202 19,7099 2,040 9,017 9,684 0,201 1,061 5,568 3,193 PTX thực tế (µg/mL) Diện tích pic Độ lệch (%) u cầu Kết luận Độ lệch ≤ 20% ĐẠT ĐẠT Độ lệch ≤ 15% ĐẠT ĐẠT ĐẠT ĐẠT ĐẠT ĐẠT ĐẠT Độ lệch LLOQ 11,338% nhỏ 20%, điểm khác nhỏ 15% Do chấp Tuyến tính mô bu ồng trứng nhận đường chuẩn mô phổi 6.0 5.0 4.0 3.0 AS/IS y = 0,2567x - 0,025 2.0 1.0 R² = 0,9992 0.0 10 15 20 25 Nồng độ PTX (µg/mL) Hình PL11.6 Đường biểu diễn nồng độ PTX theo tỷ số AS/IS mô buồng trứng Đường chuẩn tuyến tính mơ buồng trứng : y = 0,2567x - 0,025, R = 0,9992 F = 7453 > F (0,05;6) = 5,59 : Phương trình hồi quy tương thích với độ tin cậy 95% ta = 86,33 > t (0,05;6) = 2,37: Hệ số a có ý nghĩa thống kê tb = -0,88 < t (0,05;6) = 2,37: Hệ số b khơng có ý nghĩa thống kê PL-64 Bảng PL11.28 Số liệu thẩm định tuyến tính mơ buồng trứng Diện tích pic Nồng độ PTX thực tế (µg/mL) AS IS AS/IS 0,098 0,48 0,98 2,45 4,9 9,8 14,7 19,6 4012 20456 41436 103379 140396 489848 694962 881872 195680 189063 171041 172689 120222 191844 190002 174322 0,0205 0,1082 0,2423 0,5986 1,1678 2,5534 3,6577 5,0589 Nồng độ PTX xác định từ đường chuẩn (µg/mL) 0,0799 0,4215 0,9437 2,3321 4,5493 9,9469 14,2488 19,7073 Độ lệch (%) 18,50 12,19 3,70 4,81 7,16 1,50 3,07 0,55 Yêu cầu Kết luận Độ lệch ≤ 20% Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Độ lệch ≤ 15% Độ lệch LLOQ 18,50% nhỏ 20%, điểm khác nhỏ 15% Do chấp nhận đường chuẩn mơ buồng trứng Bảng PL10.22 Tính tuyến tính miền giá trị mơ gan, thận, phổi, buồng trứng 2.1.3 Tỷ lệ hồi phục (hiệu suất chiết) Tỷ lệ hồi phục thực mô đồng nhất, chọn nồng độ cao, trung bình, thấp miền giá trị, nồng độ mẫu Định lượng xác định tỷ lệ hồi phục theo tỷ số diện tích pic mẫu sau chiết diện tích pic mẫu chuẩn methanol Bảng PL11.29 Bảng số liệu thẩm định tỷ lệ hồi phục Nồng độ PTX thực tế (µg/mL) Diện tích đỉnh PTX mơ 1,002 41640 41872 43616 40810 44136 Diện tích đỉnh PTX methanol 43192 Trung bình RSD (%) 10,02 Tỷ lệ hồi phục (%) 96,41 96,94 100,98 94,49 102,19 98,20 3,31 455990 492561 444876 102,50 110,72 PL-65 494306 494427 458791 111,11 111,14 103,13 Trung bình RSD (%) 20,04 107,72 4,17 963429 976103 987502 986755 975154 949850 Trung bình RSD (%) 101,43 102,76 103,96 103,89 102,66 102,94 1,01 Quy trình định lượng PTX có tỷ lệ hồi phục khoảng 96,41 - 111,14% RSD tương ứng với mức nồng độ thấp, trung bình, cao 3,3%; 4,17%, 1,01% Đạt yêu cầu (< 15%) 2.1.4 Độ độ xác Độ độ xác thực mơ đồng Chọn nồng độ 20, 10 , µg/mL tương ứng với mức nồng độ cao, trung bình, thấp theo đường chuẩn tuyến tính