- Độ tuyến tính:
Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui (y=ax+b) và hệ số tương quan r.
- Độ lặp lại:
+ Độ lặp lại của hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần.
+ Độ lặp lại kết quả phân tích: Đánh giá thông qua sai số tương đối của kết quả phân tích.
- Độ đúng:
Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng để xác định khả năng tìm lại.
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ.
+ Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không cần thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu trắng. LOD là một thông số của phép thử giới hạn.
Trong đó: S: là độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu trắng b : độ nhạy
+ Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được. LOQ chấp nhận được nếu đạt các điều kiện 1) đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng; 2) pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20%. Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện.
Ngoài ra, giới hạn định lượng còn được xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỉ số S/N = 10.
e. Phương pháp xử lý số liệu
Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel.
Tiến hành thí nghiệm n lần, thu được các kết quả xi là x1, x2, x3…xn. Khi đó: Trung bình các kết quả: n i i x n x 1 _ 1 Độ lệch chuẩn : S = 1 ) ( 1 2 n X Xi n i
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 100 X S
- Phương trình hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:
Y = ax + b Trong đó:
+ Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel. + Hệ số b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel.
- Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel.
(Vào phần mềm này bằng cách chọn biểu tượng của nó trên Desktop, chọn
Insert/Function).
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. CHUẨN BỊ MẪU 3.1.1. Mẫu chuẩn 3.1.1. Mẫu chuẩn
- Chất chuẩn gốc TTX (Sigma Aldrich, 1mg/lọ, HL: 99%, SKS: 038K1804)
- Pha dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là: 20,00ppm; 10,00ppm; 5,00ppm; 1,00ppm; 0,50ppm; 0,25ppm từ chất chuẩn gốc.
3.1.2. Mẫu thử
* Xử lý mẫu như quy trình trên hình 2.2 cụ thể hơn như sau:
- Xử lý, ngâm chiết và lọc
(a). Cắt nhỏ khoảng 10g nội tạng (trứng, gan, ruột) cá nóc, cho vào cốc có mỏ 250mL.
(b). Thêm 30 mL nước khử ion và 30 µL acid acetic khan.
(c). Khởi động thiết bị khuấy trộn và khuấy hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
(d). Lọc và ép, thu lấy dịch lọc trong màu vàng (dịch lọc ngâm chiết đầu).
(e). Thêm 30 mL nước khử ion vào cốc có mỏ và lặp lại quá trình như mô tả ở bước (a), (b), (c) và (d), thu dịch lọc ngâm chiết thứ hai.
(f). Lặp lại tương tự bước (e), thu được dịch lọc ngâm chiết thứ ba.
(g). Gộp các dịch lọc ngâm chiết, đun nóng tới 80oC và duy trì ở nhiệt độ này trong 5 phút. Làm lạnh, lọc, loại bỏ tủa, thu lấy dịch lọc.
- Quá trình làm giàu bằng trao đổi ion và SPE
(a). Điều chỉnh dịch lọc thu được ở bước xử lý trên (bước (g)) tới pH 7,5 bằng dung dịch amoniac 10% (kl/tt).
(d). Sau khi toàn bộ dịch lọc đã chạy qua cột trao đổi ion, rửa cột với nước khử ion cho đến khi không còn protein trong nước rửa.
(e). Rửa giải cột trao đổi ion bằng dung dịch acid acetic 10% (tt/tt), với tốc độ 100 ml/h, để thu dịch TTX.
(f). Gộp dịch TTX thu được.
(g). Điều chỉnh tới pH 8,5 bằng dung dịch amoniac 10% (kl/tt).
(h). Tiến hành SPE với các điều kiện như sau:
- Chất hấp phụ: Chất hấp phụ C-18, cột 1 ml. Hoạt hóa cột với 2 x 1 ml methanol, tiếp theo là 2 x 1 ml dung dịch amoniac pH 8,5.
- Rửa giải: Sau khi cho dịch TTX, rửa cột với 2 x 1 ml dung dịch amoniac pH 8,5, rồi với 2 x 1 ml nước cất. Để cột khô trong không khí 2 phút và rửa giải với 2 x 1 ml dung dịch acid acetic 0,2% trong ethanol 20%.
(i). Gộp dịch TTX thu được.
