2.1.1 Nguyên vật liệu
Nội tạng cá Nóc (trứng, gan, ruột) thu mua ở Nha Trang – Khánh Hòa được bảo quản đông lạnh.
Hình 2.1. Nội tạng cá Nóc được mổ lấy ra để đem đi xử lí
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
a. Thiết bị
- Máy xay GL-1903
- Bể điều nhiệt BÜCHI 461 water bath
- Máy cất quay Buchi RE111 Rotavapor Evaporator - Bơm hút chân không model DOA-P504-BN - Cân phân tích (Sartorius, d = 0,1 mg, Đức) - Cân kĩ thuật
- Máy sắc kí lỏng khối phổ Thermo Scientific TSQ quantum Ultra
b. Dụng cụ
Xử lí, chiết và làm giàu mẫu bằng chiết pha rắn (SPE) để có thể định lượng hàm lượng TTX trong mẫu cá Nóc
- Bình định mức
- Màng lọc Satorius RC 0,45 µm
- Máy đo pH (Cyber Scan 500, Singapore) - Bơm tiêm cho HPLC
- Cột: Alltech Apollo C8 (25 cm x 4,6mm; 5µm) - Cột Zorbax 300SB – C3 (25 cm x 4,6mm; 5µm) - Bộ chiết pha rắn, cột chiết pha rắn C18.
c. Dung môi, hóa chất
- Chất chuẩn TTX (Sigma Aldrich, 1mg/lọ, HL: 99%, SKS: 038K1804)
- Nước khử ion
- Acid acetic khan (Merck)
- Dung dịch acid acetic 10% (tt/tt)
o (Pha loãng 100 ml acid acetic khan với nước khử ion thành 1000 ml, lắc đều).
- Dung dịch acid acetic 5% (tt/tt)
o (Pha loãng 50 ml acid acetic khan với nước khử ion thành 1000 ml, lắc đều).
- Amoniac đậm đặc (Merck)
- Dung dịch amoniac 10% (kl/tt) trong nước
o (Pha loãng 100 ml ammoniac đậm đặc với nước khử ion thành 1000 ml, lắc đều).
- Nhựa trao đổi ion cation amoniac acid yếu (nhựa LD152 – NanKai, TianJing, Trung quốc)
- Ethanol 20% (tt/tt)
- Dung dịch acid acetic 0,2% (tt/tt) trong ethanol 20%
o (Pha loãng 2 ml acid acetic khan với ethanol 20% thành 1000 ml, lắc đều).
- Đệm acetat: Dung dịch trong nước cất chứa 15 mM amoni acetate và 15 mM acid acetic.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng quy trình xử lý mẫu.
- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ, khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng Tetrodotoxin bằng sắc lý lỏng khối phổ (LC-MS).
- Đánh giá phương pháp.
- Áp dụng phương pháp để định lượng một số mẫu phủ tạng cá Nóc.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chuẩn bị mẫu 2.3.1. Chuẩn bị mẫu
Bao gồm mẫu chuẩn và mẫu thử:
* Mẫu chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn từ chất chuẩn gốc. * Mẫu thử: bao gồm xử lý mẫu và pha dung dịch mẫu thử.
- Mẫu nội tạng cá Nóc được đem xử lý theo quy trình đã lựa chọn dưới hình 2.2( theo tham khảo tài liệu [11], [16], [22], và trong giới hạn của khóa luận tốt nghiệp dược sĩ nên chúng tôi không trình bày cụ thể các bước xây dựng quy trình xử lí mẫu) thu được dịch chiết TTX.
- Dung dịch thử: dịch chiết thu được từ quy trình xử lý, đem cô cạn qua máy cất quay, thu được cắn. Hòa tan cắn trong 20mL hỗn hợp đệm acetat – Methanol (20 – 80), lọc qua màng lọc 0,45µm.
10g phủ tạng cá nóc H2O khử ion & acid acetic khan Dung dịch ngâm chiết Bã Đun tới 80oC, làm lạnh & Lọc Dịch lọc
Điều chỉnh tới pH 7,5 với d2 amoniac 10%, lọc. Tiến hành qua cột trao đỏi ion
amino (NH2). Rửa giải với d2 acid acetic 10%
Phần có TTX Phần không
có TTX
Điều chỉnh tới pH 8,5 bằng d2 amoniac 10% Tiến hành SPE với cột C-18
Dung dịch trong không có
TTX
Rửa giải với d2 acid acetic 0,2% trongethanol
20%
D2 TTX
2.3.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX
Để xác định điều kiện khối phổ, trước tiên chúng tôi pha dung dịch chuẩn của từng chất trong pha động, sau đó bơm trực tiếp bằng syringe và chạy chương trình Tune để điều chỉnh các thông số khối phổ.
a. Tối ưu hoá điều kiện bắt ion phân tích đối với TTX, mảnh m/z = 320
+ Pha dung dịch TTX 10ppm trong pha động bơm trực tiếp vào máy khối phổ qua syringe chuẩn (Unimetrics 500 L) với tốc độ 5L/phút.
