III. NUÔICẤY THU NHẬN PECTINASE:
4. Thu nhận enzyme pectinase:
4.1. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bềmặt
Nguyên liệu Hấp tiệt trùng Làm nguội Phối trộn Canh trường Nuôi trong 24h Cấy Thu nhận
Cách tiến hành:
- Canh trường đựơc nghiền kỹ, sau đó tiến hành trích ly với dung dịch muối 0,3% có khuấy đều trong thời gian 30 phút.
Canh trường Khuấy Lọc Nghiền Lắng Trộn diatomic Dịch chiết enzyme Tủa Ly tâm Sấy Chế phẩm enzyme Cồn 900 Dung dịch muối 0,3% Bã 370C
- Tiến hành lọc thô qua giấy vải và lọc tinh bằng giấy lọc, ta thu đựơc dịch chiết enzyme.
- Tiếp theo mang dịch chiết enzyme đi kết tủa với cồn tinh 96o. Cồn tinh 96o được làm lạnh cho chảy từ từ vào dịch chiết enzyme, lượng cồn cho vào dịch chiết enzyme đến nồng độ cồn 70o thì dừng, trong quá trình kết tủa cồn luôn có khuấy đều
- Tủa được đem lắng trong 1h ở nhiệt độ 0oC-5oC
- Gạn bớt phần lớn dịch gồm nước và cồn đi, phần nhỏ dịch còn lại chứa toàn bộ lượng tủa được đem đi ly tâm trong 20 phút với tốc độ quay 6000 vòng/phút để thu nhận lượng tủa.
- Lượng tủa thu được trộn với diatomic theo tỷ lệ khối lượng tủa: diatomic bằng 3:2 rồi đem đi sấy khô ở 37oC trong khoảng 10h đến độ ẩm 10%, ta thu được chế phẩm enzyme dạng bột.
• Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30oC trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 240C và nuôi trong 48-52h. sản phẩm sau lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế.
Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối amonium sulfate
Dung môi hữu cơ được sử dụng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol (55-57%). Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-5oC, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt.
Muối amonium sulfate sử dụng có độ bão hòa 0,79%. Kết tủa bằng muối thì độ tinh khiết khoảng 75%.
Sau khi kết tủa, tiến hành ly tâm để tách kết tủa ra khỏi dung dịch.
Sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản
Việc thu nhận chế phẩm enzyme, ta phải chú ý đến thời điểm mà thu được enzyme có hoạt tính cao nhất. Tùy vào enzyme cần thu nhận mà ta chọn canh trường và thời gian thu nhận thích hợp sao cho enzyme thu được có hoạt tính cao nhất.
4.2. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề sâu
Để thu chế phẩm khô, ta cần tiến hành như sau: - Tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng
- Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8%
- Sấy khô trên thiết bị sấy phun
+ Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165- 180oC và đi ra đạt 60-70oC
+ Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây
+ Nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40oC
- Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm - Có thể thu chế phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỹ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1, hoặc với muối amonium sulfate (50-80% muối kết)
Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu.
Nếu kết tủa bằng muối amonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì kết tủa được đoạn có hoạt độ bão hòa 1 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao.
• Phương pháp yếm khí
Canh trường lỏng Tách
Cô đặc chân không Sấy khô Sợi nấm
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối (NH4)2)SO4
Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6,5-6,8. nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase pectintranseliminase; khi độ bão hòa bằng 0,9- 1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectitranseliminase và exopolygalacturonase