Mỗi nồng độ mẫu, định lượng ngày để xác định độ độ xác ngày liên ngày PL-66 Bảng PL11.30 Bảng số liệu thẩm định độ độ xác ngày liên ngày Ngày Ngày Nồng độ PTX thực tế (µg/mL) Nồng độ tìm thấy Tỷ lệ hồi phục % % Độ lệch 1,002 1,025 1,026 0,981 1,075 1,056 102,28 102,37 97,95 107,28 105,35 0,74 0,66 4,95 4,11 2,24 2,54 10,470 10,045 10,490 9,992 10,036 103,05 3,44 104,49 100,25 104,69 99,72 100,16 2,14 20,157 19,935 19,421 20,200 19,524 101,86 2,46 97,14 103,58 100,18 96,91 96,83 98,93 2,99 2,39 Trung bình RSD% 10,02 Trung bình RSD% 20,04 Trung bình RSD% 2,58 1,59 2,78 2,10 1,68 1,81 4,70 1,27 2,04 2,12 Ngày Nồng độ PTX thực tế (µg/mL) Nồng độ tìm thấy Tỷ lệ hồi phục % % Độ lệch 1,002 0,971 1,079 1,014 0,981 0,999 96,88 107,66 101,25 97,95 99,69 2,85 8,08 1,58 1,76 0,00 2,85 10,634 10,464 10,515 10,639 10,572 100,69 4,21 106,13 104,43 104,95 106,18 105,51 0,57 19,467 20,758 20,076 19,421 19,404 105,44 0,72 97,14 103,58 100,18 96,91 96,83 98,93 2,99 2,39 10,02 20,04 0,66 0,96 0,47 0,70 0,07 1,81 4,70 1,26 2,04 2,12 Nồng độ PTX thực tế (µg/mL) Nồng độ tìm thấy Tỷ lệ hồi phục % % Độ lệch 0,982 0,849 0,864 0,876 0,880 0,858 86,48 87,96 89,17 89,59 87,39 1,86 0,18 1,19 1,67 0,82 1,14 9,425 9,155 9,349 9,154 9,222 88,12 1,45 95,98 93,23 95,20 93,22 93,91 1,09 19,423 19,160 19,468 19,404 19,289 94,31 1,31 98,89 97,55 99,12 98,80 98,22 98,52 0,64 0,51 9,82 19,64 1,77 1,15 0,95 1,15 0,42 0,38 0,98 0,61 0,29 0,31 PL-67 2.1.5 Giới hạn định lượng (LLOQ) Bảng PL11.31 Bảng số liệu thẩm định độ độ xác nồng độ LLOQ Diện tích pic Thứ tự mẫu AS IS1 4092 3996 4193 3636 3969 3621 174951 172770 172590 168357 167950 166433 Nồng độ AS/IS1 PTX thực tế (µg/mL) 0,0234 0,0231 0,0242 0,0215 0,0236 0,0218 0,1018 Nồng độ PTX tìm thấy (µg/mL) 0,1055 0,1043 0,1095 0,0974 0,1065 0,0981 Tỷ lệ hồi phục % Độ lệch % 103,59 102,43 107,60 95,65 104,66 96,36 3,59 2,43 7,60 4,35 4,66 3,64 2.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH TRÊN CHUỘT 2.2.1 Tính phù hợp hệ thống Bảng PL11.32 Số liệu thẩm định tính phù hợp hệ thống N IS AS Rt Diện tích k’ As 8,257 8,253 721559 720561 0,522 0,521 1,352 1,351 8,256 720345 0,521 8,260 719857 8,257 Diện tích k’ As 10,186 10,189 529557 531612 0,234 0,235 1,065 1,066 1,349 10,185 529973 0,234 1,061 0,522 1,351 10,188 529125 0,234 1,060 720104 0,521 1,348 10,179 532986 0,234 1,057 8,258 720378 0,521 1,354 10,181 530768 0,235 1,064 TB SD 8,257 0,002 720467 587,873 0,521 0,000 1,351 0,002 10.185 0,004 530670 1440,307 0,234 0,001 1,062 0,003 RSD% 0,03 