Phép định lượng các chất trong lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC được thẩm định thông qua các chỉ tiêu:
- Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
- Độ lặp lại
- Tính tuyến tính
- Độ đúng
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
2.3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích, mẫu thử …
Các hệ số được sử dụng để đánh giá độ phù hợp của hệ thống là độ phân giải (Rs), độ lệch chuẩn tương đối khi tiêm mẫu lặp lại (RSD) của các đáp ứng phân tích. Tiến hành: tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn.
Yêu cầu: RSD không lớn hơn 2%
2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất.
Độ chính xác được biểu thị bằng RSD. Tiến hành:
- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song.
- Xác định kết quả theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện. - Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
Yêu cầu: RSD ≤ 5%
2.3.4.3. Tính tuyến tính
Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, thường chọn khoảng nồng độ có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích.
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic (hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r.
Tiến hành:
- Chuẩn bị dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng thích hợp. - Tiêm mẫu.
- Tính lại nồng độ chất chuẩn trong các mẫu theo phương trình hồi quy, xác định lại độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ.
Yêu cầu: Hệ số tương quan r > 0,995
2.3.4.4. Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, là tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm lại được so với lượng chất chuẩn đã thêm vào mẫu thử.
Yêu cầu: Độ tìm lại: 95-105%
2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N), tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được.
Tiến hành: Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký sao cho vẫn nằm trong khoảng tuyến tính
- LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3).
- LOQ: là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10).