- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector SPD-20A (có khả năng phân tích UV-VIS trong vùng 190-700nm) của Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội.
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250mm x 4,6 mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15×30mm ID).
- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01mg.
- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, max 124g, d=0,001g.
- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm.
- Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu.
- Máy li tâm Hettich của Đức.
- Nồi đun cách thủy.
- Pipet tự động 1000µl, 100 µl và 10 µl.
- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong, ống ly tâm, phễu lọc, màng lọc …
2.1.3. Hóa chất và thuốc thử
- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic.
- Các hợp chất đã phân lập được từ lá cây Gạo là mangiferin, lupeol, taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7-hydroxysitosterol và daucosterol đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp 7 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong cao lỏng lá cây Gạo.
- Định tính các pic trên SKĐ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối.
- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng 7 hợp chất trên có trong mẫu lá cây Gạo đã thu hái được.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử
Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi xử lý mẫu theo phương pháp ngâm lạnh.
Xác định độ ẩm của bột dược liệu:
Lá sau khi sấy khô, nghiền thành bột khô. Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110oC, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình, đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Chiết xuất:
Cân khoảng 500g dược liệu lá cây (đã xác định độ ẩm trước) được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu dịch chiết, lọc, gộp dịch lọc cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu và cân cắn toàn phần thu
được. Cắn được bảo quản ở 4°C.
Tính hiệu suất chiết:
Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:
X: Hàm lượng (%)
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: Độ ẩm dược liệu (%).
a: Khối lượng cắn toàn phần thu được (g).
Pha dung dịch thử:
Lấy chính xác khoảng 0,5g cắn toàn phần, hòa tan hoàn toàn trong methanol định mức thành 25ml dung dịch, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC.
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)
2.3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được
- Chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích.
2.3.2.2. Pha các dung dịch đối chiếu gốc
Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên tôi quyết định chọn methanol làm dung môi để pha dung dịch chuẩn.
Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chế được, cho vào bình định mức 25ml, thêm vừa đủ methanol, lắc đều cho tan hoàn toàn. Dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn.
Cột sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần trong cây gạo, tôi thấy các phương pháp đều sử dụng sắc ký pha đảo. Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến với nhiều tính ưu việt. Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này.
Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID).
Pha động:
Là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
Qua nghiên cứu tính chất lí hóa của các chất và nghiên cứu một số tài liệu tham khảo, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, acid formic, nước. Tiến hành khảo sát với chế độ gradient dung môi giữa 2 kênh là
A: acid formic 0,1% trong acetonitrile B: acid formic 0,1% trong methanol
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích
Phép định lượng các chất trong lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC được thẩm định thông qua các chỉ tiêu:
- Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
- Độ lặp lại
- Tính tuyến tính
- Độ đúng
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
2.3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích, mẫu thử …
Các hệ số được sử dụng để đánh giá độ phù hợp của hệ thống là độ phân giải (Rs), độ lệch chuẩn tương đối khi tiêm mẫu lặp lại (RSD) của các đáp ứng phân tích. Tiến hành: tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn.
Yêu cầu: RSD không lớn hơn 2%
2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất.
Độ chính xác được biểu thị bằng RSD. Tiến hành:
- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song.
- Xác định kết quả theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện. - Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
Yêu cầu: RSD ≤ 5%
2.3.4.3. Tính tuyến tính
Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, thường chọn khoảng nồng độ có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích.
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic (hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r.
Tiến hành:
- Chuẩn bị dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng thích hợp. - Tiêm mẫu.
- Tính lại nồng độ chất chuẩn trong các mẫu theo phương trình hồi quy, xác định lại độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ.
Yêu cầu: Hệ số tương quan r > 0,995
2.3.4.4. Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, là tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm lại được so với lượng chất chuẩn đã thêm vào mẫu thử.
Yêu cầu: Độ tìm lại: 95-105%
2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N), tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được.
Tiến hành: Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký sao cho vẫn nằm trong khoảng tuyến tính
- LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3).
- LOQ: là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10).
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC.
- Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel.
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN
3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu:
Lấy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của mẫu dược liệu đem xác định độ ẩm. Kết quả thu được tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Độ ẩm mẫu dược liệu
Thứ tự Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm (%)
1 2,0054 4,28
2 2,1031 4,43
3 2,0062 4,46
Trung bình 2,0382 4,39
3.1.2. Hiệu suất chiết
Khối lượng cắn toàn phần:
Cân 510,36 g dược liệu lá cây Gạo (độ ẩm 4,39%) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu hồi dịch chiết, lọc, gộp dịch lọc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Cắn được cô đến khối lượng không đổi, thu được 21,12g cắn toàn phần, đem bảo quản ở 4ºC.