0,08 0,09 0,16 0,04 0,27 0,22 0,32 Đạt Đạt Đạt Yêu cầu Kết luận Rt RSD ≤ 2% Đạt Đạt Đạt 2.2.2 Tính tuyến tính & miền giá trị • Tính tuyến tính mô gan Đạt Đạt PL-68 25 20 Nồng độ PTX 15 10 y = 8,255x - 0,028 R² = 0,999 0 AS/IS Hình PL11.9 Đường biểu diễn nồng độ PTX ( /mL) theo tỷ số AS/IS mơ gan Đường chuẩn tuyến tính mô gan: y = 8,255x – 0,028, R = 0,9996 F = 16127,43 > F (0,05;6) = 5,59 : Phương trình hồi quy tương thích có độ tin cậy 95% Ta = 126,99 > t(0,05;6) = 2,37: Hệ số a có ý nghĩa thống kê Tb = -0,42 < t(0,05;6) = 2.37: Hệ số b khơng có ý nghĩa thống kê Phương trình hồi quy viết lại : y = 8,255x Bảng PL11.33 Số liệu thẩm định tuyến tính mơ gan Nồng độ PTX thực tế ( /mL) 0,1 0,5 2,5 7,5 10 20 Diện tích pic AS IS2 AS/IS2 7605 41621 86294 226993 472521 659646 918720 1761279 696389 728650 778074 766240 749725 713658 743671 731610 0,0109 0,0571 0,1109 0,2962 0,6303 0,9243 1,2354 2,4074 Nồng độ PTX từ đường chuẩn ( /mL) Độ lệch (%) 0,0901 0,4715 0,9155 2,4455 5,2028 7,6302 10,1981 19,8731 9,85 5,69 8,45 2,18 4,06 1,74 1,98 0,63 Yêu cầu Độ lệch ≤ 20% Độ lệch ≤ 15% Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Độ lệch LLOQ 9,85% nhỏ 20%, điểm khác nhỏ 15% Do chấp nhận đường chuẩn mơ gan • Tính tuyến tính mơ thận PL-69 25 20 Nồng độ PTX 15 y = 8,809x - 0,099 10 R² = 0,999 0 0.5 AS/IS 1.5 2.5 Hình PL11.10 Đường biểu diễn nồng độ PTX µg/ mL theo tỷ số AS/IS mơ thận Đường chuẩn tuyến tính mơ thận: y = 8,809x – 0,099, R = 0,9991 F = 7557,78 > F (0,05;6) = 5,59 : Phương trình hồi quy tương thích có độ tin cậy 95% Ta = 86,94 > t(0,05;6) = 2,37: Hệ số a có ý nghĩa thống kê Tb = -1,00 < t(0,05;6) = 2,37: Hệ số b khơng có ý nghĩa thống kê Phương trình hồi quy viết lại : y = 8,809x Bảng PL11.34 Số liệu thẩm định mô thận Nồng độ PTX thực tế ( /mL) Diện tích pic AS 0,1 0,5 2,5 7,5 10 20 9602 47501 86139 226788 452856 691838 863481 1830632 IS2 Nồng độ PTX từ đường AS/IS2 chuẩn ( 775872 751916 719504 758913 767014 764804 776394 803478 0,0124 0,0632 0,1197 0,2988 0,5904 0,9046 1,1122 2,2784 Độ lệch (%) Yêu cầu 9,23 11,35 5,44 5,29 4,02 6,25 2,03 0,35 Độ lệch ≤ 20% /m) 0,1092 0,5567 1,0544 2,6321 5,2008 7,9686 9,7974 20,0704 Độ lệch ≤ 15% Độ lệch LLOQ 9,23% nhỏ 20%, điểm khác nhỏ 15% Do chấp nhận đường chuẩn mơ thận • Tính tuyến tính mơ phổi Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt PL-70 Nồng độ PTX = Hình PL11.11.