Như đã trình bày ở phần tổng quan, có nhiều phương pháp xác định hoạt độ enzym, trong đề tài này chúng tôi xác định hoạt độ bằng cách sử dụng cơ chất đặc hiệu của RNase là ARN.
ARN + RNase oligonucleotide + RNase
Nguyên tắc: ARN hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Độ hấp thụ (OD260) phụ thuộc vào nồng độ của ARN. Khi có mặt enzym, RNase sẽ thuỷ phân ARN thành các oligonucleotid do đó mật độ quang học tăng lên. Dựa vào sự thay đổi OD260 ta đo được hoạt độ enzym.
Một đơn vị (đv) hoạt độ RNase là lượng RNase xúc tác phản ứng thuỷ phân ARN làm tăng mật độ quang học của dịch phản ứng lên 0,01 đv OD sau thời gian phản ứng là một phút trong những điều kiện xác định.
Sự tăng mật độ quang đo trên máy quang phổ Spectro UV – VIS Double Beam PC Scaning Spectrophotometer UVD – 2960 và được tính theo công thức sau:
A = OD1' (+E) -OD0'' (-E) . k -OD (E)
Trong đó:
khi chưa cho x l dịch enzym vào.
+ OD1' (+E) là độ hấp thụ của dịch hỗn hợp phản ứng tính từ thời điểm sau 1' kể từ khi có x l dung dịch enzym vào dung dịch cơ chất.
+ OD (E) là độ hấp thụ của (3000 – x) l dung dịch đệm sau khi thêm x l dịch enzym vào.
+ k là hệ số hiệu chỉnh: tại thời điểm 0'', giá trị OD260 đã cho chỉ là độ hấp thụ của (3000 -x) l dung dịch cơ chất, giá trị thực của hỗn hợp phản ứng tính tại thời điểm 0'' phải là độ hấp thụ của 3000 l dung dịch cơ chất do
vậy k được xác định như sau: đo OD260 của (3000 -x) l dung dịch cơ chất, kí hiệu là OD0''
S. Sau đó thêm vào x l dung dịch đệm pha cơ chất, giá trị đo được kí hiệu là OD0''
S+buf , khi đó: k = OD0''
S+buf / OD0" S
Hoạt độ riêng của enzym (HđRriêng) được xác định bằng: số đơn vị hoạt độ của enzym/mg protein. Hàm lượng Protein được xác định bằng phương pháp Biuret.
Khi đó hoạt độ enzym RNase được tính theo công thức:
HđR =
,
- Tiến hành:
Pha dung dịch cơ chất: cân 0,02 mg cơ chất pha trong 50 ml dung dịch đệm PBS pH 7,4 hay dung dịch H2SO4 0,25N. Pha loãng dung dịch trên 25 lần bằng dung dịch đệm tương ứng.
Lấy chính xác 0,1ml DC thêm 3ml dung dịch cơ chất ARN. Lắc đều, đo quang sau một phút phản ứng kể từ khi enzym tiếp xúc với cơ chất.
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN