tiểu luận thiết bị và ktcnsh

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề:Các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm gây ra những thiệt hại nghiêm trọng như bệnh tật và tử vong, dẫn đến các vấn đề sức khỏe cộng đồng có thể gây ra dịc

TIỂU LUẬN

PHÁT HIỆN VI KHUẨN Bacillus cereus

SINH ĐỘC TỐ GÂY NGỘ ĐỘC Ở SỮABẰNG KĨ THUẬT PCR

Môn: Thiết bị và kĩ thuật công nghệ sinh họcGVHD: Huỳnh Văn Biết

Họ và tên: Đinh Quyền Linh - 21126192

MỤC LỤC

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2: GIỚI THIỆU 3 2.1 Đặc điểm cấu tạo của Bacillus cerues : 4 2.2 Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus 4

2.3 Đặc điểm hình thái Bacillus cereus 4

2.4 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.5 Đặc điểm gen Bacillus cereus 5

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6 3.1 Đối tượng 6 3.2 Vật liệu và hóa chất: 6 3.3 Phương pháp thực hiện nghiên cứu: 7 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: 8

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề:

Các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm gây ra những thiệt hại nghiêm trọng như bệnh tật và tử vong, dẫn đến các vấn đề sức khỏe cộng đồng có thể gây ra dịch bệnh bằng cách làm ô nhiễm thực phẩm ở bất kỳ giai đoạn nào của quá trình từ sản xuất thực phẩm đến tiêu dùng.

1.2Mục tiêu: 

Được biết, sữa tươi nguyên liệu và các sản phẩm của nó là một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh truyền qua thực phẩm liên quan đến Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus, Salmonella spp., Campylobacter spp., Clostridium botulinum Vì sữa là thực phẩm giàu chất dinh dưỡng nên nó có một vị trí rất lớn trong dinh dưỡng của con người Mặc dù sữa trong các tế bào vú khỏe mạnh được báo cáo là vô trùng nhưng hoạt độ nước cao và điều kiện pH trung tính có thể gây ô nhiễm sữa bởi vi sinh vật nếu quy trình sản xuất và điều kiện bảo quản không đảm bảo điều kiện vệ sinh.Việc xác định mầm bệnh từ thực phẩm rất quan trọng để chẩn đoán lâm sàng chính xác và chuẩn hóa trong ngành công nghiệp thực phẩm và giám sát vệ sinh thực phẩm.

1.3 Nội dung thực hiện

Nguồn gốc của Bacillus cereus phân lập và phát hiện ra B.cereus trong sữa tươi.

CHƯƠNG 2: GIỚI THIỆU

2.1 Đặc điểm cấu tạo của Bacillus cereus

B.cereus là vi khuẩn hình que có vỏ tế bào gram dương . Tùy thuộc vào chủng, nó có

thể hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Hầu hết các chủng đều ưa nhiệt độ trung bình , có nhiệt độ tối ưu từ 25 °C đến 37 °C, và ưa trung tính, thích độ pH trung tính, nhưng một số đã được phát hiện phát triển trong môi trường có điều kiện khắc nghiệt hơn nhiều sinh vật kị khí tùy ý là sinh vật tạo ra ATP bằng hô hấp hiếu khí nếu có oxi có khả năng chuyển sang quá trình lên men nếu không có oxi.

2.2 Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus

Phân loại quốc tế B cereus:

• Thuộc giới Bacteria

• Ngành (phylum) Firmicutes • Lớp (class) Bacilli

• Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceae • Chi (genus) Bacillus

2.3 Đặc điểm hình thái Bacillus cereus

 Kích thước tế bào B cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu

có thể tròn hoặc vuông Phần lớn tế bào B cereus thường có khả năng di động nhờ lông

roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động B.cereus có khả năng hình thành nội bào tử Nội bào tử của B cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của

bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng.

Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối Khả năng hình thành

bào tử là đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B cereus nói riêng Nhờ có

đặc điểm này mà B cereus có thể tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi

trường khắc nghiệt nhất Vì vậy, khả năng lây nhiễm B cereus vào thực phẩm trở nên dễ

dàng và nguy hiểm hơn.

2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Là loại vi khuẩn dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường.

∙ B cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng 5 - 50oC, nhiệt độ tốiưu cho sự phát triển của B cereus là 30 - 37oC.

∙ Độ pH biến thiên từ 4,3 – 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,2.