Đường biểu diễn nồng độ PTX ( /ml) theo tỷ số AS/IS mô phổi Đường chuẩn tuyến tính mơ phổi: y = 8,581x - 0.157, R = 0,9995 F = 10811,38 > F (0,05;6) = 5,59 : Phương trình hồi quy tương thích có độ tin cậy 95% Ta = 103,98 > t(0,05;6) = 2,37: Hệ số a có ý nghĩa thống kê Tb = -1,88 < t(0,05;6) = 2,37: Hệ số b khơng có ý nghĩa thống kê Phương trình hồi quy viết lại : y = 8,581x Bảng PL11.35 Thống kê số liệu tuyến tính mơ phổi Nồng độ PTX thực tế ( /mL) 0,1 0,5 2,5 7,5 10 20 Diện tích pic AS IS AS/IS 726480 711005 756800 755280 748564 746210 765883 778579 9630 52235 92005 257232 458783 677242 887880 1828482 0,0146 0,0735 0,1216 0,3406 0,6129 0,9076 1,1593 2,3485 Nồng độ PTX từ đường chuẩn ( /mL) 0,1137 0,6304 1,0432 2,9225 5,2592 7,7879 9,9479 20,1524 Độ lệch (%) Yêu cầu Kết luận 13,75 Độ lệch ≤ 20% Đạt 26,08 Không Đạt 4,32 Đạt 16,90 Không Đạt 5,18 Độ lệch ≤ 15% Đạt 3,84 Đạt 0,52 Đạt 0,76 Đạt Độ lệch LLOQ 13,75% nhỏ 20%, điểm khác nhỏ 15% 6/8 điểm đạt yêu cầu độ lệch có LLOQ điểm giới hạn Do chấp nhận đường chuẩn mô phổi PL-71 2.2.3 Tỷ lệ phục hồi hiệu suất chiết PTX Bảng PL11.36 Số liệu thẩm định tỷ lệ hồi phục PTX Nồng độ PTX thực tế ( / ) Diện tích pic PTX mơ 87913 86194 81176 85599 84497 Diện tích pic PTX methanol 94028 Trung bình RSD (%) Trung bình RSD (%) 93,50 91,67 86,33 91,04 89,86 90,48 2,95 452783 495493 505672 510683 458416 511713 Trung bình RSD (%) 10 Tỷ lệ hồi phục (%) 88,48 96,83 98,82 99,80 89,58 94,70 5,60 891492 876452 924625 857675 886135 998576 89,28 87,77 92,59 85,89 88,74 88,85 2,76 Quy trình định lượng PTX có tỷ lệ hồi phục khoảng 87,77-99,08%, giá trị nằm khoảng 85-115% RSD tương ứng với mức nồng độ thấp, trung bình, cao 2,95%; 5,60%; 2,76% Đạt yêu cầu độ độ xác nhỏ 15% PL-72 2.2.4 Tỷ lệ phục hồi hiệu suất chiết diazepam (DZP) Bảng PL11.37 Số liệu thẩm định tỷ lệ phục hồi DZP Nồng độ DZP thực tế ( / ) Diện tích pic DZP mơ 735194 732503 716614 714529 711239 Diện tích pic DZP methanol 744378 Trung bình RSD (%) Trung bình RSD (%) 98,77 98,40 96,27 95,99 95,55 97,00 1,53 669682 686157 682317 733949 634394 718819 Trung bình RSD (%) Tỷ lệ hồi phục (%) 93,16 95,46 94,92 102,10 88,26 94,78 5,26 734447 693432 749989 740915 724050 751868 97,68 92,23 99,75 98,54 96,30 96,90 2,99 Quy trình định lượng DZP có tỷ lệ hồi phục khoảng 88,26-102,10%, giá trị nằm khoảng 85-115% RSD tương ứng với mức nồng độ thấp, trung bình, cao 1,53%; 5,26%; 2,99% Đạt yêu cầu độ độ xác nhỏ 15% PL-73 2.2.5 Độ độ xác Bảng PL11.38 Bảng số liệu thẩm định độ độ xác ngày liên ngày Nồng độ PTX thực tế ( g/ml) Nồng độ tìm thấy 0,9871 0,9714 0,9351 0,9889 0,9807 Trung bình RSD% 4,8562 5,4818 5,3358 5,5189 5,1529 Trung