Nghiên cứu nhằm giải quyết các mục tiêu đã đề ra:
- Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa L. acidophilus.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các tá dược lên chất lưọng nguyên liệu cốm.
2.2.1. Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa Lactobacillus acidophilus
- Tạo cốm ướt chứa L. acidophilus bằng phương pháp xát hạt ướt.
- Đánh giá tỷ lệ sống sót của L. acidophilus khi sử dụng các phương pháp làm khô cốm khác nhau và lựa chọn kỹ thuật làm khô cốm phù hợp sao cho vi sinh vật sống sót cao.
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tá dược lên chất lượng nguyên liệucốm. cốm.
19
- Tạo cốm L. acỉdophỉlus với hệ 2 tá dược sữa gầy và Avicel ở các tỷ lệ tá dược khác nhau: (Sữa gầy : Avicel) = (1:9); (2:8); (3:7).
- Đánh giá ảnh hưỏTig của các tỷ lệ tá dược đó lên chất lượng cốm: Tỷ lệ sống sót của vi sinh vật ngay sau đông khô; Tỷ lệ sống sót của vi sinh vật trong quá trình bảo quản; Sự phân bố kích thước trong các mẫu cốm.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.3.1. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng:
Pha môi trường thạch MRS, đun cho tan chảy rồi chia đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5-6 ml, nút kín. Các ống nghiệm được hấp tiệt trùng ở 0,6 atm/30phút. Lấy thạch ra khi còn đang ở trạng thái lỏng đặt theo độ nghiêng thích họp (khoảng 2/3 ống). Khi các ống thạch đã đông, tiến hành cấy giống, ủ ở 3)1^c trong tủ CO2 5% trong 24h. Các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh 5®c. Cứ khoảng 2-3 tuần, giống được cấy truyền 1 lần.
2.3.2. Phương pháp nhân giống:
Pha môi trường MRS lỏng (theo mục 2.1.2), đổ 10 ml MRS lỏng vào ống nghiệm, nút kín, hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm/30phút, để nguội. Tiến hành cấy giống vào ống nghiệm trên. Nuôi cấy 24h trong tủ CO2 5% ở nhiệt
độ37±l°c.
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào:
Pha môi trường MRS lỏng (theo mục 2.1.2), đổ 100 ml MRS lỏng vào bình nón 250 ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 0,6 atm/30phút, để nguội. Sử dụng các ổng nhân giống cấy vào các bình nón chứa MRS lỏng và ủ 19h trong tủ CO2 5% ở nhiệt độ 37±l°c, thu được hỗn dịch tế bào L. acidophilus.
2.3.4. Phương pháp tạo cốm ướt:
> Chuẩn bị hỗn dịch tế bào (theo mục 2.3.2 và 2.3.3) > Chuẩn bị các tá dược sữa gầy, Avicel;
20
o Avicel: hấp tiệt trùng ở 0,6 atm/30phút
o Cân nguyên liệu; (Sữa gầy ; Avicel) = (1:9); (2:8); (3:7).
> Tạo cốm ướt chứa L. acidophilus với hệ 2 tá dược sữa gầy và Avicel
Sữa gây Avicel
Trộn bột kép Dịch lên men chứa
L. acidophilus
Tạo khối ẩm
Xát hạt (Rây 1,5 mm)
Cốm ướt
2.3.5. Phương pháp làm khô cốm ướt:
a. Làm khô bằng phương pháp hong gió trong buồng cấy vó trùng:
Mau cốm ướt được tạo ra sau quá trình xát qua rây ở trên, tiếp tục được làm khô bằng cách hong gió trong buồng cấy vô trùng tại nhiệt độ phòng, thời gian; 2 ngày.
b. Làm khô bằng phương pháp đông khô:
Mầu cốm ướt được làm lạnh trong tủ lạnh sâu (-50 đến -40^C) trong Ih. Sau đó, mẫu được đông khô trong buồng lạnh đông của máy đông khô. Nhiệt độ: - 50°C; áp suất: 0,050 mbar; thời gian: 15h.