∙ B cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7 – 7,5%,một số chủng

còn có thể chịu được nồng độ 10% ∙ Trên môi trường LB lỏng: đục

Khi nuôi cấy B cereus trên môi trường phân lập MYP trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7 – 7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B cereus có màu hồng eosin do không có quá trình lên men manitol, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng.Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA, khuẩn lạc B cereus có đường kính khoảng 0,4 – 0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép Trên môi trường thạch máu, B cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết Đây là một trong các đặc điểm để phân biệt B cereus với các vi khuẩn khác như B anthracis (không có khả năng sinh ra haemolysin), đây cũng là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B Cereus

2.5 Đặc điểm gen Bacillus cereus

Bản đồ di truyền của chủng B cereus đã chỉ ra rằng kích thước nhiễm sắc thể có thể thay đổi từ 2,4 đến hơn 5,5 Mb Bộ gen dường như có một khu vực liên tục 2,4 Mb và một khu vực ít ổn định.Plasmid đóng một vai trò quan trọng trong sinh học của các loài Bacillus Cùng với các yếu tố di động khác như bacteriophages, chúng cho phép chuyển gen theo chiều ngang giữa các loài thuộc chi này, một lực lượng chính làm thay đổi tính đa dạng di truyền Plasmid thay đổi đáng kể về kích thước và nội dung gen của Bacillus spp và đóng góp rất lớn vào sự biến đổi gen Plasmid tìm thấy trong 5 chủng B cereus với kích thước biểu kiến là 730 kb (ATCC6464), 600 kb (F2038/78), 450 kb (chủng 41), 400 kb (ATCC 33.018) và 290 kb (F4810/72).Mặc dù B anthracis, B cereus và B

thuringiensis được phân biệt theo đặc tính kiểu hình và đặc tính bệnh lý, dữ liệu trình tự bộ gen đã chỉ ra rằng chúng liên quan chặt chẽ, và trình tự gen 16S rRNA của chúng có độ tương đồng hơn 99% Các nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các chỉ thị về nhiễm sắc thể cho thấy không có cơ sở phân loại để chia B cereus và B thuringiensis thành 2 loài riêng biệt, trong khi B Anthracis về cơ bản có thể được coi là một dòng của B.cereus Các đặc điểm phân biệt giữa các loài được mã hoá bởi các gen nằm trên plasmid, được coi là các yếu tố di truyền di động cao, cũng nằm trong nhóm B.cereus.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

-DNeasy Blood & Tissue Kit -10X Taq Buffer với KCl -DNA Taq polymerase

-Thermo Scientific, USA), MgCl2 (IAC, 16S rRNA 4 mM; hblA, hblC, hblD, nheA

Bước 1 Sự tăng sinh vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy

Để kiểm soát dương tính, B cereus (chủng ATCC 11778) có xuất hiện Phương pháp

trải đĩa được áp dụng bằng cách sử dụng thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) để

nuôi cấy vi khuẩn Bacillus cereus Nuôi cấy vi khuẩn được đặt trong tủ ấm ở 37 ° C và để

trong hai ngày ủ Các khuẩn lạc vi khuẩn quan sát thấy sinh sản được phát hiện về mặt hình thái Các khuẩn lạc vi khuẩn được chọn lọc về mặt hình thái được đưa vào môi trường môi trường LB và ủ ở 37°C trong 150 vòng/phút qua đêm Việc phân lập DNA được thực hiện từ các khuẩn lạc nhân lên sau một đêm.

Bước 2.Trích xuất DNA

Mẫu chứa khuẩn lạc vi khuẩn được ủ vào đêm trước khi thu thập bằng cách ly tâm DNeasy Blood & Tissue được áp dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất để phân lập DNA của khuẩn lạc vi khuẩn Sau khi phân lập DNA, mẫu DNA tinh sạch được bảo quản ở -20°C trong đệm rửa giải để tái sử dụng

Bước 3.Phản ứng chuỗi polymerase

Quy trình Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được thực hiện bằng Máy quay vòng nhiệt cảm ứng BIO-RAD C1000 PCR được thực hiện bằng cách tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho từng mồi và phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 25 µl chứa 0,4 (IAC, 16S rRNA) hoặc 0,6 (hblA, hblC, hblD, nheA, nheB/nheC) μM của mỗi mồi, 2,5 μl 10X Taq Buffer với KCl, 1,6 (IAC, 16S rRNA) hoặc 0,4 (hblA, hblC, hblD, nheA, nheB/nheC) mM của mỗi dNTP (Thermo Scientific, USA), DNA Taq polymerase (IAC, 16S rRNA 2,5 U; hblA, hblC, hblD, nheA, nheB/nheC 1 U; Thermo Scientific, USA), MgCl2 (IAC, 16S rRNA 4 mM; hblA, hblC, hblD, nheA, Chuẩn bị 2 µl DNA và nheB/nheC 2 mM).

Các phản ứng trong chu trình PCR như sau: 10 phút ở lần biến tính đầu tiên ở 95°C, sau đó là 94°C trong 60 giây, 50-60°C trong 60 giây (nhiệt độ ủ thay đổi đối với từng

mồi),72°C trong 60 giây và 72°C bước kéo dài cuối cùng là 10 phút sau.