+ Gọi phương pháp Tune Plus để xác định điều kiện khối phổ:
Bước 1: Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm và gọi phương pháp bằng cách: trên cửa sổ Instrument Setup, chọn biểu tượng máy khối phổ LCQ Advantage Max MS sẽ xuất hiện hình máy khối phổ.
Bước 2: Nhắp chuột vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI).
Bước 3: Bơm dung dịch TTX vào hệ thống khối phổ với tốc độ dòng 5 L/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 320.
Bước 4: Nhấp vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune.
Bước 5: Trong ô Mass (m/z), đánh số 320 để Tune cho mảnh 320, và chọn lựa bắn phá mảnh mẹ m/z = 320 thành 4 mảnh con. Máy sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hoá các thông số sao cho bắt mảnh ion mẹ m/z = 320 cùng với các mảnh con tương ứng tốt và nhạy nhất. Quá trình này mất khoảng 5 phút. Sau khi máy đã tự động điều chỉnh, đưa ra điều kiện phù hợp để tín hiệu của mảnh ion mẹ m/z 320 tốt hơn và điều kiện để có các mảnh con tối ưu. Lưu file Tune lại đặt tên là Tune_TTX 10ppm_320-
4_product_ion. LCQTune
b. Thiết lập phương pháp LC-MS cho TTX
Ở phần Instrument Setup, gọi file Tune_TTX10ppm_320-4_product_ion. LCQTune.
Chọn phân tích MS 2 lần (MS/MS), chế độ SRM, lựa chọn mảnh m/z = 320 → 162.
Thiết lập các điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa (+ESI), khí thổi (SG), khí bổ trợ (AG), nhiệt độ hóa hơi, nhiệt độ mao quản, thế ion hóa.
2.3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng TTX
Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký như cột, pha động, tốc độ dòng, điều kiện khối phổ cho chương trình sắc ký LC-MS định lượng TTX.
2.3.4. Đánh giá phương pháp.
- Độ tuyến tính:
Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui (y=ax+b) và hệ số tương quan r.
- Độ lặp lại:
+ Độ lặp lại của hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần.
+ Độ lặp lại kết quả phân tích: Đánh giá thông qua sai số tương đối của kết quả phân tích.
- Độ đúng:
Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng để xác định khả năng tìm lại.
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ.
+ Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không cần thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu trắng. LOD là một thông số của phép thử giới hạn.
Trong đó: S: là độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu trắng b : độ nhạy
+ Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được. LOQ chấp nhận được nếu đạt các điều kiện 1) đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng; 2) pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20%. Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện.
Ngoài ra, giới hạn định lượng còn được xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỉ số S/N = 10.
e. Phương pháp xử lý số liệu
Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel.
Tiến hành thí nghiệm n lần, thu được các kết quả xi là x1, x2, x3…xn. Khi đó: Trung bình các kết quả: n i i x n x 1 _ 1 Độ lệch chuẩn : S = 1 ) ( 1 2 n X Xi n i
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 100 X S
- Phương trình hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:
Y = ax + b Trong đó:
+ Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel. + Hệ số b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel.
- Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel.
(Vào phần mềm này bằng cách chọn biểu tượng của nó trên Desktop, chọn
Insert/Function).
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. CHUẨN BỊ MẪU 3.1.1. Mẫu chuẩn 3.1.1. Mẫu chuẩn
- Chất chuẩn gốc TTX (Sigma Aldrich, 1mg/lọ, HL: 99%, SKS: 038K1804)
- Pha dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là: 20,00ppm; 10,00ppm; 5,00ppm; 1,00ppm; 0,50ppm; 0,25ppm từ chất chuẩn gốc.
3.1.2. Mẫu thử
* Xử lý mẫu như quy trình trên hình 2.2 cụ thể hơn như sau:
- Xử lý, ngâm chiết và lọc
(a). Cắt nhỏ khoảng 10g nội tạng (trứng, gan, ruột) cá nóc, cho vào cốc có mỏ 250mL.
(b). Thêm 30 mL nước khử ion và 30 µL acid acetic khan.
(c). Khởi động thiết bị khuấy trộn và khuấy hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
(d). Lọc và ép, thu lấy dịch lọc trong màu vàng (dịch lọc ngâm chiết đầu).
(e). Thêm 30 mL nước khử ion vào cốc có mỏ và lặp lại quá trình như mô tả ở bước (a), (b), (c) và (d), thu dịch lọc ngâm chiết thứ hai.