Hiệu suất chiết:
trong đó: M = 510,36(g) x = 4,39% a = 21,12(g)
Hiệu suất X = 4,33% 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl;
cartridge 15x30mm ID). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25ºC. Sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280 nm để dung hòa khả năng phát hiện của các hợp chất nghiên cứu.
Bắt đầu từ dùng hỗn hợp acetonitril và methanol có thêm acid formic 0,1% với các tỷ lệ khác nhau ở chế độ đẳng dòng đều không cho khả năng tách cả 7 chất nghiên cứu hoặc thời gian phân tích quá dài. Do vậy, chúng tôi phải sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol.
Sau khi thử nghiệm với một số chương trình dung môi khác nhau, tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu khác nhau, chúng tôi chọn lựa được một chương trình tương đối phù hợp đủ tách các chất nghiên cứu cũng như các pic khác trong mẫu nghiên cứu được chuẩn bị từ lá cây Gạo. Mặt khác thời gian phân tích không quá kéo dài, là 30 phút cho một lần tiêm mẫu. Điều kiện sắc ký chúng tôi xác định được với điều kiện cột sẵn có ở trên như sau:
Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol. Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (35:65) ở phút thứ 10, rồi thay đổi tuyến tính đạt tới A–B (40:60) ở phút thứ 15, tiếp tục thay đổi tuyến tính tới A–B (45:55) ở phút thứ 25, thay đổi tuyến tính trở về pha động A–B (40:60) ở phút thứ 27 và thay đổi tuyến tính về lại tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
Tốc độ dòng là 1,0ml/phút và thể tích tiêm mẫu là 10 μL. Các SKĐ thu được như ở hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 7 chất nghiên cứu
Hình 3.2. SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo.
Tiến hành sắc ký với từng hợp chất nghiên cứu (hình 3.3 đến hình 3.9) và so sánh với SKĐ thu được của hỗn hợp 7 hợp chất mangiferin, daucosterol, 7- hydroxysitosterol, lupeol, taraxeryl acetat, stigmasterol và taraxerol xác định được thời gian lưu của các chất lần lượt là 4,418; 7,121; 9,509; 12,136; 15,174; 18,025 và 25,046 phút.
Như vậy, qua quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký như sau để định lượng 7 chất: mangiferin, daucosterol, 7-hydroxysitosterol, lupeol, taraxeryl acetat, stigmasterol và taraxerol:
- Cột: Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID), nhiệt độ 25º.
- Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol. Tỷ lệ kênh A- B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (35:65) ở phút thứ 10, rồi thay đổi tuyến tính đạt tới A–B (40:60) ở phút thứ 15, tiếp tục thay đổi tuyến tính tới A–B (45:55) ở phút thứ 25. Thay đổi tuyến tính trở về pha động A–B (40:60) ở phút thứ 27 và thay đổi tuyến tính về lại tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
- Detector SPD-20A với λ = 280 nm.
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 10 μL.
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU Các chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thực hiện chương trình sắc ký như mục 3.2, thu được SKĐ của 7 hợp chất như ở hình 3.3 đến hình 3.9.
Hình 3.4. SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo
Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo
Hình 3.7. SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo
Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo
Các SKĐ ở các hình 3.3 đến hình 3.9 cho thấy cả 7 hợp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp chất
này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên do lượng các hợp chất phân lập được còn ít và chưa đủ thời gian cho phép thiết lập chất chuẩn, chúng tôi tạm dùng chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng trong lá cây Gạo.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ
Định tính được tiến hành bằng so sánh phổ khối lượng của các pic cùng thời gian lưu trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Phổ khối lượng để nhận dạng các pic được đo với chế độ: ESI+ với tốc độ khí phun là 3l/phút, tốc độ khí làm khô là 15l/phút, nhiệt độ CDL là 250oC, nhiệt độ của heat block là 400oC, vùng quét m/z là 100-1000. Thế phá mảnh +4,5 kV.
Phổ khối lượng của các pic tương ứng thu được như ở các hình 3.10-3.16.
Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với pic của 7-hydroxysitosterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxeryl acetat trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.15. Phổ khối lượng ứng với pic của stigmasterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.16. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxerol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Kết quả hoàn toàn phù hợp giữa phổ khối lượng của các pic tương ứng với từng chất trên SKĐ hỗn hợp 7 chất nghiên cứu và mẫu thử là dịch chiết toàn phần chuẩn bị từ lá cây Gạo. Ngoài pic của 7 hợp chất nghiên cứu, trên SKĐ của mẫu thử chuẩn bị từ lá cây Gạo còn xuất hiện thêm 2 pic khác ở khoảng 20,0 phút và 22,8