loài. Do đó, việc xác định hoạt độ của enzym cho phép sơ bộ khẳng định sự có mặt của RNase trong tế bào trứng ếch (Rana rogulosa., Ranidae) ở Việt Nam.
Kết quả xác định hoạt độ RNase trong 4 phân đoạn protein thu được từ hai loại DCTE được tóm tắt trong các bảng sau.
Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ DCTEa
Pđ Pr V, ml Pr, mg HđR HđR% theo các phđ HđRriêng, U/mg TE-1a 5 17,20 45 9,63 2,62 TE-2a 5 20,03 52 11,13 2,60 TE-3a 5 21,85 145 31,05 6,64 TE-4a 5 22,75 225 48,18 9,90
- Nhận xét: HđR và HđRriêng tăng dần từ phân đoạn TE-1a đến TE- 4a. Phân đoạn TE -1a và TE-2a có HđR và HđRriêng gần bằng nhau. Phân đoạn TE-3a và phân đoạn TE- 4a cho HđR và HđRriêng cao hơn nhiều so với 2 phân đoạn TE-1a và TE-2a. Phân đoạn TE-4a cho HđR và HđRriêng cao nhất.HđRriêng
tăng dần theo mức độ (NH4)2SO4 bão hòa.
Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ DCTEb
Pđ Pr V, ml Pr, mg HđR HđR % theo các phđ HđRriêng, U/mg TE-1b 5 10,55 195 16,39 18,48 TE-2b 5 17,10 210 17,65 12,28 TE-3b 5 23,10 285 23,95 12,34 TE-4b 5 25,50 500 42,01 19,60
- Nhận xét: HđR ở ba phân đoạn đầu gần bằng nhau, phân đoạn TE-4b cho HđR và HđRriêng cao nhất. Các phân đoạn đều cho HđRriêng khá cao. Phân đoạn TE-2b và TE-3b có HđRriêng gần bằng nhau.
So sánh kết quả chiết tách và phân bố hoạt độ enzym RNase của trứng ếch trong hai môi trường dd H2SO4 0,25 N và môi trường PBS pH 7,4 ta thấy hoạt độ và hoạt độ riêng enzym trong môi trường baze cao hơn trong môi trường acid. Đặc biệt hoạt độ riêng trong môi trường base cao hơn nhiều môi trường acid. Các phân đoạn dịch chiết trong hai môi trường dd H2SO4 0,25 N
và môi trường PBS đều có hoạt độ và hoạt độ riêng tăng dần theo sự tăng nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa.
3.3.2.Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase từ trứng cóc
- Mục đích: Xác định RNase có trong tế bào trứng cóc (Bufo sp., Bufonidae).
Kết quả xác định hoạt độ RNase trong 4 phân đoạn protein thu được từ hai loại DCTC được tóm tắt trong các bảng sau.
Bảng 3.5 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ DCTCa Phđ V, ml Pr, mg HđR HđR,% theo các phđ HđRriêng, U/mg TC-1a 5 18,85 730 25,39 28,75 TC-2a 5 26,65 760 26,43 28,76 TC-3a 5 30,60 1105 38,43 36,11 TC-4a 5 33,60 280 9,75 8,33
- Nhận xét: HđR và HđRriêng ba phân đoạn đầu gần như nhau trong đó phân đoạn TC -3a cao nhất. HđR và HđRriêng của TC-4a là thấp nhất, thấp hơn nhiều so với ba phân đoạn trước tuy hàm lượng protein của TC-4a cao nhất
trong bốn phân đoạn.
Bảng 3.6 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết
protein nhận được từ DCTCb Phđ V, ml Pr, mg HđR HđR,% theo các phđ HđRriêng, U/mg TC-1b 5 26,05 1260 23,86 48,37 TC-2b 5 33,50 1315 24,91 39,25 TC-3b 5 34,50 2515 47,63 72,90 TC-4b 5 40.70 190 3,6 4,67
Nhận xét: HđR trong hai phân đoạn đầu TC-1b và TC -2b gần như nhau, phân đoạn TC -3b có HđRvà HđRriêng cao nhất. Phân đoạn 4 có HđR và HđRriêng thấp nhất.
So sánh kết quả chiết tách và phân bố hoạt HđR từ trứng cóc trong hai môi trường ta thấy HđR và HđRriêng trong môi trường baze cao hơn môi trường acid. Các phân đoạn dịch chiết trong dd H2SO4 0,25 N và dd PBS pH 7,4 của trứng cóc đều cho kết quả hoạt độ và hoạt độ riêng tăng dần từ phân đoạn (NH4)2SO4 bão hòa 20% đến 60% và ở phân đoạn (NH4)2SO4 bão hòa 60% là cao nhất, đến phân đoạn (NH4)2SO4 bão hòa 80% lại thấp nhất.