Kết thúc quá trình, lấy mẫu ra khỏi máy, bảo quản kín ở 4°c trong tủ lanh.
21
2.3.6. Phương pháp xác định số lương vi khuẩn còn sống theo phương pháp pha loãng liền tục
Chuẩn bị các ống nghiệm, 1 ống chứa 10 ml nước cất, còn lại mỗi ống chứa 9ml nước cất. Hấp tiệt trùng ở 0,6atm/30 phút, để nguội. Lấy Ig mẫu cần đếm số lượng tế bào, pha vào ống 10 ml, lắc đều. Sau đó, hút chính xác Iml dịch ở ống lOml trên, pha loãng vào ống nghiệm thứ 2 (9ml nước cất), lắc đều. Rồi tiếp tục hút chính xác 1 ml dịch ở ống nghiệm thứ 2 vào ống nghiệm thứ 3 (9ml nước cất), lắc đều. Cứ như vậy cho tới ống nghiệm cuối cùng cần pha loãng.
Đổ môi trường MRS thạch (đã hấp tiệt khuẩn) lên trên đĩa petri và để nguội cho thạch đông lại. Nhỏ Iml dịch chứa vi khuẩn trong ống nghiệm cần khảo sát vào các đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên, dàn đều, mỗi nồng độ tiến hành với 3 đĩa. ủ trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37°C; sau 48h đem ra đọc kết quả.
Tiến hành xác định số lượng vi sinh vật sống trên các mẫu: - Cốm ướt.
- Cốm ngay sau khi được làm khô bằng phưong pháp đông khô và phưong pháp hong khô.
- Cốm khô sau thời gian bảo quản 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần ở 4®c.
Tính kết quả: số lượng vi khuẩn còn sống có trong Ig mẫu cần xác định số lượng được tính theo công thức;
A 7 x 10^ + A 8 x 10^ + A 9 x 10^ x = ---
3 Trong đó:
X: số lượng vi khuẩn sống trong Ig mẫu
A7, A8, A9: số lượng khuẩn lạc có trong đĩa petri chứa vi khuẩn ở độ pha loãng 10\ 10^, 10^.
22
2.3.7. Phương pháp xác định hàm ẩm của mẫu:
Hàm ẩm của các mẫu cốm được xác định bằng máy đo hàm ẩm Precisa. Nguyên tắc: Dựa trên sự giảm khối lượng của mẫu thử, biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định.[r
2.3.8. Phương pháp xác định kích thước nguyên liệu cốm:
- Mầu cần xác định kích thước: Các mẫu cốm sau khi đã đông khô. - Đặt chồng bộ rây theo thứ tự cỡ mắt rây giảm dần từ trên xuống dưới: Imm; 0,85mm; 0,71mm; 0,5 mm; 0,25 mm. Các mẫu cốm cần xác định kích thước hạt được cho qua bộ rây trên (theo chiều từ trên xuống dưới). Gõ nhẹ từng rây trong khoảng 30 phút (thứ tự từ trên xuống dưới);
- Xác định khối lượng hạt nằm lại trên mỗi rây, từ đó tính tỷ lệ phần trăm hạt nằm trong mỗi khoảng kích thước.
23
Chương 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.
3.1. Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa L. acidophiỉus
Khi muốn bào chế ra một dạng thuốc, nhà bào chế phải xem xét kỹ lưỡng để lựa chọn phưofng pháp bào chế phù hợp, đánh giá xem ở những giai đoạn nào trong quá trình bào chế hay những tác nhân nào có thể tác động, làm “hỏng” dược chất và các thành phần khác trong công thức bào chế. Đối với quá trình tạo cốm L. acidophilus cũng vậy, bởi L. acidophỉlus rất nhạy cảm với nhiệt độ, khi nhiệt độ tăng thì lưọrng L. acỉdophỉlus chết đi cũng tăng lên. Xem xét giữa tạo cốm L. acidophilus bằng phương pháp xát hạt ướt và phương pháp phun sấy, phương pháp xát hạt ướt có nhiều ưu điểm nổi bật hơn: L. acỉdophỉlus ít chịu ảnh hưởng của nhiệt trong quá trình tạo cốm và chi phí tạo cốm cũng thấp hơn so với phương pháp phun sấy. Chính bởi những ưu
điểm nêu trên mà phương pháp xát hạt ướt được lựa chọn tạo cốm L.