23Hệ thống điện di cung cấp năng lượng Thermo Scientific EC 1000 XL được sử dụng để thực hiện các mẫu DNA Hệ thống hình ảnh BIO-RAD ChemiDOC MP (máy phát tia UV) đã được sử dụng để chụp ảnh các gel nơi các sản phẩm DNA và PCR được vận hành

Các đoạn PCR được chạy trong 30 phút ở điện áp 100 volt trong dung dịch đệm 0,5 x TBE với điện di trên gel agarose 2% được bổ sung ethidium bromide và hiển thị dưới ánh sáng tia cực tím Gel agarose (120 ml 2%) được chuẩn bị để chứa 24 ml 5 x TBE, 96 ml ddH2O, 2,4 g Agarose và 5 µl Ethidium Bromide (10 mg/ml) Trình tự các bộ mồi (IAC-F IAC-R, 16S-(IAC-F 16S-R, 45c1 45c2, nheBC1 nheBC2, HblA1 HblA2, L1a-(IAC-F L1a-R, L2a-F L2a-R

Bảng 1:Thông tin về kích thước dải và trình tự dự kiến của mồi được sử dụng

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả:

Trong nghiên cứu này, các mồi đặc hiệu cho IAC, 16S rRNA, nheA, nheB/nhC, hblA, hblC và các vùng gen hblD được sử dụng để sàng lọc phân tử Bacillus cereus trong các mẫu DNA lấy từ mẫu sữa Với mục đích này, việc xác định Bacillus cereus đã được thực hiện trên 13 mẫu sữa thu thập sử dụng 6 mồi (16S-F 16S-R, 45c1 45c2, nheBC1,BC2, HblA1 HblA2, L1a-F L1a-R nhe, L2a-F L2a-R) đặc hiệu cho các gen độc tố khác

nhau.Đối với tất cả các mồi, thang 50 bp (L), mẫu đối chứng dương tính (PC) và mẫu sữa 1-13 đã được nạp tương ứng vào gel Kiểm soát khuếch đại bên trong (IAC) là DNA không nhắm mục tiêu trình tự được sử dụng để ngăn chặn kết quả PCR âm tính giả và loại bỏ tác dụng ức chế.Nó được khuếch đại theo trình tự mục tiêu và tham gia vào phản ứng tương tự như mẫu Mặc dù thiết kế IAC có thể khác nhau nhưng hướng dẫn chung về sử dụng IAC trong PCR ứng dụng của mầm bệnh đã được đề xuất bởi Tiêu chuẩn Châu Âu Ủy ban Vì lý do này, mồi IAC-F / IAC-R đã được sử dụng trong nghiên cứu này Các kết quả dải của hình ảnh gel của sàng lọc phân tử được thực hiện với các mồi được sử dụng trong nghiên cứu được đưa ra trong bảng 2.

Bảng 2.Kết quả PCR của các mồi sử dụng trong nghiên cứu

4.2 Thảo luận:

Sự khác biệt giữa các phân nhóm có thể được xác định bằng PCR và có thể kết luận nhanh chóng mà không cần làm giàu trước trong các mẫu lâm sàng, đã phát triển PCR đa mồi cho phép phát hiện các plasmid độc lực của B anthracis và có thể phân biệt các

chủng B anthracis có liên quan về mặt di truyền với các loài thuộc nhóm B cereus khác.

Trong này nghiên cứu, các mồi được thiết kế đặc biệt cho vùng gen 16S rRNA đã được sử dụng cho phát hiện phân tử của B cereus.Trong vi sinh thực phẩm, điều quan trọng là phải xác định đặc điểm của các chủng phân lập đáng ngờ về khả năng gây bệnh và nhận dạng loài để xác định độc tính của các chủng phân lập bằng kỹ thuật phân tử.

Trong nghiên cứu này, người ta xác định rằng 62% mẫu sữa được sàng lọc phân tử bằng mồi 45c1 và 45c2 có chứa vùng gen độc nhA của Bacillus cereus Độc tố ruột không tan máu (nhe) gây ngộ độc thực phẩm tại một tổ chức ở Na Uy vào năm 1995 , khiến 152 người mắc bệnh tiêu chảy Hệ thống operon, bao gồm 3 tiểu đơn vị protein, chiếm 90% hoặc hơn trong môi trường nuôi cấy B cereus trong các nghiên cứu sinh học phân tử Trong một nghiên cứu khác, Moravek et al (2004) quan sát thấy rằng các mẫu phân lập từ thức ăn trẻ em dựa trên ngộ độc thực phẩm loại tiêu chảy của B cereus cho dải

kích thước 186 bp trong các nghiên cứu đặc trưng vùng gen của mồi B cereus 45c1 45c2 (nheA) Theo nghiên cứu của chúng tôi, kích thước dải dự kiến của các mẫu bao gồm B cereus đã được xác nhận bằng cách sử dụng mồi 45c1 45c2 trong các mẫu sữa

