3.2.2.1. Phổ khối lượng (MS)
Các dẫn chất tổng hợp được ghi phổ khối lượng theo phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy LC-MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dữ liệu phổ đồ được ghi ở bảng 3.3.
Bảng 3.3:Kết quả phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất (4a-e) TT Ký hiệu R M (đ.v.c) m/z (MS) 1 4a 2-CH3 250,30 251,1 [M+H]+ 2 4b 3-CH3 250,30 249,0 [M-H]- 3 4c 3-OCH3 266,29 267,1 [M+H]+ 4 4d 2-F 254,26 255,1[M+H]+ 5 4e 3-F 254,26 253,1[M-H]-
Ghi chú: m/z là tỷ số khối lượng – điện tích.
3.2.2.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được ghi ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Số liệu phổ IR của các dẫn chất (4a-e)
TT Ký hiệu R Phổ IR (KBr), cm-1 NH (amid) CH (aromatic) C=O (amid) C=C (aromatic) 1 4a 2-CH3 3100 3022 1676 1612, 1453 2 4b 3-CH3 3150 3041 1682 1611, 1484 3 4c 3-OCH3 3331 3170 1662 1548, 1511 4 4d 2-F 3513 3379 1621 1585, 1484 5 4e 3-F 3147 3041 1677 1585, 1484
3.2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và 13C được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER, Đức) trong dung môi DMSO – d6 tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả phân tích số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon của 5 chất được ghi ở bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5:Số liệu phổ cộng hưởng từ nhân proton của các dẫn chất (4a-e)
TT Ký hiệu R 1H-NMR (500 MHz,DMSO), (ppm), J(Hz) 1 4a 2-CH3 12,30 (s,1H), 8,04 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,49 (m, 2H), 7,42 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,36-7,30 (m, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,37 (s, 3H). 2 4b 3-CH3 12,30 (s,1H), 8,02 (m, 2H), 7,96 (d, J = 7,5 Hz, 1H),7,54 (s, 1H), 7,43-7,38 (m, 2H), 7,33 (d, J = 8 Hz, 1H), 2,46 (s, 3H), 2,40 (s, 3H). 3 4c 3-OCH3 12,40 (s,1H), 8,03 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,44 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 2,46 (s, 3H) 4 4d 2-F 12,40 (s,1H), 8,05 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,78 (td, J = 7,5 Hz, J = 1,5 Hz, 1H), 7,65-7,60 (m, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,41- 7,36 (m, 3H), 2,48 (s, 3H). 5 4e 3-F 12,50 (s,1H), 8,05 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,99 (d, J = 10 Hz, 1H), 7,62-7,57 (m, 2H), 7,78 (dd, J = 7,5 Hz, J = 2,5 Hz, 1H), 7,37 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 2,51 (s, 3H).
Bảng 3.6:Số liệu phổ cộng hưởng từ nhân carbon của các dẫn chất (4a-e) TT Ký hiệu R 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ(ppm) 1 4a 2-CH3 161,6 (C4), 154,3(C2), 148,8(C9), 144,8(C7), 136,0(C2‘), 134,2(C3‘), 130,4(C1‘), 129,7(C4‘), 129,0(C5), 127,9(C6‘), 126,9(C6), 125,6(C5‘), 125,6(C8), 118,5(C10), 21,3(CH3-C7), 19,5(CH3-C2‘). 2 4b 3-CH3 162,0(C4), 152,3(C2), 148,8(C9), 144,9(C7), 137,8(C3‘), 132,6(C4‘), 131,8(C5), 128,4(C5‘), 128,1(C1‘), 127,8(C6), 127,0(C2‘), 125,6(C6‘), 124,7(C8), 118,5(C10), 21,3(CH3- C7), 20,9(CH3-C3‘). 3 4c 3-OCH3 162,0(C4), 159,3(C3‘), 151,9(C2), 148,7(C9), 145,0(C7), 134,0(C5‘), 129,6(C1‘), 127,9(C5), 127,1(C6), 125,6(C8), 120,0(C6‘), 118,5(C2‘), 117,5(C10), 112,4(C4‘), 55,3(OCH3- C3‘), 21,2(CH3-C7). 4 4d 2-F 161,3(C4), 159,5(C2‘), 149,9(C2), 148,7(C9), 145,1(C7), 132,8(C4‘), 130,9(C5), 128,4(C6‘), 127,1(C6), 125,6(C5‘), 124,6(C8), 122,3(C1‘), 118,6(C10), 116,1(C3‘), 21,3(CH3- C7). 5 4e 3-F 162,0(C3’), 161,9(C4), 151,0(C2), 148,5(C9), 145,1(C7), 135,0(C5’), 130,7(C1’), 128,3(C5), 127,2(C6), 125,7(C8), 123,8(C6’), 118,7(C10), 118,3(C4’), 114,5(C2’), 21,3(CH3- C7).
3.3. THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người được tiến hành tại Phòng Hóa Sinh ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tại phòng Hóa sinh ứng dụng (Viện Hóa học), 5 dẫn chất (4a-e) đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người theo phương pháp MTT. Các dòng tế bào ung thư được sử dụng là KB (Human epidemic carcinoma)- ung thư biểu mô, Hep-G2 (Hepatocelluar carcinoma)-ung thư gan, LU (Human lung carcinoma)- ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma)-ung thư vú. Ban đầu, cả 5 chất đều được thử tác dụng sinh học với dòng KB, sau đó, 2 chất (4c) và (4d) có hoạt tính được tiến hành thử tác dụng sinh học với 3 dòng tế bào Hep-G2, LU và MCF-7.
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 5 dẫn chất tổng hợp được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7:Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của (4a-e) T T Ký hiệu R Giá trị IC50 (μg/ml) KB Hep-G2 LU MCF-7 1 4a 2-CH3 >128 nt nt nt 2 4b 3-CH3 >128 nt nt nt 3 4c 3-OCH3 13,05 (49,01 mM) 13,88 (52,12 mM) 17,00 (63,84 mM) 23,72 (89,08 mM) 4 4d 2-F 21,50 (84,56 mM) 21,09 (82,95 mM) 30,00 (117,99 mM) >128 5 4e 3-F >128 nt nt nt 6 Ellipticin 0,31 (1,26 mM) 0,35 (1,42 mM) 0,45 (1,83 mM) 0,53 (2,15 mM)
Ghi chú: IC50 là nồng độ ức chế 50% sự sống của tế bào, KB là tế bào ung thư biểu mô, Hep-G2 là tế bào ung thư gan, LU là tế bào ung thư phổi, MCF-7 là tế bào ung thư vú, nt là not test
3.4. BÀN LUẬN
3.4.1. VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC
3.4.1.1. Tổng hợp chất trung gian 2-amino-4-methylbenzamid và khẳng định cấu trúc định cấu trúc
* Tổng hợp 2-amino-4-methylbenzamid
Chất (2) được tổng hợp theo sơ đồ 3.1.
Hợp chất (2) được tạo thành bằng cách thủy phân dẫn chất nitril tương ứng trong môi trường kiềm, dung môi EtOH.
Phản ứng diễn ra trong điều kiện dễ thực hiện, nhiệt độ không quá cao (90oC), hiệu suất phản ứng tốt (73%).
* Khẳng định cấu trúc
Sản phẩm thu được (2) được khẳng định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (bảng 3.8, phụ lục 21).
Bảng 3.8: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (2)
TT Chất
1H-NMR
(DMSO; (ppm), J(Hz))
1 2 7,26 (m, 1H), 6,49 (s, 1H), 6,47 (d, 1H,
J=8,0Hz), 2,26 (s, 3H).
Ghi chú: δ là độ dịch chuyển hóa học, J là hằng số tương tác.