* Dịch chiết thu được từ quy trình xử lý, đem cô cạn qua máy cất quay, thu được cắn. Hòa tan cắn trong 20mL hỗn hợp đệm acetat – Methanol (20 – 80), lọc qua màng lọc 0,45µm, tiêm sắc ký.
3.2. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ ĐỐI VỚI TTX
Tiến hành các bước như mục 2.3.2 Mảnh ion mẹ m/z = 320
Mảnh ion con m/z = 162
Hình 3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX
3.3. XÂY DỰNG CHƯƠNG TRÌNH SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LS-MS) ĐỂ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG
3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký, sử dụng dung dịch chuẩn TTX 10ppm
a. Điều kiện (A)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 35 – 65
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 400µL/phút
- Thể tích tiêm: 25µL
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 30, AG: 20
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Data\Vat ly\TTX\TTX10ppm RT:0.00 - 10.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 7.69 0.23 0.70 1.18 1.351.70 2.002.142.472.88 3.253.53 4.01 4.434.74 5.215.41 5.916.19 6.59 NL: 1.09E6 TIC M S TTX10ppm TTX10ppm #900RT:7.69A V:1NL:1.09E6 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.26 161.64
Hình 3.2. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký A
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 7,69 phút; tuy nhiên, peak doãng => không phù hợp
b. Điều kiện sắc ký (B)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 20 – 80
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 20, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 1 RT:0.00 - 10.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 7.87 0.04 0.640.861.04 1.39 1.892.142.332.642.78 3.36 3.794.07 4.314.52 5.075.35 5.705.98 6.14 6.48 7.077.23 NL: 5.37E5 TIC M S TTX10ppm1 TTX10ppm1 #918RT:7.84A V:1NL:5.34E5 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.24
Hình 3.3. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký B
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 7,87 phút; tuy nhiên, peak rất doãng => không phù hợp
c. Điều kiện sắc ký (C)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 25 – 75
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL - Điều kiện khối phổ
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 20, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 3 RT:0.00 - 8.76 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 6.30 8.62 0.40 0.801.01 1.32 1.58 1.95 2.09 2.512.762.99 3.35 3.75 4.09 4.504.674.79 5.24 5.46 5.87 NL: 6.76E4 TIC M S TTX10ppm3 TTX10ppm3 #739RT:6.31A V:1NL:6.76E4 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.21
Hình 3.4. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký C
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 6,30 phút; tuy nhiên, peak vẫn rất doãng => không phù hợp
d. Điều kiện sắc ký (D)
- Cột: Zorbax 300SB – C3; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 40 – 60
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL - Điều kiện khối phổ
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 25, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 4 RT:0.00 - 9.99 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 6.10 7.87 8.03 8.44 8.80 9.31 1.00 4.59 0.54 3.04 4.78 0.18 1.531.772.08 2.442.70 3.54 4.134.32 5.15 5.59 NL: 4.59E4 TIC M S TTX10ppm4 TTX10ppm4 #711RT:6.08A V:1NL:4.55E4 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.19
Hình 3.5. Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký D
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 6,10 phút; tuy nhiên, peak bị tù đầu và kéo đuôi => không phù hợp
- Cột: Alltech Apollo C8; 5µm; 250 x 4,6mm - Pha động: đệm acetat – MeOH = 30 – 70
(đệm acetat: dung dịch amoni acetat 15mM, acid acetic 15mM) - Tốc độ dòng: 500µL/phút
- Thể tích tiêm: 10µL - Điều kiện khối phổ
+ Nguồn: ESI+
+ Khí: SG: 20, AG: 10
+ Thế ion hóa: 3200V + Nhiệt hóa hơi: 200oC + Nhiệt độ mao quản: 360oC
+ SRM: 320 → 162 với mức năng lượng CE = 35V
Kết quả: C:\Xcalibur\...\Vat ly\TTX\TTX10ppm 7 RT:0.00 - 14.99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e RT: 6.78 NL: 1.08E5 TIC M S Genesis TTX10ppm7 TTX10ppm7 #794RT:6.78A V:1NL:1.08E5 T:+ c ESI SRM ms2 320.000 [161.500-162.500] 161.5 161.6 161.7 161.8 161.9 162.0 162.1 162.2 162.3 162.4 162.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R ela tiv e Ab un da nc e 162.16
Peak trên sắc ký đồ thu được có thời gian lưu 6,80 phút; peak cân đối, không bị kéo đuôi, thời gian phân tích phù hợp => lựa chọn điều kiện sắc ký (E)
3.4. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS
a, Khảo sát độ thích hợp của hệ thống:
Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn Tetrodotoxin có nồng độ 10ppm trong dung môi pha mẫu, ghi diện tích peak và thời gian lưu. Kết quả được ghi trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
TT Diện tích peak Thời gian lưu
Lần 1 2346060 6,80 Lần 2 2298966 6,77 Lần 3 2356975 6,61 Lần 4 2375268 6,88 Lần 5 2305867 6,92 Lần 6 2335692 6,78 Trung bình 2336471 6.78 RSD (%) 1,26 1.67
=> Hệ thống hoạt động ổn định, đáp ứng yêu cầu về độ thích hợp.