BÀN LUẬN
1. Về chiết tách RNase từ trứng ếch và trứng cóc
Trứng đóng vai trò quan trọng trong sinh sản của động vật. Do đó, tổng hợp protein ở tế bào trứng diễn ra rất mạnh mẽ. Dẫn tới, tế bào trứng có hàm lượng protein thường cao hơn các loại tế bào khác trong cơ thể. Điều đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho chiết protein enzym. Tuy nhiên, tế bào trứng có nhiều loại enzym tham gia vào quá trình tổng hợp protein duy trì bộ gen của loài, gây khó khăn cho tinh sạch protein enzym. Ngoài ra, trứng lớp động vật lưỡng cư có vỏ nhầy bao bọc bên ngoài để bảo vệ trứng tốt hơn nhưng cũng gây nhiều tạp hơn trong chiết tách enzym. Trong trứng các loài động vật lưỡng cư còn có các tạp khác như: glucid, lipid màng….
Các nghiên cứu về trứng ếch và trứng cóc ở Việt Nam còn chưa nhiều. Sau khi tìm hiểu tài liệu về các phương pháp mới trong điều trị ung thư, chúng tôi đã tìm thấy hoạt tính gây độc tế bào của RNase có khả năng áp dụng trong điều trị ung thư. Bởi vậy, chúng tôi đã mạnh dạn sử dụng các phương pháp chiết tách enzym ở bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội để tiến hành khảo sát hàm lượng, hoạt độ RNase từ trứng hai loài động vật lưỡng cư là ếch và cóc ở Việt Nam.
Một trong các phương pháp tách enzym truyền thống, bảo vệ được enzym là sử dụng muối trung tính – (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau để kết tủa protein enzym. Phương pháp này ít ảnh hưởng đến cấu trúc enzym. Đặc biệt, (NH4)2SO4 có mức độ hòa tan trong nước cao (720g/l ở 25o
C), ít làm mất hoạt tính enzym, trong nhiều trường hợp còn giúp ổn định enzym mà giá thành lại thấp nên được sử dụng nhiều trong thực nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này có một số nhược điểm như: mất nhiều thời gian, ly
tâm thu tủa protein cần ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp. Mặt khác, mức độ tinh sạch của phương pháp thấp và cần tiến hành loại muối ra khỏi tủa enzym bằng phương pháp thẩm tích hoặc sắc ký lọc gel. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thực tế, trong giới hạn cho phép về thời gian và với mục đích khảo sát ban đầu, chúng tôi đã tiến hành chiết tách RNase bằng kết tủa phân đoạn enzym protein với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau.
Tuy kỹ thuật chiết tách đơn giản, dễ làm, chi phí thấp nhưng chúng tôi cũng đã thu được 16 phân đoạn tủa enzym protein có hàm lượng khác nhau ở bảng 3.1 và bảng 3.2.
2.Về xác định hoạt độ RNase của hai loại trứng ếch và trứng cóc
Như đã trình bày ở phần tổng quan, có nhiều phương pháp xác định hoạt độ enzym. Theo một số nghiên cứu đã tiến hành [7], [8], trong đề tài này chúng tôi xác định hoạt độ RNase bằng cách sử dụng cơ chất đặc hiệu là ARN nấm men mua của hãng Sigma có chất lượng cao.
Enzym có bản chất là protein nên dễ dàng bị biến tính, cần tiến hành đo hoạt độ ngay sau khi chiết tách và tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein enzym. Cơ chất ARN dễ bị thủy phân, có thể thủy phân ngay trước khi tiếp xúc với enzym. Do đó, cần phải chú ý bảo quản ARN trong túi nhôm ở nhiệt độ thấp, chỉ pha cơ chất ngay trước khi đo hoạt độ và thao tác tiến hành nhanh chóng. Để hạn chế khả năng RNase bị ức chế hoạt động, tránh sử dụng các dụng cụ thí nghiệm có ion kim loại nặng.
Sau khi đo hoạt độ của 16 phân đoạn dịch chiết enzym thô đều thu được kết quả chứng minh sự có mặt của RNase. Hoạt độ riêng của RNase từ trứng cóc cho kết quả cao hơn HdRriêng từ trứng ếch. Hoạt độ riêng cao nhất của RNase từ trứng ếch là 19,60 U/mg ở nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa 80% và từ
trứng cóc là 72,90 U/mg ở nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa 60%. Đặc biệt là sự giảm mạnh HdRriêng từ trứng cóc ở nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa 80% so với các nồng độ bão hòa khác. Trong hai môi trường chiết, môi trường đệm PBS pH 7,4 cho HdRriêng cao hơn môi trường acid H2SO4 0,25 N. Do đó, nên tiến hành chiết tách RNase từ trứng ếch và trứng cóc trong môi trường đệm PBS pH 7,4. Nên tách RNase bằng muối (NH4)2SO4 có nồng độ bão hòa cao, bão hòa (NH4)2SO4 80% ở trứng ếch và 60% ở trứng cóc.