acidophilus trong nghiên cứu này. Muc đích:
• Tạo cốm ướt chứa L. acidophỉlus bằng phương pháp xát hạt ướt.
• Lựa chọn kỹ thuật làm khô cốm phù hợp sao cho tỷ lệ vi khuẩn sống sót cao.
Tiến hành:
• Tạo cốm ướt theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.4 với hệ tá dược (Sữa gầy : Avicel) = 2:8.
• Cốm ướt thu được chia làm 2 phần: 1 phần được hong khô trong buồng cấy vô trùng theo 2.3.5.a và 1 phần được đem đi đông khô theo 2.3.5.b • Đánh giá nguyên liệu cốm thu được ở 2 trường hợp trên (hàm ẩm, số
24
Kẻt quả:
Bảng 3.1 : So sánh ảnh hưởng của 2 kỹ thuật làm khô lên chất lượng nguyên ỉiệu cốm
Tiêu chí đánh giá MI M2
Hàm ẩm 7,79% 2,96%
Số lượng L.acidophỉlus
sống sót < lO^cíìi/g 24,60 X 10^ cfu/g
M2: Mâu được làm khô băng phương pháp đông khô.
Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy: Cùng một mẫu cốm ướt, khi ta áp dụng 2 kỹ thuật làm khô khác nhau thì kỹ thuật đông khô tỏ ra ưu việt hơn.
Xét về hàm ẩm:
Với mẫu M I: Độ ẩm của sản phẩm tương đối cao (xấp xỉ 8%), do khả năng làm khô cốm còn phụ thuộc vào độ ẩm của môi trưòng xung quanh. Nếu độ ẩm môi trường xung quanh càng cao thì cốm thu được có hàm ẩm càng cao.
Với mẫu M2: Quá trình đông khô cốm ướt được thực hiện hoàn toàn trong máy đông khô nên không chịu ảnh hưởng của môi trưòng xung quanh. Hàm ẩm cốm thu được đáp ứng tiêu chuẩn DĐVN4 (< 5,0%).
Xét về số lượng vi khuẩn sổng sót:
Với mẫu M I: LưọTig L. acỉdophỉlus sống sót không quá 10^ cfu/g.
Với mẫu M2: số lượng vi khuẩn còn sống là 24,60 X 10^ cfu/g (đạt yêu cầu theo khuyến cáo của IDF).
25
Điều này có thể giải thích như sau: Khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó nhiệt độ và nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò đáng kể trong việc hạn chế sự sống sót của L. acidophilus.
Khi cốm ướt được làm khô bằng phương pháp hong khô trong tủ cấy vô trùng: L. acidophilus chịu tác động trực tiếp của oxy trong không khí, gây oxy hóa màng tế bào[23]. Thêm vào đó, cốm được làm khô trong điều kiện nhiệt
độ phòng nên L. acidophilus còn bị chịu tác động của nhiệt độ phòng.
Còn đối với mẫu M2: Mầu được làm khô trong chân không ở nhiệt độ thấp, ít chịu ảnh hưỏng của oxy hòa tan và nhiệt độ hơn hẳn so với mẫu kia. Bởi vậy, số lượng vi sinh vật còn sống trong mẫu M2 (đạt giá trị xấp xỉ 10^ cfu/g) cao hơn so với M I.