Phổ đồ 1H-NMR của chất (2) cho thấy:
- Tín hiệu của proton vòng thơm xuất hiện ở vùng 6,47-7,26 ppm. - Tín hiệu của proton nhóm thế methyl xuất hiện ở vị trí 2,26 ppm. Phổ 1H-NMR của (2) phù hợp với dữ liệu tham khảo được [1], đồng thời cho thấy chất (2) đủ độ tinh khiết cần thiết để sử dụng cho các phản ứng tổng hợp tiếp theo.
3.4.1.2. Tổng hợp dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon (4a-e)
Trong đề tài này chúng tôi tiến hành tổng hợp dãy 2-aryl-4-quinazolinon theo phương pháp của Mann-Jen Hour, tiến hành ngưng tụ 2-amino-4- methylbenzamid (2) với các aldehyd thơm, đun nóng ở 150oC trong môi trường N,N-dimethylacetamid có mặt NaHSO3 (sơ đồ 3.2) sau đó tinh chế thu sản phẩm. Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm:
- Nguyên liệu và các hợp chất aldehyd thơm ban đầu sẵn có, đa dạng. - Điều kiện phản ứng tương đối dễ thực hiện, hiệu suất phản ứng cao.
- Quá trình tinh chế thu sản phẩm tinh khiết khá đơn giản, do hầu hết các chất đều kết tinh trong nước, chỉ cần lọc rửa bằng nước cất.
- Phản ứng diễn ra trong thời gian ngắn, ít chịu ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường.
Việc sử dụng phương pháp tổng hợp này đã khắc phục nhược điểm của các phương pháp trước, đó là phải sử dụng hợp chất benzoyl clorid kém bền, dễ bị thủy phân trong điều kiện nóng ẩm ở nước ta, phản ứng tạo acid vô cơ HCl gây hao mòn thiết bị thí nghiệm.
Về khả năng phản ứng, trong 5 phản ứng thực hiện, hiệu suất phản ứng tạo
(4a) và (4d) (54-55%) thấp hơn hẳn (4b), (4c) và (4e) (73-83%). Có thể giải thích điều này dựa trên cơ chế phản ứng giả định về sự đóng vòng tạo 2-aryl-4- quinazolinon (sơ đồ 3.3) [17].
Sơ đồ 3.3: Cơ chế phản ứng tạo 2-aryl-4-quinazolinon
Theo đó, phản ứng có thể gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: phản ứng ngưng tụ tạo imin giữa nhóm amin của chất (2) và nhóm carbonyl của aldehyd.
- Giai đoạn 2: đóng vòng hợp chất imin tạo vòng 6 cạnh.
- Giai đoạn 3: dưới tác dụng của NaHSO3 vòng 6 cạnh tạo vòng quinazolinon.
Như vậy, bản chất nhóm thế R của aldehyd là một yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng. Độ cồng kềnh của R có ảnh hưởng đến phản ứng cộng ái nhân ở cả
giai đoạn 1 và giai đoạn 2. R càng cồng kềnh thì khả năng tiếp cận của nhóm amin của chất 2 với nhóm carbonyl của aldehyd càng thấp, tiếp đó, nhóm amid cũng khó tấn công -CH imin để đóng vòng.
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành phản ứng giữa chất
(2) với một số aldehyd thơm có nhóm thế ở vị trí ortho như 2-nitrobenzaldehyd, 2,6-diclorobenzaldehyd. Kết quả cho thấy trên phổ đồ 1H-NMR của sản phẩm
(I) tạo thành giữa chất (2) với 2-nitrobenzaldehyd xuất hiện tín hiệu của nhóm imin. Như vậycó nghĩa là phản ứng đóng vòng không xảy ra như dự kiến. Chất I:
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) chất (I): xem phụ lục 22. Điều này giải thích cho các phản ứng giữa chất (2) với các benzaldehyd có nhóm thế ortho cho hiệu suất thấp hoặc không phản ứng.