Dierick và cộng sự (2005) đã sàng lọc tổng cộng 50 chủng khác nhau bằng mồi nheBC1 nheBC12 để phát hiện B cereus bằng phương pháp PCR đặc hiệu cho vùng gen nheB/nheC Trong nghiên cứu này, theo các vùng gen (nheB / nheC), việc sàng lọc kích thước phân tử cho bộ mồi nheBC1 nheBC2 đã thu được trong đó có 8 trong tổng số 13 mẫu được sử dụng.Hbl là một loại độc tố ruột và được mô tả lần đầu tiên vào năm 1984 bằng cách phân lập chủng B cereus F837/76 Phức hợp enterotoxin Hbl có tác dụng tán huyết; bao gồm ba protein lớn được tổng hợp bởi ba gen đa cistronic gồm hblA, hblC và hblD Sàng lọc phân tử trong nghiên cứu này sử dụng mồi L2a-F L2a-R cho thấy 62% trong số 13 mẫu có gen độc B cereus hblC Tương tự, do sàng lọc phân tử bằng mồi L1a-F L1a-R, 8 mẫu sữa được kiểm tra trong nghiên cứu này được phát hiện có vùng gen độc HblD của B cereus.Nghiên cứu này thu được rằng các mẫu sữa chứa các vùng gen độc tố hblC và hblD cũng dương tính với gen hblA Một nghiên cứu khác đã tiến hành nghiên cứu PCR để phát hiện các chủng B cereus phân lập trong các mẫu phô mai và sử dụng gen hblA và bal để phát hiện phân tử Theo kết quả của nghiên cứu, mặc dù sự hiện diện của B cereus thấp trong các mẫu phô mai nhưng tất cả các chủng phân lập đều được phát hiện dương tính với gen mã hóa độc tố ruột.

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 5.1 Kết luận:

Trong nghiên cứu này, việc xác định phân tử được thực hiện bằng phương pháp PCR và

các đoạn mồi đặc hiệu cho các vùng gen của vi khuẩn Bacillus cereus gây ra tác động

tiêu cực trong các mẫu sữa nguyên liệu và sữa tiệt trùng Với mục đích này, 6 mồi (16S-F 16S-R, 45c1 45c2,nheBC1 nheBC2, HblA1 HblA2, L1a-F L1a-R, L2a-F L2a-R) được sử dụng đặc hiệu cho 7 vùng gen độc tố (16S rRNA, nheA, B/nheC, hblA, hblC và hblD)

của vi khuẩn Bacillus cereus được thực hiện sàng lọc phân tử Vi khuẩn Bacillus cereus

được phát hiện ở dạng phân tử trong 13 mẫu sữa được kiểm tra trong nghiên cứu.

Đặc tính vi sinh ở Thổ Nhĩ Kỳ chủ yếu xác định vi sinh vật trong sữa, nhưng các loài được xác định về mặt hình thái không phải lúc nào cũng cho kết quả chính xác Trong nghiên cứu này, vi khuẩn B cereus được phát hiện ở cấp độ phân tử, gây ra các tác dụng phụ như ngộ độc thực phẩm và giảm chất lượng sữa Người ta dự đoán rằng các kết quả thu được và các phương pháp được sử dụng cũng sẽ giúp ích cho các nghiên cứu trong

tương lai để phát hiện B cereus vi khuẩn trong sữa và các sản phẩm từ sữa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Fusco, V., et al., Microbial quality and safety of milk and milk products in the 21st century Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2020 19(4): p 2013-2049 2.Aadil, R.M., et al., Influence of different pulsed electric field strengths on the quality of the grapefruit juice International Journal of Food Science & Technology, 2015 50(10): p 2290-2296

3 Shabbir, M.A., Effect of non-thermal processing techniques on pathogenic and spoilage microorganisms of milk and milk products Food Science and Technology, 2021.41(2): p 279- 294

4 Addis, M.F., et al., The bovine milk microbiota: Insights and perspectives from‐omics studies Molecular Biosystems, 2016 12: p 2359-2372

5 Liu, Z., et al., Evaluation of machine learning models for predicting antimicrobial resistance of Actinobacillus pleuropneumoniae from whole genome sequences Frontiers in microbiology, 2020 11: p 48

6 Burdova, O., et al., Hygiene of pasteurized milk depending on psychrotrophic microorganisms Bulletin-Veterinary Institute In Pulawy, 2002 46(2): p 325-330.