Qua kết quả của nghiên cứu trên, kỹ thuật đông khô được lựa chọn làm khô cốm ướt cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Nghiên cửu ảnh hưởng của các tá dược lên chất lượng nguyên liệu cốm
Với bất kỳ dạng bào chế nào cũng vậy, sau khi chế phẩm được tạo ra chế phẩm phải được đánh giá chất lượng dựa trên những tiêu chí nhất định. Từ kết quả đánh giá đó, nhà bào chế lựa chọn ra công thức tối ưu cho chế phẩm. Trong phạm vi khóa luận này, kết quả mục 3.1 cho thấy khả năng tạo được nguyên liệu dạng cốm chứa L. acidophilus bằng phương pháp xát hạt ướt với 2 tá dược Avicel và sữa gầy, cốm ướt được làm khô bằng phương pháp đông khô. Sản phẩm thu được có hàm ẩm và số lượng vi khuẩn sổng sót đạt yêu cầu. Để lựa chọn được công thức bào chế cho hàm ẩm và số lượng vi khuẩn sống sót tốt nhất, khóa luận tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ tá dược khác nhau lên một số chỉ tiêu chất lượng cốm.
26
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ tá dược khác nhau lên khả năngsống sót của L. acidophilus trong quá trình đông khô: sống sót của L. acidophilus trong quá trình đông khô:
Muc đích:
• Nghiên cứu khả năng bảo vệ L. acidophilus trong suốt quá trình đông khô của các hỗn hợp tá dược (Avicel và sữa gầy) ở các tỷ lệ khác nhau. Tiến hành:
• Tạo cốm ướt L. acidophilus với hỗn hợp 2 tá dược sữa gầy và Avicel ở
3 tỷ lệ khác nhau: (Sữa gầy : Avicel) = 1:9 (Mầu A); 2:8 (Mầu B); 3:7 (Mầu C) theo 2.3.4. Xác định hàm ẩm các mẫu cốm ướt theo 2.3.7. • Đông khô 3 mẫu cốm theo 2.3.5.b.
• Xác định hàm ẩm các mẫu cốm ngay sau đông khô theo 2.3.7. Xác định
số lượng vi khuẩn sống sót theo 2.3.6 và tính tỷ lệ vi khuẩn sống sót trong các mẫu cốm ngay sau đông khô.
Kẻt quả:
Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của L. acidophilus trong các mẫu A, B, c ngay sau quá trình đông khô được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.1.
Bảng 3.2 ; Sổ lượng vi khuẩn L. acidophilus trong các mẫu trước và
sau đông khô
Mau Thời điểm Sô lượng vi
khuẩn (cfu/g) Hàm ẩm (%)
Tỷ lệ sông sót (%)
Mầu A Trước đông khô 21,14x 10" 42,03 60,31
Sau đông khô 21,19x 10" 3,65
M auB Trước đông khô 2 0 ,8 1 x 1 0 ' 41,76 70,95
Sau đông khô 24,60 X 10^ 2,96
M auC
Trước đông khô 20,93 X 10^ 41,50
84,63
27 40 ^ 35 I a 30 J f 2 5 I I 20 f 10 " 5 0
□ Trước đông khô ■ Sau đông khô
Mầu A Mầu B Mầu c
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng vi khuẩn L. acidophilus
sống trong các mẫu trước và ngay sau đông khô. Nhân xét:
Ngay sau đông khô, mẫu A có hàm ấm 3,65% và tỷ lệ vi smh vật sống sót là 60,31%. Mầu B có hàm ẩm 2,96% và tỷ lệ vi sinh vật sống sót là 70,95%. Mầu c có hàm ẩm 2,17% và tỷ lệ vi sinh vật sống sót ỉà 84,63%.