3. Về ý nghĩa của nghiên cứu
Ung thư là một trong những căn bệnh điều trị phức tạp nhất. Ung thư có thể điều trị bằng các phương pháp như: phẫu thuật, xạ trị liệu, hóa trị liệu, miễn dịch trị liệu hay các phương pháp khác. Bởi vì, tế bào ung thư là tế bào của cơ thể con người nên nhiều phương pháp điều trị tiêu diệt tế bào ung thư có nguy cơ phá hủy cả những tế bào khỏe mạnh trong cơ thể.
Phương pháp điều trị nhắm đích sử dụng các chất có khả năng tấn công một cách đặc hiệu đối với các tế bào ung thư, giảm thiểu việc gây tổn thương cho những tế bào bình thường của cơ thể. Do đó, giảm bớt được tác dụng phụ khi điều trị. Khả năng phân biệt những tế bào ung thư và tế bào bình thường mở ra hy vọng mới trong điều trị cho bệnh nhân ung thư đặc biệt là ung thư não.
Hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc trên tế bào ung thư là một đặc điểm rất quý của RNase. Amphinase là một loại RNase ở loài ếch (Rana pipiense., Ranidae) có khả năng tìm kiếm, xâm nhập vào tế bào ung thư. Amphinase nhận ra lớp đường đặc thù trên bề mặt tế bào ung thư và bám chặt vào đó, sau đó xâm nhập vào bên trong, thủy phân ARN gây độc tế bào. Hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc và khả năng xâm nhập vào tế bào ung thư ở các vị trí sâu mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư não – một loại ung thư được biết
đến là khó điều trị.
Trong khi đó, các cán bộ Dược học còn ít chú ý tới enzym này. Ở Việt Nam, ếch và cóc là nguồn nguyên liệu phong phú, dồi dào. Bởi vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nguồn Ribonuclease ở hai loài động vật lưỡng cư là ếch và cóc ở nước ta. Nghiên cứu chỉ mang tính khảo sát sơ bộ ban đầu nguồn Ribonuclease và cũng đã thu được những kết quả nhất định. Từ đó, góp phần đưa ra các hướng nghiên cứu ứng dụng RNase để điều trị ung thư ở nước ta trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, đề tài đã thu được một số kết quả sau:
- Đã chiết tách được 16 phân đoạn enzym thô từ tế bào trứng ếch và trứng cóc bằng (NH4)2SO4 có nồng độ bão hoà lần lượt là 20%, 40%, 60%, 80% ở hai môi trường PBS pH 7,4 và môi trường acid H2SO4 0,25 N.
- Các phân đoạn enzym thô thu được trong cả hai loại tế bào trứng ếch và trứng cóc đều có hoạt độ của enzym RNase khác nhau.
- Đã thu được các phân đoạn enzym thô từ tế bào trứng ếch, phân đoạn dịch chiết tách bằng (NH4)2SO4 bão hòa 80% ở môi trường đệm PBS pH 7,4 đạt hoạt độ riêng cao nhất là 19,60 U/mg.
- Đã thu được các phân đoạn enzym thô từ tế bào trứng cóc, phân đoạn dịch chiết tách bằng (NH4)2SO4 bão hòa 60% ở môi trường đệm PBS pH 7,4 đạt hoạt độ riêng cao nhất là 72,90 U/mg.
Đề xuất
- Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát nguồn enzym RNase từ trứng ếch và trứng cóc ở Việt Nam.
- Nghiên cứu giá trị sử dụng, ứng dụng enzym RNase từ trứng ếch và trứng cóc, tiến tới thử nghiệm hoạt tính sinh học của RNase sớm áp dụng vào y học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. La Kỳ Hoàng, Trương Anh (1998), Cẩm nang bài thuốc hay cho các bệnh thường gặp, Nxb Hà Nội, Hà Nội, tr. 845.
2. Nguyễn Hữu Chấn (1983), Enzyme và xúc tác Sinh học, Nxb Y học, Hà Nội.
3. Phạm Thị Trân Châu, Đỗ Ngọc Liên (1972), Enzyme I, II, Đại học Tổng hợp, Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzym, Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, tp Hồ Chí Minh, tr. 67 – 69.
5. Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật, ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng, Luận án Tiến sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 34 – 37, 43 – 46, 53 – 54.
6. Nguyễn Xuân Thắng và cộng sự (2009), Hóa sinh học, Nxb Y học, Hà Nội, tr. 135 – 137, 169 – 172, 190.
7. Nguyễn Văn Thiết (2002), “Nghiên cứu hoạt tính ribonucleolytic của nọc rắn hổ mang”, Tạpchí dược liệu,7(6), tr. 181 – 185. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú (2012), Công nghệ enzym, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 25 – 56.
9. Nguyễn Văn Thiết, Ngô Thị Hải Yến (2003), Một số tính chất đặc trưng của Ribonuclease từ nọc rắn hổ mang đen Việt Nam (Naja naja), Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 515 – 519.
Tiếng Anh
10. A. Illanes (2008), Enzyme Biocatalysis – Principles and Applications,
Springer Science Publishing, p. 58 – 59.
11. Alfacell (2007), “Ranpirnase: Amphibian Ribonuclease A, P-30
Protein – Alfacell”, Drugs in R & D, 8(2), tr. 120 – 124.
12. Ardelt W., Ardelt B. Darzynkiewicz Z. (2009), “Ribonucleases as potential modalities in anticancer therapy”, Eur J Pharmacol, 625, tr. 181–189.
13. Ardelt W., Mikulski S. M., Shogen K. (1991) “Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases”, J Biol Chem, 266, tr. 245–251. 14. Ardelt W., Shogen K., Darzynkiewicz Z. (2008), “Onconase and Amphinase, the Antitumor Ribonucleases from Rana pipiens Oocytes”,
Curr Pharm Biotechnol, 9(3), tr. 215 – 225.
15. Babkina G. T., Vasilenko S. K. (1964), “Nuclease activity of the venoms of Mid- Asia Snakes”,Biokhimiya, 29(2), pp. 268 – 272. 16. Blázuez M., Fominaya J. M., Hofsteenge J. (1996), “Oxidation of
sulfhydryl groups of ribonuclease inhibitor in epithelial cells is sufficient for its intracellular degradation”, J Biol Chem, 271, tr. 18638 –18642.
17. Cuchillo C. M., Nogués M. V., Raines R. T., (2011). "Bovine pancreatic ribonuclease: Fifty years of the first enzymatic reaction mechanism", Biochemistry, 50 (37), tr. 7835 –7841.
18. Dixon M., Webb E. C. (1979), Enzymes, 3rd editon, Longman Group Ltd., New York.
19. Gui-Zhi Cheng, Jian-Yuan Li, [...], and Guang-Xia Shi (2009), “Human ribonuclease 9, a member of ribonuclease A superfamily, specifically expressed in epididymis, is a novel sperm-binding protein”,
Asian J Androl, 11(2), tr. 240 – 251.
20. Haigis M. C., Kurten E. L., Raines R. T. (2003), “Ribonuclease inhibitor as an intracellular sentry”, Nucleic Acids Research, 31, pp. 31024 – 31032.
21. Hamann K. J., Barker R. L., Loegering D. A., Gleich G. J. (1987), “Comparative toxicity of purified human eosinophil granule proteins for newborn larvae of Trichinella spiralis”, J Parasitol, 73, tr. 523–529. 22. Harder J., Schroder J. M. (2002), “RNase 7, a novel innate immune
defense antimicrobial protein of healthy human skin”, JBC, 277(48), pp. 46779 – 467784.
23. Huang H. C., Wang S. C., Leu Y. J., Lu S. C., Liao Y. D. (1998), “The Rana catesbeina rcr gene encoding a cytotoxic ribonuclease: Tissue distribution, cloning, purification, cytotoxicity and active residues for RNase activity”, JBC, 273, pp. 6395 – 6401.
24. Kim J. S., Soucek J., Matousek J., Raines R. T. (1995), “Catalytic activity of bovine seminal ribonuclease is essential for its immunosuppressive and other biological activities”, Biochem J, 308(2), tr. 547–550.
25. Kobe B., Deisenhofer J. (1993), “Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor, a protein with leucine-rich repeats”, Nature, 366, tr. 751–756.
26. Leland P. A., Raines R. T. (2001), “Cancer chemotherapy - Ribonucleases to the rescue”, JBC, 8, pp. 405 – 413.
27. Leland P. A., Schultz W., Kim B. M., Raines R. T. (1998), “RNase A variants with potent cytotoxic activity”, PNAS, 95(18), pp. 10407 – 10412.
28. Liu D., Cardillo T. M., Wang Y., Rossi E. A., Goldenberg D.
M., Chang C. H. (2014), “Trop-2-targeting tetrakis-ranpirnase has