bình RSD% 10 Trung bình RSD% 10,0201 10,4338 10,1772 9,5559 10,1030 Ngày Tỷ lệ hồi phục (%) 98,71 97,14 93,51 98,89 98,07 97,26 2,27 97,12 109,64 106,72 110,38 103,06 105,38 5,16 100,20 104,34 101,77 95,56 101,03 100,58 3,19 Độ lệch (%) 1,29 2,86 6,49 1,11 1,93 Nồng độ tìm thấy 0,9497 0,9126 0,9712 0,9136 1,0182 2,88 9,64 6,72 10,38 3,06 5,2589 5,2650 5,4593 5,3558 4,9725 0,20 4,34 1,77 4,44 1,03 10,0245 10,7373 10,0769 10,4507 10,6408 Ngày Tỷ lệ hồi phục (%) 94,97 91,26 97,12 91,36 101,82 95,31 4,63 105,18 105,30 109,19 107,12 99,45 105,25 3,45 100,25 107,37 100,77 104,51 106,41 103,86 3,12 Độ lệch (%) 5,03 8,74 2,88 8,64 1,82 Nồng độ tìm thấy 1,0029 1,0248 1,0152 1,0114 1,0112 5,18 5,30 9,19 7,12 0,55 5,5929 5,5613 5,3505 5,3900 5,0534 0,25 7,37 0,77 4,51 6,41 11,0362 11,3022 11,2157 10,2455 10,2799 Ngày Tỷ lệ hồi phục (%) 100,29 102,48 101,52 101,14 101,12 101,31 0,79 111,86 111,23 107,01 107,80 101,07 107,79 3,99 110,36 113,02 112,16 102,45 102,80 108,16 4,75 Độ lệch (%) 0,29 2,48 1,52 1,14 1,12 11,86 11,23 7,01 7,80 1,07 10,36 13,02 12,16 2,45 2,80 PL-74 2.2.6 Giới hạn định lượng (LLOQ) Bảng PL11.39 Số liệu thẩm định độ độ xác nồng độ 0,1 µg/mL Diện tích pic STT AS IS Nồng độ AS/ISPTX thực tế ( / Nồng độ PTX tìm thấy ) ( 9865 9673 8984 9174 9734 9298 698324 684340 685302 693420 695464 689434 0,0141 0,0141 0,0131 0,0132 0,0140 0,0135 / ) 0,1031 0,1032 0,0957 0,0966 0,1022 0,0984 0,1 TB±SD Tỷ lệ phục hồi (%) 103,11 103,17 95,69 96,57 102,16 98,44 Độ lệch (%) 3,11 3,17 4,31 3,43 2,16 1,56 99,86 ± 3,38 2.3 KẾT QUẢ NỒNG ĐỘ PTX PHÂN BỐ TRONG MÔ THỎ VÀ CHUỘT 2.3.1 Thỏ Bảng PL11.40 Nồng độ PTX mô thỏ sau tiêm thuốc đối chứng Mô Gan Thận Phổi Buồng trứng Thời điểm (giờ) 0,5 Thỏ 10,70 2,46 1,00 0,00 Nồng độ PTX (µg/g) 9,13 9,86 9,45 1,33 1,27 1,70 0,19 0,27 1,05 0,00 0,00 0,00 9,50 1,25 0,70 0,00 8,15 1,47 0,22 0,00 TB 0,5 6,39 1,67 0,99 0,00 5,46 1,02 0,29 0,00 6,25 1,43 0,42 0,00 6,32 1,58 1,05 0,00 5,10 1,14 1,04 0,00 6,80 1,12 0,55 0,00 0,5 8,55 2,21 0,99 0,00 8,47 1,61 0,29 0,00 7,76 1,23 0,42 0,00 8,24 3,12 0,55 0,00 9,19 4,67 0,62 0,00 7,87 3,39 0,75 0,00 0,5 1,79 0,82 0,00 0,00 1,73 0,65 0,76 0,00 1,07 0,88 0,80 0,00 1,43 0,50 0,17 0,00 1,72 0,75 0,15 0,00 1,68 1,31 0,10 0,00 9,90 1,69 0,49 0,00 6,03 1,37 0,57 0,00 8,26 1,68 0,57 0,00 1,53 0,88 0,52 0,00 SD 0,78 0,67 0,45 0,00 0,50 0,33 0,37 0,00 0,43 0,49 0,37 0,00 0,40 0,12 0,45 0,00 PL-75 Bảng PL11.41 Nồng độ PTX mô thỏ sau tiêm dung dịch đậm đặc Mô Gan Thận Phổi Buồng trứng Thời điểm (giờ) 0,5 0,5 