(f). Lặp lại tương tự bước (e), thu được dịch lọc ngâm chiết thứ ba.
(g). Gộp các dịch lọc ngâm chiết, đun nóng tới 80oC và duy trì ở nhiệt độ này trong 5 phút. Làm lạnh, lọc, loại bỏ tủa, thu lấy dịch lọc.
- Quá trình làm giàu bằng trao đổi ion và SPE
(a). Điều chỉnh dịch lọc thu được ở bước xử lý trên (bước (g)) tới pH 7,5 bằng dung dịch amoniac 10% (kl/tt).
(d). Sau khi toàn bộ dịch lọc đã chạy qua cột trao đổi ion, rửa cột với nước khử ion cho đến khi không còn protein trong nước rửa.
(e). Rửa giải cột trao đổi ion bằng dung dịch acid acetic 10% (tt/tt), với tốc độ 100 ml/h, để thu dịch TTX.
(f). Gộp dịch TTX thu được.
(g). Điều chỉnh tới pH 8,5 bằng dung dịch amoniac 10% (kl/tt).
(h). Tiến hành SPE với các điều kiện như sau:
- Chất hấp phụ: Chất hấp phụ C-18, cột 1 ml. Hoạt hóa cột với 2 x 1 ml methanol, tiếp theo là 2 x 1 ml dung dịch amoniac pH 8,5.
- Rửa giải: Sau khi cho dịch TTX, rửa cột với 2 x 1 ml dung dịch amoniac pH 8,5, rồi với 2 x 1 ml nước cất. Để cột khô trong không khí 2 phút và rửa giải với 2 x 1 ml dung dịch acid acetic 0,2% trong ethanol 20%.
(i). Gộp dịch TTX thu được.
* Dịch chiết thu được từ quy trình xử lý, đem cô cạn qua máy cất quay, thu được cắn. Hòa tan cắn trong 20mL hỗn hợp đệm acetat – Methanol (20 – 80), lọc qua màng lọc 0,45µm, tiêm sắc ký.
3.2. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ ĐỐI VỚI TTX
Tiến hành các bước như mục 2.3.2 Mảnh ion mẹ m/z = 320
Mảnh ion con m/z = 162
Hình 3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX
3.3. XÂY DỰNG CHƯƠNG TRÌNH SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LS-MS) ĐỂ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG
3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký, sử dụng dung dịch chuẩn TTX 10ppm
a. Điều kiện (A)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 35 – 65
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 400µL/phút
- Thể tích tiêm: 25µL
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 30, AG: 20
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Data\Vat ly\TTX\TTX10ppm RT:0.00 - 10.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 7.69 0.23 0.70 1.18 1.351.70 2.002.142.472.88 3.253.53 4.01 4.434.74 5.215.41 5.916.19 6.59 NL: 1.09E6 TIC M S TTX10ppm TTX10ppm #900RT:7.69A V:1NL:1.09E6 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.26 161.64
Hình 3.2. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký A
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 7,69 phút; tuy nhiên, peak doãng => không phù hợp
b. Điều kiện sắc ký (B)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 20 – 80
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 20, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 1 RT:0.00 - 10.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 7.87 0.04 0.640.861.04 1.39 1.892.142.332.642.78 3.36 3.794.07 4.314.52 5.075.35 5.705.98 6.14 6.48 7.077.23 NL: 5.37E5 TIC M S TTX10ppm1 TTX10ppm1 #918RT:7.84A V:1NL:5.34E5 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.24
Hình 3.3. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký B
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 7,87 phút; tuy nhiên, peak rất doãng => không phù hợp
c. Điều kiện sắc ký (C)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 25 – 75
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL - Điều kiện khối phổ
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 20, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 3 RT:0.00 - 8.76 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 6.30 8.62 0.40 0.801.01 1.32 1.58 1.95 2.09 2.512.762.99 3.35 3.75 4.09 4.504.674.79 5.24 5.46 5.87 NL: 6.76E4 TIC M S TTX10ppm3 TTX10ppm3 #739RT:6.31A V:1NL:6.76E4 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.21
Hình 3.4. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký C
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 6,30 phút; tuy nhiên, peak vẫn rất doãng => không phù hợp
d. Điều kiện sắc ký (D)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 40 – 60
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL - Điều kiện khối phổ
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 25, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 4 RT:0.00 - 9.99 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 6.10 7.87 8.03 8.44 8.80 9.31 1.00 4.59 0.54 3.04 4.78 0.18 1.531.772.08 2.442.70 3.54 4.134.32 5.15 5.59 NL: 4.59E4 TIC M S TTX10ppm4 TTX10ppm4 #711RT:6.08A V:1NL:4.55E4 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0