3.4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 3.4.2.1. Phổ khối lượng (MS)
Kết quả thu được ở bảng 3.3 cho thấy: tùy theo chế độ đo nhưng trên phổ đồ của 5 chất đều xuất hiện pic ion có số khối bằng [M+H]+ hoặc [M-H]-. Pic ion của phân tử các hợp chất hữu cơ nói chung không phải là vạch riêng lẻ mà là một cụm pic vì các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn tại các đồng vị như 13C là đồng vị của 12C, 2H là đồng vị của 1H,… Bởi vậy bên cạnh các pic chính ứng với các pic ion phân tử còn xuất hiện các pic phụ.
Ví dụ sau đây phân tích cụm pic ion phân tử để xác định sự phù hợp giữa CTPT dự kiến và CTPT của chất (4c) tổng hợp được. Chất (4c) có CTPT dự kiến là C16H14N2O2 tương ứng với số khối là 266,29. Trên phổ đồ xuất hiện pic
[M+H]+ cường độ lớn nhất có số khối 267,10 (phụ lục 11). Như vậy sơ bộ cho thấy chất (4c) có số khối đúng như số khối dự kiến.
Phụ lục 11: Phổ MS của chất 4c
Qua kết quả thu được, có thể thấy 5 chất tổng hợp được đều xuất hiện pic phân tử có cường độ phân tử lớn, khối lượng phân tử phù hợp với khối lượng phân tử dự kiến.
3.4.2.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Qua nghiên cứu phổ đồ của các chất, thấy xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức và liên kết của các chất tổng hợp được. Kết quả biện giải phổ được trình bày ở bảng 3.4.
- Trên phổ đồ xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức NH (amid), CH (vòng thơm), C=O (amid) và C=C (vòng thơm), phù hợp với vùng hấp thụ tương ứng trên lý thuyết.
- Phổ đồ các chất đều xuất hiện dải hấp thụ tương ứng với dải hấp thụ của nhóm CH trong vòng thơm, nằm trong khoảng 3000-3400 cm-1.
- Nhóm C=O amid trong cả 5 chất đều có cường độ hấp thụ mạnh, dải hấp thụ của nhóm này nằm trong khoảng 1620-1680 cm-1.
- Hầu hết nhóm NH amid đều xuất hiện dải hấp thụ trên phổ đồ với tần số sóng 3300-3500 cm-1.
Dưới đây là hình ảnh minh họa phổ IR của chất (4c) (phụ lục 12)
Phụ lục 12: Phổ IR của chất 4c
Như vậy, thông qua số liệu phổ IR, có thể nhận thấy sự có mặt của các nhóm chức đặc trưng trong cấu trúc chất tổng hợp được, phù hợp với công thức dự kiến. Điều đó chứng tỏ phản ứng tổng hợp đã xảy ra.
3.4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của các proton của 5 chất tổng hợp được thông qua số liệu về độ dịch chuyển hóa học, độ bội, hằng số tương tác J và cường độ của các pic được trình bày ở bảng 3.5. Số tín hiệu proton xuất hiện trong phổ 1H-NMR sẽ thể hiện số nguyên tử hydro có mặt trong chất đo phổ. Dưới đây là một số nhận xét:
- Dữ liệu phổ 1H-NMR của cả 5 chất đều cho thấy số tín hiệu proton xuất hiện phù hợp với số nguyên tử hydro có mặt trong công thức hóa học dự kiến. - Tín hiệu của nhóm NH amid với cường độ yếu xuất hiện ở vùng 12,3- 12,5ppm.
- Nhóm 7-methyl có cường độ tín hiệu mạnh, xuất hiện ở vùng 2,37-2,51 ppm.
- Các proton gắn với carbon vòng thơm có tín hiệu dao động trong vùng 7,30-8,03 ppm.
-Nhóm methoxy gắn vào vòng aryl có cường độ mạnh, xuất hiện ở vùng 2,46-3,85 ppm.