Như vậy, sau khi đông khô cả 3 mẫu cốm đều đảm bảo về hàm ẩm cho phép (dưới 5,0% theo DĐVN4) và số lượng vi sinh vật sống sót trong Ig cốm khô (đạt yêu cầu theo khuyến cáo của IDF). Kết quả trên cũng cho thấy hàm ẩm các mẫu cốm giảm dần và tỷ lệ vi sinh vật sống sót sau đông khô tăng dần
theo thứ tự mẫu A, mẫu B, mẫu c.
Điều này có thể giải thích dựa trên khả năng bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô của các tác nhân bảo vệ, cụ thể tì*ong nghiên cứu này là sữa gầy và Avicel.
Các tác nhân bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô có thể chia thành 3 nhóm;
28
Nhóm 1; Các chất vừa thấm được qua thành tế bào vừa thấm được qua màng tế bào chất (Glycerol, Me2 SO). Các chất này ngăn chặn tình trạng mất nước quá mức của tế bào và hạn chế hình thành các tinh thể nước đá nội bào.[16
Nhóm 2: Các chất thấm được qua thành tế bào mà không thấm được qua màng tế bào chất (Mono- và disaccharide, amino acid, polymer phân tử thấp như PEG 1000). Các chất này tạo một lóp đệm bảo vệ cơ học cho màng tế bào chất, chống lại quá trình tạo băng ngày càng tăng. [16’
Nhóm 3: Các chất không thấm được qua thành tế bào, chỉ hấp phụ trên bề mặt vi sinh vật (polymer phân tử cao như protein, PEG 6000, Polysaccharides, dextran...). Các chất nhóm này ức chế hình thành băng ngoại bào.[16]
Avỉcel thuộc nhóm các chất bảo vệ không thấm được vào thành tế bào, chúng ở trên bề mặt tế bào, tạo ra 1 lớp ức chế tỷ lệ hình thành tinh thể nước đá, nhờ đó hạn chế được tổn thương vi sinh vật do các tinh thể nước đá gây ra.
Sữa gầy chứa 32,0-35,7% protein; 48,4-54,1% lactose [9].
Điều đó có nghĩa là: Sữa gầy vừa chứa chất có khả năng thấm qua thành tế bào (lactose), tạo lớp bảo vệ giữa thành tế bào và màng tế bào chất, vừa chứa chất không thấm qua thành tế bào tạo lófp bảo vệ bên ngoài (protein). Bởi khả năng ngăn ngừa tổn thương cho tế bào ở cả bên ngoài và bên trong như vậy nên khi lượng sữa gầy tăng lên, hai lớp bảo vệ tế bào được tăng cường, hạn chế được những tổn thương cho tế bào.
Kết quả này tưong đồng với kết quả của tác giả Đặng Thị Thảo (2009) 11], khi tiến hành đông khô vi khuẩn L. acidophilus với sữa gầy 5%, 10%, 15% cũng nhận thấy với nồng độ 15% (nồng độ cao nhất) cho tỷ lệ sống sót của vi khuẩn cao nhất. Tuy nhiên, không phải lượng sữa gầy càng tăng thì khả
29
năng bảo vệ vi khuẩn càng tốt. Ví dụ tác giả Quách Thu Trang (2010) [12] cũng tiến hành đông khô vi khuẩn L. acidophilus với sữa gầy 5%, 10%, 15%, kết quả thu được là: sữa gầy 10% cho tỷ lệ vi khuẩn sống sót cao nhất.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ tá dược khác nhau lên khả năngsống sót của L. acỉdophỉlus trong quả trình bảo quản: sống sót của L. acỉdophỉlus trong quả trình bảo quản:
Muc đích:
• Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn họp tá dược (sữa gầy và Avicel) ở các tỷ lệ khác nhau lên khả năng sống sót của vi khuẩn trong quá trình bảo quản ở 4°c.
Tiến hành:
• Bảo quản các mẫu cốm sau đông khô ở điều kiện 4°c.
• Sau mỗi khoảng thời gian nhất định, xác định hàm ẩm các mẫu cốm; xác định số lượng vi khuẩn còn sống và tính tỷ lệ vi khuẩn sống sót