0,5 0,5 Thỏ 14,49 6,70 1,78 0,00 10,91 4,80 2,46 0,00 7,11 3,12 2,04 0,00 1,43 0,50 0,17 0,00 Nồng độ PTX (µg/g) 17,60 12,25 18,45 6,25 5,44 6,70 1,72 1,69 1,72 0,00 0,00 0,00 11,49 9,74 9,95 4,41 4,93 4,58 2,04 1,85 2,00 0,00 0,00 0,00 9,39 8,06 8,24 4,67 3,39 3,12 1,62 2,21 2,04 0,00 0,00 0,00 1,72 1,68 1,43 1,65 1,31 0,50 0,15 0,10 0,17 0,00 0,00 0,00 15,60 12,10 6,25 5,44 1,70 1,69 0,00 0,00 10,5 9,80 4,14 4,87 2,04 1,95 0,00 0,00 9,19 7,87 4,67 3,39 1,62 2,21 0,00 0,00 1,72 1,68 1,65 1,31 0,15 0,10 0,00 0,00 TB SD 14,78 6,13 1,73 0,00 10,71 4,71 2,12 0,00 8,19 3,72 1,96 0,00 1,61 1,15 0,14 0,00 2,69 0,64 0,04 0,00 0,89 0,27 0,31 0,00 1,14 0,83 0,30 0,00 0,16 0,59 0,03 0,00 2.3.2 Chuột Bảng PL11.42 Nồng độ PTX mô chuột sau tiêm thuốc đối chứng Mô Gan Thận Phổi Thời điểm (giờ) Nồng độ PTX (µg/g) 55,60 63,58 57,81 33,86 52,99 48,00 24,46 24,15 32,36 11,54 13,51 15,25 4,18 9,70 10,85 0,27 0,01 0,04 TB SD (%) 55,74 47,78 30,73 13,44 6,24 0,38 61,69 49,81 23,80 14,76 7,07 0,29 58,70 45,65 27,32 13,27 7,26 0,17 3,2 6,9 3,7 1,7 2,5 0,2 0,5 Chuột 57,77 41,43 28,40 11,09 5,54 0,03 0,5 25,52 14,40 8,72 6,86 1,89 0,27 21,03 13,81 7,13 4,61 3,33 0,42 21,47 16,34 11,17 6,76 4,03 0,55 23,30 14,65 13,12 4,54 4,63 0,78 19,19 11,34 9,25 5,43 2,81 0,50 18,69 14,32 10,80 4,13 3,02 0,19 21,53 14,14 10,03 5,39 3,29 0,45 2,6 1,6 2,1 1,2 1,0 0,2 0,5 12,05 10,02 6,38 2,85 13,06 10,58 6,59 3,27 12,44 9,97 7,44 3,47 11,09 9,96 5,60 4,15 12,17 8,56 7,49 2,23 13,10 9,66 5,85 4,91 12,32 9,79 6,56 3,48 0,7 0,7 0,8 0,9 PL-76 2,10 0,46 3,31 0,25 1,60 0,39 1,67 0,24 1,30 0,26 2,17 0,31 2,03 0,32 0,7 0,1 Bảng PL11.43 Nồng độ PTX mô chuột tiêm dung dịch đậm đặc Mô Gan Thận Phổi 0,5 Nồng độ PTX (µg/g) Chuột 54,71 62,27 66,11 61,74 55,37 51,76 49,06 54,52 57,84 55,59 28,53 36,10 24,16 33,92 32,49 15,05 22,94 13,83 18,74 17,32 6,01 9,66 6,88 13,47 11,41 0,19 0,15 0,17 0,09 0,19 64,62 56,40 31,35 14,44 7,23 0,17 60,80 54,20 31,09 17,05 9,11 0,16 4,7 3,2 4,2 3,4 2,9 0,0 0,5 21,84 14,53 9,26 6,33 3,00 0,49 20,02 14,59 9,98 5,13 2,50 0,53 21,66 14,71 9,78 6,69 3,73 0,19 19,53 15,30 10,06 4,61 3,03 0,28 15,18 13,66 10,80 4,21 2,89 0,24 16,58 14,86 12,02 8,12 4,53 0,27 19,14 14,61 10,32 5,85 3,28 0,33 2,7 0,5 1,0 1,5 0,7 0,1 0,5 13,64 9,90 7,92 4,00 1,86 0,52 13,94 10,41 7,78 3,75 2,79 0,75 14,58 10,70 6,53 3,22 1,67 0,55 12,71 11,98 7,53 2,40 3,27 0,42 12,17 9,95 7,73 4,18 1,30 0,12 12,86 12,69 8,75 5,32 2,04 0,21 13,32 10,94 7,71 3,81 2,16 0,43 0,9 1,1 0,7 1,0 0,7 0,2 Thời điểm (giờ) TB SD (%)