b, Xác định độ tuyến tính của hệ thống:
Để khảo sát độ tuyến tính của hệ thống, chúng tôi tiến hành như sau:
Pha các dung dịch chuẩn 20,00ppm; 10,00ppm; 5,00ppm; 1,00ppm; 0,50ppm; 0,25ppm, tiêm vào hệ thống sắc ký và ghi lại diện tích. Kết quả được ghi trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Nồng độ (ppm) 0,25 0,50 1,00 5,00 10,00 20,00 Diện tích peak 56469 91168 161603 1107050 2336471 5000125 Phương trình hồi quy Y = 250689x – 76658
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ TTX và diện tích peak
=> kết quả khảo sát cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích peak, hệ số tương quan r = 0,999 . Độ tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ khá rộng từ 0,25- 20ppm
c. Độ chọn lọc-đặc hiệu của phương pháp
Sử dụng dung dịch chuẩn 10ppm, dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên, với điều kiện sắc ký (E) đã được khảo sát
Tiến hành tiêm lần lượt dung dịch trắng, chuẩn, thử, ghi lại sắc ký đồ, diện tích peak, thời gian lưu của dung dịch chuẩn, thử
Kết quả: Mẫu trắng không xuất hiện hình ảnh peak và mảnh m/z của TTX, mẫu thử và mẫu chuẩn có xuất hiện hình ảnh peak và mảnh m/z của TTX. Kết quả cho ở sắc ký đồ bên dưới (hình 3.8; 3.9; 3.10). Như vậy phương pháp đáp ứng yêu cầu về độ chọn lọc- đặc hiệu. Phù hợp để định tính và định lượng TTX.
Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng
Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch thử
d. Độ lặp lại của phương pháp
Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp chúng tôi tiến hành trên 6 mẫu thử độc lập, xử lí mẫu như quy trình đã nêu trên, tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn, ghi lại diện tích peak, áp dụng công thức và diện tích peak chuẩn tính được lượng TTX có trong mẫu thử.
Công thức:
Lượng TTX được tính theo công thức
Xµg = C t c t V C S S Trong đó:
Sc, St: diện tích peak trong sắc ký đồ cho bởi dung dịch chuẩn, thử Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn (10µg/mL)
Vt: thể tích pha mẫu thử (mL)
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được ghi ở bảng 3.3 Diện tích peak dung dịch chuẩn: Sc = 2336471 (bảng 3.1)
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp TT mt(g) St mt(µg) Lần 1 10,1 2303249 197.2 Lần 2 10,1 2301875 197.0 Lần 3 10,15 2310914 197.8 Lần 4 10,17 2317748 198.4 Lần 5 10,18 2317798 198.4 Lần 6 10,19 2341007 200.4 Trung bình 198,2 RSD (%) 0,62
Trong 10g mẫu nội tạng cá Nóc, ta xác định được lượng TTX là 198,2 µg. Như vậy, hàm lượng TTX trung bình trong mẫu nội tạng cá Nóc khá cao: 19,8µg/g
Kết quả khảo sát độ lặp lại cho thấy: Độ lệch chuẩn tương đối TTX trong sản phẩm là 0,62 %;. Kết quả này cho phép ta áp dụng chương trình để định lượng TTX.
e. Độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Thêm một lượng chính xác khoảng 20 % chất chuẩn TTX so với lượng TTX có trong mẫu thử. Sau đó tiến hành như mục 3.1, tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn lựa, lặp lại thực nghiệm 6 lần. Dựa vào hàm lượng các hoạt chất đã biết trong mẫu thử, hàm lượng của các chất chuẩn và căn cứ vào diện tích peak trên sắc ký đồ tính được hàm lượng