Dưới đây là hình minh họa phổ 1H-NMR của chất (4c)
Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của chất 4c 3.4.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR).
Phổ 13C-NMR cho biết số carbon và độ dịch chuyển hóa học của các vị trí carbon trong công thức phân tử chất đem đo phổ. Kết quả đo phổ 13C-NMR của 5 chất tổng hợp được ghi lại trong bảng 3.6. Dưới đây là một số nhận xét:
- Số tín hiệu cộng hưởng xuất hiện trong phổ đồ phù hợp với số lượng carbon trong công thức cấu tạo dự kiến của chất tổng hợp được.
- Nguyên tử carbon ở nhóm C=O amid có tín hiệu cộng hưởng đặc trưng, khoảng 162 ppm.
- Nguyên tử C2 có tín hiệu phổ cộng hưởng trong vùng 152-160 ppm. - Nguyên tử carbon ở các nhóm CH3 có tín hiệu phổ cộng hưởng trong vùng 19,5-55,3 ppm.
Dưới đây là hình minh họa phổ 13C-NMR của chất (4c) (phụ lục 10).
Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR của chất 4c
Như vậy, thông qua các dữ liệu phổ MS, IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp là đúng như dự kiến.
3.4.3. VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ
5 chất (4a-e) được tiến hành thử hoạt tính trên dòng tế bào KB, 2 chất (4c)
Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 5 chất tổng hợp (4a-e) được ghi lại ở bảng 3.7.
Từ kết quả thử hoạt tính của 5 chất trên, cho thấy:
- Chất (4c) (nhóm thế 3-OCH3) có hoạt tính trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm.
- Chất (4d) (nhóm thế 2-F) có hoạt tính trên 3 dòng tế bào thử nghiệm (trừ MCF7).
- Các chất (4a), (4b) và (4e) không có hoạt tính kháng tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào thử nghiệm.
- Hoạt tính của (4d) (nhóm thế 2-F) tốt hơn (4e) (nhóm thế 3-F). Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trong Luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Huyền [1]: các chất có nhóm thế ở vị trí C2 của vòng 2-aryl có hoạt tính tốt hơn chất có nhóm thế ở vị trí C3 của vòng 2-aryl.
- Nhóm thế 3-OCH3 có thể giúp chất (4c) có hoạt tính sinh học tốt hơn các chất có nhóm thế ở vị trí C3 khác. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Mann-Jenn Hour năm 2000 [12].
- So sánh cấu trúc các chất (4a-e) với mô hình pharmacophore giả định của dẫn chất 3-arylisoquinolinon, có thể rút ra kết luận: khác với các hợp chất 3- arylisoquinolinon với nhóm thế methyl ở vị trí số 6 có hoạt tính khá tốt, nhóm thế 7-methyl ở nhân quinazolinon có thể không đóng góp vào hoạt tính gây độc tế bào của của các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon tổng hợp được. Có thể khi thay đổi nhân isoquinoline sang nhân quinazoline, độ tan của hợp chất thay đổi, kém hòa tan nên gây ra hoạt tính độc tế bào yếu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên, có thể rút ra một số kết luận như sau: 1. Đã tổng hợp được 5 dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon (4a-e). Trong đó, cả 5 chất đều là các chất mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được. Tất cả các chất tổng hợp được đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy. Cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được xác định bằng các phép đo phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,
13C-NMR), phổ khối lượng MS. Kết quả thu được cho phép kết luận các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến.
2. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 5 chất tổng hợp được trên 4 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư biểu mô KB, tế bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư phổi LU, tế bào ung thư vú MCF-7. Kết quả cho thấy chất (4c) có hoạt tính trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 = 13,05÷23,72 μg/mL, chất (4d) có hoạt tính trên 3 dòng tế bào KB, Hep-G2 và LU với giá trị IC50= 21,09÷30,00 μg/mL.
KIẾN NGHỊ
-Tiếp tục thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác nhau: đại tràng, dạ dày,buồng trứng, khối